Name: Modelo de Explante de Membro Posterior Murino para Estudo da Mecanobiologia do Impacto do Tendão de Aquiles (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Explore a mecanobiologia do impacto do tendão de Aquiles usando explantes de membro posterior murino. Este modelo experimental permite estudar padrões de tensão mecânica e mecanismos moleculares em condições controladas.

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Os autores agradecem o apoio e a assistência fornecidos por Jeff Fox e Vidya Venkatramani do Núcleo de Histologia, Bioquímica e Imagem Molecular (HBMI) do Centro de Pesquisa Musculoesquelética da Universidade de Rochester, financiado em parte pela P30AR06965. Além disso, os autores gostariam de agradecer ao Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) do University of Rochester Medical Center pelo auxílio com microscopia multifóton. O presente estudo foi financiado por R01 AR070765 e R01 AR070765-04S1, bem como 1R35GM147054 e 1R01AR082349.

Compreendendo o impacto do tendão - Modelo de explante murino para estudar mecanobiologia

Os autores não têm nada a revelar.

A plataforma experimental de explante de membro posterior murino pareada com o protocolo de cultura de tecidos descrito neste estudo fornece um modelo adequado para o estudo da mecanobiologia da formação de fibrocartilagem impulsionada pelo impacto na inserção do tendão de Aquiles. A utilidade deste modelo de explante é demonstrada pelos resultados representativos, que indicam manutenção da viabilidade celular concomitante com mudança significativa e espacialmente heterogênea na coloração com azul de toluidina após 7 dia...

Uma infinidade de tendões, incluindo o tendão de Aquiles e os tendões do manguito rotador, experimentam impacto ósseo devido ao posicionamento anatômico normal1,2,3,4. O impacto tendíneo gera deformação compressiva direcionada transversalmente ao eixo longitudinal das fibras5,6,7. Regiões de impacto tendíneo demonstram um fenótipo único de fibrocartilagem no qual células arredondadas e encolhidas (fibrocondrócitos) estão embutidas em uma rede de colágeno desorganizada com conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG) acentuadamente aumentado2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Estudos anteriores sugerem que o ambiente mecânico díspar produzido pelo impacto tendíneo sustenta essa matriz rica em GAG impulsionando a deposição de grandes proteoglicanos agregadores, mais notavelmente agrecan, embora os mecanismos subjacentes não sejam claros1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, o metabolismo aberrante de proteoglicanos associado à formação excessiva de fibrocartilagem é uma característica marcante da tendinopatia, uma doença comum e debilitante que surge desproporcionalmente em tendões cronicamente impactados1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Assim, o impacto tendíneo é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco que conduz várias das tendinopatias mais comuns, incluindo a doença do manguito rotador e a tendinopatia de Aquiles insercional (TIA)50,51,52. Atualmente, o tratamento da tendinopatia é ineficiente. Por exemplo, aproximadamente 47% dos pacientes com IAT necessitam de intervenção cirúrgica após falha no manejo conservador, com resultados pós-operatórios variáveis53,54,55,56. Apesar da aparente relação entre impacto e tendinopatia, os mecanismos mecanobiológicos pelos quais as células do tendão impactado sentem e respondem ao seu ambiente mecânico são pouco descritos, o que obscurece o entendimento da patogênese da tendinopatia e resulta em tratamento inadequado.
Modelos de explantes são ferramentas úteis no estudo da mecanobiologia tendínea57,58. Como primeiro passo para o entendimento da mecanobiologia do impacto tendíneo, vários estudos prévios exploraram a resposta celular após a aplicação de compressão uniaxial simples em células ou explantes tendinosos excisados27,29,30,31,32,33,34,39. Entretanto, as células in vitro carecem de matrizes extracelulares e pericelulares que facilitem a transferência de deformação, sequestrem importantes fatores de crescimento e citocinas liberadas por deformação mecânica e forneçam substrato para complexos de adesão focal que desempenham um papel na mecanotransdução57,59. Além disso, tanto os estudos in vitro quanto os excisantes excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação mecânica multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada5,6. No contexto da inserção do tendão de Aquiles impactado, isso inclui tecidos circunvizinhos, como a bursa retrocalcânea e o coxim gorduroso de Kager 60,61,62,63. Por outro lado, modelos in vivo de impacto tendíneo25,28,36,37,38,64,65,66 permitem controle mínimo sobre a magnitude e frequência da carga aplicada diretamente ao tendão, o que é uma limitação bem reconhecida dos modelos in vivo para o estudo da mecanobiologia tendínea57,58 67,68,69,70. Diante dos desafios na mensuração in vivo da deformação tendínea, o ambiente interno de deformação gerado nesses modelos é frequentemente pouco caracterizado.
Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma experimental personalizada que recria o impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo dentro de explantes de membros posteriores murinos inteiros que, quando pareados com este protocolo de cultura de tecidos, mantém a viabilidade por 7 dias em cultura de explantes e permite o estudo das sequelas biológicas do impacto tendíneo. A plataforma é construída sobre uma base de ácido polilático (PLA) impressa em 3D que fornece a base para a fixação das alças e inserção de redução de volume PLA impressa em 3D. As pegas são usadas para pinçar a perna e o joelho proximal à junção miotendínea de Aquiles com a face caudal do membro posterior voltada para cima, permitindo que o tendão de Aquiles seja visualizado de cima usando uma sonda de ultrassom ou microscópio invertido (Figura 1A). A inserção de redução de volume desliza ao longo de uma trilha na base e reduz o volume necessário de meios de cultura de tecidos. Uma linha trançada enrolada ao redor da pata traseira é roteada para fora da plataforma utilizando o design de base e um clipe PLA impresso em 3D. Ao puxar a corda, a pata traseira é dorsiflexionada e a inserção do tendão de Aquiles é impingida contra o calcâneo, resultando em elevada deformação compressiva transversa 5,6 (Figura 1A). A plataforma está contida dentro de um banho de acrílico que mantém os explantes do membro posterior submersos em meios de cultura de tecidos. A fixação da corda tensa na parte externa do banho com fita adesiva mantém a dorsiflexão do tornozelo para produzir impacto estático da inserção do tendão de Aquiles. Os arquivos CAD para componentes impressos em 3D são fornecidos em vários formatos (Arquivo Suplementar 1), permitindo a importação para uma variedade de softwares CAD comerciais e gratuitos de código aberto para modificação para atender às necessidades experimentais. Se o acesso a impressoras 3D não estiver disponível para fabricação, os arquivos CAD podem ser fornecidos aos serviços de impressão 3D on-line que imprimirão e enviarão as peças a baixo custo.
É importante ressaltar que o complexo músculo-tenculotendíneo tríceps sural abrange as articulações do joelho e tornozelo 71,72,73. Consequentemente, o estiramento tênsil no tendão de Aquiles é influenciado pela flexão do joelho. A extensão do joelho coloca o tendão de Aquiles sob tensão, enquanto a flexão do joelho reduz a tensão. Estendendo primeiro o joelho e, em seguida, dorsiflexando passivamente o tornozelo, as tensões compressivas na inserção impactada podem ser sobrepostas às tensões de tração. Por outro lado, ao dorsiflexar passivamente o tornozelo com o joelho flexionado, a tensão de tração é reduzida e a tensão compressiva permanece. O protocolo atual explora três dessas condições. 1) Para impacto estático, o pé é dorsiflexionado a < 110° em relação à tíbia para impactar a inserção, com o joelho fletido para reduzir a tensão. 2) Para o grupo tensão basal, o tornozelo é estendido acima de 145° de dorsiflexão com o joelho estendido, gerando tensão tracional predominante na inserção. 3) Para o grupo descarregado, os explantes são cultivados em placa de Petri com joelho e tornozelo em posição neutra na ausência de carga aplicada externamente. Os ângulos acima referidos são medidos fotograficamente em relação a um sistema de coordenadas onde o pé e a tíbia são paralelos num ângulo de 180° e perpendiculares num ângulo de 90°.
As principais etapas do protocolo incluem: 1) dissecção dos explantes dos membros posteriores e remoção cuidadosa da pele e do tendão plantar; 2) cultura de explantes após pré-tratamento com dexametasona 48 h; 3) corte tecidual e coloração histológica; e 4) análise de imagens coloridas para avaliar a formação de fibrocartilagem. Após a dissecção, cada explante de membro posterior é pré-tratado por 48 h em meios de cultura suplementados com dexametasona74. Os membros contralaterais de cada camundongo são alocados em grupos experimentais separados para comparação pareada, o que ajuda a controlar a variabilidade biológica. Após o pré-tratamento, os explantes são posicionados em plataformas como descrito acima e cultivados por mais 7 dias (Figura 1B). Comparações adicionais são feitas com um grupo pré-tratado (dia 0) no qual os explantes são removidos imediatamente após o pré-tratamento de 48 h.
Após a cultura do explante, os membros posteriores são aparados, fixados em formalina, descalcificados e incluídos em parafina. A secção seriada em orientação sagital proporciona a visualização do tendão de Aquiles desde a junção miotendínea até a inserção do calcâneo, permitindo que a profundidade da secção seja rastreada através de todo o tendão. A marcação dUTP X-nick mediada pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT) (TUNEL) é usada para visualizar danos ao DNA secundários à apoptose e avaliar a viabilidade. A histologia do azul de toluidina e a análise de imagens coloridas personalizadas são realizadas para quantificar as alterações na coloração GAG. Cortes de tecido corados com azul de toluidina são então usados para imagens de SHG para caracterizar alterações na organização das fibras de colagem (Figura 1B).
Os resultados representativos fornecidos sugerem coloração histológica alterada da matriz rica em GAG e desorganização da rede de colágeno extracelular gerada por 7 dias de impacto estático dentro do modelo. Este modelo pode ser utilizado para explorar mecanismos moleculares subjacentes à alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto.

<table><tbody><tr><td>Absorventes</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Para dissecação de bancada</td></tr><tr><td>Banho acrílico</td><td>Fonte Um</td><td>X001G46CB1</td><td>Contém a plataforma de explante submersa em meios de cultura</td></tr><tr><td>Contentor de autoclave</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-361-20</td><td>Utilizado como contenção secundária, contém duas plataformas</td></tr><tr><td>Base</td><td>-</td><td>-</td><td>impressa em 3D a partir de ficheiros CAD fornecidos como Ficheiros Suplementares</td></tr><tr><td>Linha trançada</td><td>KastKing</td><td>30lb teste</td><td>Usado para envolver a pata e aplicar dorsiflexão do tornozelo</td></tr><tr><td>Clipe</td> <td>-</td><td></td> <td>Impresso em 3D a partir de arquivos CAD fornecidos como arquivos suplementares</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-034</td><td>Retangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR</td><td>8312-4</td><td>Mídia de montagem à base de xileno para cobertura de lamínula Tecido manchado de azul de toluidina seções</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>MP Biomedical LLC</td><td>194561</td><td>CAS#50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO), anidro</td><td>Invitrogen por ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>CAS#67-68-5, use para solubilizar dexametasona em soluções de estoque concentradas</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Marca Scotch</td><td>34-8724-5195-9</td><td>Para fixar a lixa nas placas de aderência</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td> <td>Gibco da ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>alta glicose, (-) piruvato, (+) glutamina</td></tr><tr><td>EDTA sal tetrassódico di-hidratado</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J15700. A1</td><td>CAS#10378-23-1, usado para fazer solução de EDTA a 14% para descalcificação de amostras</td></tr><tr><td>Etanol, 200 provas</td><td>Thermo Scientific</td><td>T038181000</td><td>CAS#64-17-5, fornecimento de 1 L</td></tr><tr><td>Almofadas de biópsia de espuma</td><td>Leica</td><td>3801000</td><td>Usado com de processamento, ajuda a manter as articulações do tornozelo na posição desejada durante a fixação e descalcificação</td></tr><tr><td>Fórceps, #SS Padrão Inox</td><td>Dumont</td><td>11203-23</td><td>Reto, liso, fino </td></tr><tr><td>pontas Fórceps, Micro-Adson 4.75"</td><td>Fisherbrand</td><td>13-820-073</td><td>Pontas retas e finas com dentes serrilhados</td></tr><tr><td>Lixa de granada, grão 50-D</td><td>Norton</td><td>M600060 01518</td><td>Ou outra lixa de grão grosso</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial Fisher</td><td>Chemical</td><td>A38S-500</td><td>CAS#64-19-7, para ajustar o pH do tampão de acetato de sódio usado para histologia azul de toluidina, bem como solução de descalcificação de EDTA a 14%</td></tr><tr><td>Punhos</td><td>ADMET</td><td>GV-100NT-A4</td><td>Estão incluídas as garras, parafusos e molas de aço inoxidável descritos no protocolo</td></tr><tr><td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>16005-108</td><td>As secções sagitais dos explantes dos membros posteriores aderem de forma fiável a estas lâminas através de todos os protocolos de coloração</td></tr><tr><td>Kit de detecção de morte celular in situ, TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td>ensaio TUNEL</td></tr><tr><td>Fita de rotulagem</td><td>Fisherbrand</td><td>15-959</td><td>Ou qualquer outra fita de rotulagem de preferência</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td>CAS#50-81-7, para formulação de meios de cultura</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra, 10%</td><td>Leica</td><td>3800600</td><td>Para fixação de amostras, fornecimento de 5 galões</td></tr><tr><td>Placas de Petri Nunc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741-1CS</td><td>100 mm de diâmetro x 25 mm de altura, manter explantes submersos em 70 mL de meios de cultura conforme descrito no protocolo</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100X)</td><td>Gibco da ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Adicionar 5 mL a 500 mL 1X DMEM para concentração de trabalho a 1% v/v (1X)</td></tr><tr><td>Ácido polilático (PLA) 1,75 mm filamento</td><td>Hatchbox-Escolha</td><td></td> o <td>diâmetro do filamento compatível com a extrusora da sua impressora 3D, na cor de escolha.</td></tr><tr><td>de processamento</td><td>Leica</td><td>3802631</td><td>Para fixação, descalcificação e incorporação de parafina</td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento Prolong Gold com DAPI</td><td>Invitrogen da ThermoFisher</td><td>P36931</td><td>Mídia de montagem para cobertura de lamínulas de seções de tecido após TUNEL</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1700-50</td><td>CAS#39450-01-6, usado para recuperação de antígenos no protocolo TUNEL</td></tr><tr><td>Tesoura, Fino</td><td>FST</td><td>14094-11 Conjunto de</td> Coloração de Deslizamento <td>Reto e Afiado</td></tr><tr><td>, 12 lugares</td><td>Mercedes Scientific&nbsp;</td><td>MER 1011</td><td>Rack com 12 pratos de manchas e mergulhadores deslizantes para histologia azul de toluidina</td></tr><tr><td>Acetato de sódio, anidro</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A1318430</td><td>CAS#127-09-3, usado para fazer tampão para histologia azul de toluidina</td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo de baixo perfil Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td>Para seccionamento de parafina</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>348601000</td><td>CAS#92-31-9</td></tr><tr><td>Inserção de redução de volume</td> <td>-</td> impressa <td>em</td> <td>3D a partir de arquivos CAD fornecidos como arquivos suplementares</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td>suprimento de 4 galões para coloração histológica</td></tr></tbody></table>

modelo de explante de membro posterior murino para estudo da mecanobiologia do impacto do tendão de aquiles

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

O impacto tendíneo sobre o osso gera um ambiente de deformação mecânica multiaxial com tensão compressiva transversal acentuadamente elevada, que provoca um fenótipo de fibrocartilagem localizada caracterizado pelo acúmulo de matriz rica em glicosaminoglicanos (GAG) e remodelamento da rede de colágeno. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, a deposição excessiva de GAG e a desorganização da rede de colágeno são características marcantes da tendinopatia. Assim, o impacto é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco no início e progressão da tendinopatia. No entanto, a mecanobiologia subjacente ao impacto tendíneo permanece pouco estudada. Esforços anteriores para elucidar a resposta celular ao impacto tendíneo aplicaram compressão uniaxial às células e excisaram explantes tendinosos in vitro. No entanto, as células isoladas carecem de um ambiente extracelular tridimensional crucial para a mecanorresposta, e tanto os estudos de explantes in vitro quanto os excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada. Além disso, os modelos in vivo de impacto tendíneo carecem de controle sobre o ambiente de deformação mecânica. Para superar essas limitações, apresentamos um novo modelo de explante de membro posterior murino adequado para o estudo da mecanobiologia do impacto do tendão de Aquiles. Este modelo mantém o tendão de Aquiles in situ para preservar a anatomia local e reproduz o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo durante a dorsiflexão do tornozelo aplicada passivamente, retendo as células em seu ambiente nativo. Descrevemos um protocolo de cultura de tecidos integrado a este modelo e apresentamos dados que estabelecem a viabilidade sustentada do explante ao longo de 7 dias. Os resultados representativos demonstram aumento da coloração histológica de GAG e diminuição do alinhamento das fibras colágenas secundárias ao impacto, sugerindo elevada formação de fibrocartilagem. Este modelo pode ser facilmente adaptado para investigar diferentes regimes de carregamento mecânico e permite a manipulação de vias moleculares de interesse para identificar mecanismos mediadores de alterações fenotípicas no tendão de Aquiles em resposta ao impacto.

Imagens representativas de cortes de tecido corados com TUNEL demonstram núcleos apoptóticos mínimos dentro do corpo do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em todos os grupos experimentais (Figura 2A). A quantificação dessas imagens fornece evidências de que o protocolo de cultura de tecidos mantém até 78% de viabilidade em média dentro do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em condições de carregamento (Figura 2B).
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Apresentamos uma plataforma experimental personalizada e um protocolo de cultura de tecidos que recria a alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles em explantes murinos de membros posteriores com viabilidade celular sustentada, fornecendo um modelo adequado para explorar a mecanobiologia do impacto tendíneo.

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