Name: Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando FACS com coloração de mitocôndrias vivas. Este método alcança 97% de pureza sem modificação genética.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia número de concessão [23390072].

Este estudo utilizou células iPS humanas obtidas comercialmente (cepa 253G1) (ver Tabela de Materiais).
1. Manutenção de células iPS humanas
<ol><li>Manter as células iPS humanas em condições livres de alimentador em meio AK02 em placas de cultura revestidas com 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>2. Diferenciação hepática de células iPS humanas em culturas 2D
NOTA: Consulte a Figura 1A para obter a programação diária da diferenciação hepática. Durante todo o processo, use placas de cultura de 6 poços e adicione 2 mL do meio de lavagem ou cultura designado a cada poço. Manter a condição de cultura celular a 100% de humidade, 5% de CO2 e 20% de O2 a 37 °C.
<ol><li>Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de matriz de membrana basal (diluída 1/25 em PBS (-)) e incube a 37 ° C por 1 h.</li>
	<li>Passe células iPS humanas para o prato revestido a uma densidade de 20.000-30.000 células/cm² usando meio AK02N suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632) (ver Tabela de Materiais). Substitua o meio sem Y-27632 no dia seguinte e cultive por mais 2 dias.</li>
	<li>Lave as células uma vez com o meio RPMI-1640. Inicie a diferenciação da endoderme substituindo o meio por RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% de insulina B27 + 1% de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina) suplementado com 3-6 μM de CHIR-99021 e 100 ng/mL de ativina A por 24 h (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Substitua o meio por RPMI-B27-Glu suplementado com 50 ng/mL de Activina A por 24 h.</li>
	<li>Para induzir a diferenciação do progenitor hepático, substitua o meio por RPMI-B27-Glu suplementado com dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% por 5 dias.</li>
	<li>Para promover a maturação dos hepatócitos, mude para o meio de maturação dos hepatócitos: meio L-15 de Leibovitz contendo 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato, 8,3% de caldo de fosfato de triptose, 100 nM de dexametasona (DEX), 50 μg/mL de sódio-L-ascorbato, 0,58% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 8,3% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina e 100 nM de N-hexanoico-try-ile-(6)-amino hexanoico amida (Dihexa) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Troque o meio a cada 2 dias por 20 dias. Classifique as células aproximadamente 27 dias após o início da diferenciação.</li>
</ol>3. Preparação celular para purificação de hepatócitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Lave as células hepáticas diferenciadas com 2 mL de PBS (-) por poço.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução enzimática por poço, que inclui 0,1% de colagenase, 0,083% de tripsina, 10 μM de inibidor de ROCK (Y-27632), 20 nM de ciclosporina A e 50 μg/mL de sódio-L-ascorbato em tampão Ads (116 mM de NaCl, 12,5 mM de NaH2PO4, 20 mM de HEPES, 5,4 mM de KCl, 5,6 mM de glicose e 0,8 mM de MgSO4; pH 7,35) (ver Tabela de Materiais). Separar as células das placas rodando horizontalmente a 37 °C durante cerca de 2 h.</li>
	<li>Depois de confirmar que as células estão destacadas e arredondadas ao microscópio, disperse-as em células individuais por pipetagem suave e colete-as em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para as peletizar. Remova o sobrenadante usando um aspirador.</li>
	<li>Corar as mitocôndrias das células dispersando-as em 5 mL de meio de maturação de hepatócitos contendo 100 nM TMRM (tetrametilrodamina, éster de metal) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min a 37 °C enquanto protege da luz envolvendo em folha de alumínio.</li>
	<li>Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para as peletizar. Remova o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda as células com 1-5 mL de tampão Ads frio contendo 2% de FBS.</li>
	<li>Conte o número de células usando uma solução de azul de tripano a 0,4% e uma placa de contagem de células.</li>
	<li>Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 4 °C para as pulverizar. Remova o sobrenadante.</li>
	<li>Dilua um anticorpo anti-ALCAM (anticorpo primário, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:50 no tampão Ads e adicione 100 μL do anticorpo diluído por 106 células. Manchar as células por 50 min no gelo. Prepare as células que não estão coradas com o anticorpo primário como controle negativo.</li>
	<li>Lave as células com tampão de anúncios frio contendo 2% de FBS duas vezes.</li>
	<li>Dilua um Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (anticorpo secundário, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:100 no tampão Ads e adicione 100 μL do anticorpo diluído por 106 células. Manchar as células por 30 min no gelo. Células coradas que não foram coradas com o anticorpo primário usando o anticorpo secundário.</li>
	<li>Lave as células com tampão de anúncios frio contendo 2% de FBS duas vezes.</li>
	<li>Ressuspenda as células no buffer Ads e filtre-as através de um filtro de células de tampa de encaixe (malha de 35 μm) antes de classificar por FACS para remover grandes aglomerados de células e detritos.</li>
</ol>4. Análises FACS e triagem de hepatócitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Configure a máquina FACS para classificação de células seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Use um tamanho de bico de 85 μm ou 100 μm e um filtro ND de 2.0 para hepatócitos. Use o canal FITC para detectar Alexa Flour 488 para ALCAM e o canal PE para detectar fluorescência TMRM para mitocôndrias.</li>
	<li>Ajuste as tensões FSC (dispersão direta) e SSC (dispersão lateral) para visualizar adequadamente a população de células.</li>
	<li>Ajuste as tensões dos canais fluorescentes FITC e PE. Comece com células não rotuladas e centralize a população de células na parte inferior de cada gráfico de canais. Certifique-se de que as células rotuladas estejam posicionadas adequadamente dentro do gráfico.</li>
	<li>Use uma estratégia de gating comum para eliminar os dupletos: Gate o principal FSC-A vs. SSC-A (Figura 2A), seguida por FSC-H vs. -W e, em seguida, SSC-H vs. -W (Figura 2B,C).</li>
	<li>Gate a população TMRMhi e ALCAM+ (P2 na Figura 2E) para classificar os hepatócitos. Gate a população TMRMhi e ALCAM- (P1 na Figura 2E) para classificar os não hepatócitos. Colete hepatócitos e não hepatócitos selecionados em tubos de coleta de 15 mL contendo meio de maturação de hepatócitos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de recolha contendo as células triadas a 200 x g durante 5 min a 18 °C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de maturação de hepatócitos.</li>
	<li>Semeie as células em fibroblastos embrionários de camundongo tratados com mitomicina C (MEFs) ou matriz de membrana basal semelhante a gel com meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 μM de Y-27632 e 20 nM de ciclosporina A. Cultive as células em uma incubadora de CO37 ° C 2 por 5 dias.</li>
</ol>5. Imunocitoquímica para detecção de hepatócitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Lave as células cultivadas por 5 dias após a triagem com PBS (-).</li>
	<li>Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células com tampão TBS-T (1x TBS com 1% Tween 20) duas vezes para remover o paraformaldeído.</li>
	<li>Incube as células com tampão TBS-T diluído Triton X-100 a 0,1% por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células com tampão TBS-T duas vezes para remover o Triton X-100.</li>
	<li>Adicione a solução de bloqueio disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) às células por 30 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione anticorpos primários contra albumina (marcador de hepatócitos) e antígeno nuclear humano (hNA, ver Tabela de Materiais), diluídos 1:50 em solução de bloqueio.</li>
	<li>Incubar as células a 4 °C durante a noite. Lave as células com tampão TBS-T duas vezes.</li>
	<li>Adicione anticorpos secundários: Alexa Fluor 488 IgG anti-coelho para burros e Alexa Fluor 546 IgG anti-rato para burros, diluídos 1:100 em solução de bloqueio (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incube as células em temperatura ambiente por 30 min. Lave as células com tampão TBS-T duas vezes.</li>
	<li>Avalie a pureza dos hepatócitos contando células positivas para albumina e hNA positivas sob um microscópio de fluorescência. Calcule a porcentagem de células positivas para albumina por célula positiva para hNA para as populações P1 e P2.</li>
</ol>

Purificação de hepatócitos humanos derivados de iPSC por classificação mitocondrial-ALCAM

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Devido às suas funções no metabolismo de nutrientes e na desintoxicação, os hepatócitos possuem um número relativamente grande de mitocôndrias em comparação com outros tipos de células15. O ALCAM é um membro da superfamília das imunoglobulinas e desempenha um papel na adesão e migração celular. É expressa em vários tipos celulares, incluindo células hepáticas, epiteliais, linfocíticas, mieloides, fibroblastas e neuronais16. Ao utilizar uma combinação do método baseado em mi...

Células-tronco embrionárias e pluripotentes induzidas (ES e iPS, respectivamente) são consideradas fontes celulares promissoras para terapias regenerativas. No entanto, a eficiência de diferenciar essas células em tipos específicos de células-alvo pode variar, mesmo quando se usa a mesma linhagem celular, protocolo e experimentador 1,2,3,4. Essa variabilidade pode ser atribuída à alta sensibilidade das células ES / iPS humanas ao seu ambiente. Portanto, atualmente é difícil obter consistentemente células-alvo puras. Para alcançar uma medicina regenerativa altamente segura, é crucial eliminar células proliferativas e células-tronco indiferenciadas em células terapêuticas, e a tecnologia avançada de purificação de células-alvo é essencial 5,6,7.
Um classificador de células é um dispositivo que analisa instantaneamente células individuais e classifica células vivas de interesse com base nas intensidades do sinal fluorescente, oferecendo uma solução promissora. Isso pode ser feito por meio da coloração de anticorpos de marcadores de superfície específicos do tipo de célula ou utilizando expressões gênicas repórter específicas do tipo de célula. Utilizando essa técnica, existem vários relatos de métodos para purificação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes 8,9,10 e hepatócitos11,12. Hattori et al. desenvolveram um método inovador de purificação mitocondrial usando um classificador de células13. Aproveitando o fato de que os cardiomiócitos têm altas demandas de energia por meio da atividade mitocondrial, a coloração das células com o corante indicativo de mitocôndrias vivas TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) pode ser usada para marcar e purificar cardiomiócitos por FACS de corpos embrióides derivados de células ES humanas contendo vários tipos de células. A ausência de tumorigenicidade foi confirmada por ensaios de formação de teratoma com os cardiomiócitos purificados. Além disso, Yamashita et al. descobriram inesperadamente um método para purificar hepatócitos de corpos embrióides derivados de células ES humanas, isolando frações com alta atividade mitocondrial e expressão positiva para ALCAM14. A justificativa para esse método é que os hepatócitos também têm um número relativamente alto de mitocôndrias devido ao seu alto consumo de ATP para metabolismo e desintoxicação de nutrientes15, e os hepatócitos expressam ALCAM, um membro da superfamília de imunoglobulinas, que desempenha um papel na adesão e migração celular16.
Métodos anteriores de alta purificação para hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes exigiam modificações genéticas, e os métodos de purificação não genéticos tinham baixa eficiência17. O método mitocondrial não genético tem mérito por alcançar alta pureza. Quando as células progenitoras hepáticas são necessárias, os métodos baseados em CD133 e CD13 ou Dlk118,19 podem ser escolhidos. Embora a precisão da tecnologia de edição do genoma tenha avançado, o risco potencial de alterações genômicas imprevistas (por exemplo, carcinogênese) não pode ser totalmente eliminado. Métodos baseados na atividade mitocondrial, sem envolver modificação genética, podem estar livres de tais riscos.
Como resultado do exame de vários indicadores mitocondriais em cardiomiócitos de ratos neonatais, observou-se que o TMRM desapareceu completamente em 24 horas, enquanto outros corantes permaneceram por pelo menos 5 dias13. Além disso, é importante notar que TMRM e JC-1 não afetaram a viabilidade celular quando avaliados com o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), enquanto outros corantes demonstraram efeitos variados na viabilidade celular13. TMRM demonstra maior segurança.
Até o momento, vários métodos de diferenciação bidimensional (2D) foram desenvolvidos como abordagens mais eficientes para induzir a diferenciação em comparação com a formação de corpos embrióides tridimensionais (3D). Isso ocorre porque compostos indutores de diferenciação ou citocinas podem ser administrados uniformemente às células em um plano 2D, em vez de em um espaço 3D. Neste estudo, o método20 relatado anteriormente foi modificado para induzir a diferenciação em hepatócitos derivados de células iPS humanas. Aqui, são descritos os detalhes dos procedimentos para a diferenciação e purificação 2D atualizada de hepatócitos derivados de células iPS humanas.

<table><tbody><tr><td>linha celular humana do iPS 253G1</td><td>Centro de pesquisa RIKEN BioResource</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído de 4%</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Solution, humano, recombinante</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nuclei Anticorpo, clone 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>Anticorpo contra antígeno nuclear humano</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sem soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cell sorter</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz de Membrana Poral Reduzida do Fator de Crescimento (TFG)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matriz de membrana basal semelhante a gel</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023</td><td>Inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H + L) anti-cabra anti-burro, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) altamente adsorvido de burro, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, com tampa de pressão de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Dipeptídeo L-Alanil-L-Glutamina</td></tr><tr><td>Humano/Camundongo/Rato/Canino ALCAM/CD166 Anticorpo R</td><td>& D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 silk</td><td>Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td> Solução <td>de bloqueio</td><td>de CTKN001</td></tr><tr><td>ITS-G Suplemento(&times; 100)</td> <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6) -amino Hexanoic amide (Dihexa)</td> <td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno Sorbitano Monolaurato (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbato de sódio</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Solução Trypan Blue</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRIPSINA 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Solução de caldo de fosfato de triptose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

As células-tronco embrionárias humanas (ES) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa baseada em células para o tratamento de órgãos gravemente doentes devido à sua proliferação ilimitada e propriedades pluripotentes. No entanto, diferenciar as células ES/iPS humanas em tipos de células-alvo 100% puras é um desafio devido à sua alta sensibilidade ao meio ambiente. A tumorigênese após o transplante é causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, tornando a tecnologia de alta purificação essencial para a realização segura da medicina regenerativa. Para mitigar o risco de tumorigênese, uma tecnologia de alta purificação foi desenvolvida para hepatócitos derivados de células iPS humanas. O método emprega FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) usando uma combinação de alto conteúdo mitocondrial e o marcador de superfície celular ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas) sem modificação genética. 97% ± 0,38% (n = 5) dos hepatócitos purificados usando este método exibiram expressão da proteína albumina. Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos detalhados para este método, aplicado ao método de diferenciação bidimensional mais atual para células iPS humanas em hepatócitos.

A linha do tempo dos processos que induzem as células iPS humanas a se diferenciarem em hepatócitos por meio de cultura 2D (Figura 1A) e características celulares representativas (Figura 1B) são mostradas. Aproximadamente no dia 12 de diferenciação, as células começaram a exibir formas celulares poligonais e núcleos redondos, característicos dos hepatócitos. Alguns hepatócitos também exibiram multinucleação.
A análise FACS foi realiza...

Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

O escopo de nossa pesquisa é purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, usando sem modificação genética. Nosso objetivo é abordar a questão do risco tumorigênico associado às células indiferenciadas, entre aquelas diferenciadas das células iPS humanas. Um dos desafios experimentais atuais é a baixa pureza celular, devido ao armazenamento mecânico da triagem.Estamos desenvolvendo um novo método de purificação, que utiliza as características exclusivas do metabolismo dos hepatócitos, para purificação em larga escala. Um método de classificação não celular para células progenitoras hepáticas não pode obter hepatócitos puros. Outro para hepatócitos maduros só pode tratar uma pequena fração de hepatócitos, devido à expressão limitada da proteína marcadora.Em contraste, nossa abordagem pode obter hepatócitos em diferentes níveis de maturação com maior eva. Os hepatócitos derivados de células iPS humanas são extremamente imaturos e apresentam macroexpressão de hepatócitos mais reduzida após a purificação. Nosso objetivo futuro é melhorar a modulação de hepatócitos usando tecnologia organoidal e avanços diários para medicina regenerativa e descoberta de medicamentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este estudo demonstra a reprogramação de células somáticas para pluripotência in vivo sem a geração de teratomas. Usamos injeção hidrodinâmica de DNA plasmidial na veia da cauda que codifica os fatores de Yamanka para induzir a reprogramação in vivo de hepatócitos adultos em células de pluripotência aumentada.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Aprenda a purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando FACS com coloração de mitocôndrias vivas. Este método alcança 97% de pureza sem modificação genética.

Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

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