Name: Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Aprenda a extrair a membrana da janela redonda de cobaia para estudos ex vivo de transporte de fármacos na orelha interna. Este método preserva a integridade tecidual e possibilita pesquisas direcionadas sobre estratégias de liberação de medicamentos para perda auditiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado em parte pelo NIDCD Grants No. 1K08DC020780 e 5T32DC000027-33, e pelo Rubenstein Hearing Research Fund.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (GP18M226). Cobaias albinas Hartley (machos e fêmeas, pesando 500-700 g) foram utilizadas no presente estudo.
1. Configuração e preparação do procedimento
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos com óxido de etileno antes de iniciar o experimento.</li>
	<li>Eutanásia dos animais seguindo protocolo aprovado institucionalmente. NOTA: No presente estudo, uma câmara sem pré-carga foi empregada para liberar 100% de dióxido de carbono (CO2) de um cilindro comercial. Um restritor em linha foi utilizado para regular o fluxo de gás, mantendo-o dentro da faixa de 30% a 70% do volume da câmara por minuto, de acordo com as Diretrizes AVMA 202011.</li>
	<li>Coloque o animal na câmara e distribua dióxido de carbono por 5 min. O fluxo de CO2 é mantido por 1 min após a parada respiratória.</li>
	<li>Realizar a decapitação após a parada respiratória para garantir a eutanásia.</li>
</ol>2. Abordagem cirúrgica e explante
<ol><li>Extrair o osso temporal do crânio da cobaia da maneirahabitual12. Retire o excesso de tecido mole com um rongeur. Identificar o meato acústico externo, a bolha temporal e o canalfacial13 (Figura 1).</li>
	<li>Perfurar os aspectos ventrais da bolha temporal com uma broca de diamante de 6 mm (ver Tabela de Materiais), expondo o espaço da orelha média e o conduto auditivo externo circunferencialmente.</li>
	<li>Com o uso de rongeurs, remova suavemente o conduto auditivo externo e o anel timpânico, separando simultaneamente a articulação incudomaleolar. Identificar bigorna, articulação incudostapedial, cóclea, canal semicircular horizontal e canalfacial13 (Figura 2A).</li>
	<li>Separe a articulação incudostapedial e remova a bigorna usando pinças. Identifique o nicho ósseo da janela redonda.</li>
	<li>Use uma broca de diamante de 6 mm para perfurar a lâmina óssea conectando a cóclea com a parede medial da cavidade timpânica em direção ao tensor do canal do tímpano. Descomprimir cuidadosamente o canal ósseo do tensor do tímpano e remover o músculo tensor do tímpano com uma agulha de 28 G. NOTA: A parede medial da fossa do tensor do tímpano conecta-se diretamente com o osso coclear ao redor do MMR, e toma-se cuidado para não causar fraturas que possam se estender até a janela redonda.</li>
	<li>Perfurar a lâmina óssea conectando a cóclea à parede inferior da cavidade timpânica até que reste 1 mm de borda óssea encostando a cóclea (Figura 2B).</li>
	<li>Usando um pedaço de diamante de 2 mm (ver Tabela de Materiais), faça uma cocleostomia no giro basal da cóclea, deixando aproximadamente 2 mm de osso para a janela redonda. Continuar a cocleostomia inferiormente em um plano paralelo à membrana da janela redonda para separar a base do ápice da cóclea.</li>
	<li>Estender a cocleostomia cortando a base do crânio, que é muito mais densa, resultando em uma visão transversal do giro basal da cóclea. OBS: O direcionamento da broca em direção ao meato acústico interno resulta em uma trajetória que maximiza a remoção óssea, evitando atravessar muito próximo da janela redonda.</li>
	<li>Examinar o espécime do lado da base do crânio e, se ainda não tiver sido feito, identificar o conduto auditivo interno e perfurar a abertura coclear. Remova o nervo coclear com uma agulha 28G.</li>
	<li>Examinar o espécime do lado intracoclear. Identificar e remover a lâmina espiral óssea na espira basal e o modíolo remanescente com pinça ou agulha 28G.</li>
	<li>Irrigar copiosamente a cavidade unificada da escala timpânica-escala vestibular para remover detritos. A janela redonda deve ser claramente visível a partir da cochectomia, sem debris sobrejacentes (Figura 2C).</li>
	<li>Em seguida, examine o espécime do lado da orelha média. Perfurar o canal semicircular lateral e o canal facial até o nível da janela oval. Remova suavemente o estribo com pinças, expondo o nicho da janela oval. Vale ressaltar que há uma ponte óssea entre as cruras do estribo conhecida como crista stapedis.</li>
	<li>Com uma broca diamantada de 1 mm (ver Tabela de Materiais), abra ainda mais o vestíbulo estendendo a janela oval ao longo da face da janela redonda, tomando o cuidado de manter 1-2 mm de osso coclear encostado ao nicho da janela redonda (Figura 2D).</li>
	<li>Completar os cortes do osso temporal conectando os cortes da janela oval com os cortes de cochlectomia de cada lado da janela redonda. OBS: Devido à fragilidade do osso coclear, preservar a fossa do tensor do tímpano no espécime e evitar cortes através dele ajudará a prevenir fraturas do osso coclear que se estendem até o MRP e comprometem sua integridade.</li>
	<li>Faça as fixações finais no osso denso da base do crânio adjacente ao conduto auditivo interno e raspe suavemente para baixo até resultar em um espécime RWM excisado (Figura 3A).</li>
</ol>

Explantação de membrana de janela redonda de porquinho-da-índia

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações a fazer.

Na administração local da droga para a orelha, a RWM é a principal via de passagem para a terapêutica chegar à orelha interna. Um modelo de bancada preciso e confiável é necessário para entender melhor os mecanismos de transporte e a permeabilidade em novos veículos de entrega e para o desenvolvimento de medicamentos. Neste estudo, demonstramos que o explante de RMP em cobaias é um procedimento viável e confiável para permitir investigações sistemáticas de interações fármaco-membrana. e Kelso et al., utilizando um modelo semelhante de permeabilidade RWM 2,16; no entanto, as etapas específicas da extração cirúrgica não foram detalhadas até o momento, e a fragilidade do osso coclear e a anatomia complexa representaram um desafio para a colheita consistente e em bloco de MMR intactos.
A cobaia RWM está localizada no final da escala timpânica da cóclea e é circundada por uma fina camada de osso coclear. A fratura dessa estrutura óssea durante o processo de explante pode resultar em um espécime inutilizável, pois a RMP tende a se desprender se o osso coclear circundante não permanecer intacto. Nosso grupo observou que as fraturas ocorriam mais frequentemente quando perfuradas perto da junção entre o osso da base do crânio altamente denso e a cóclea frágil, pois a transição na densidade óssea aumentava a probabilidade de propagação da fratura pela janela redonda. Por esta razão, sugere-se que a manutenção do osso mais denso da fossa tensorial do tímpano, que está aderido à cóclea em estreita proximidade com o PL, aumentará o rendimento da colheita do espécime, particularmente em animais mais velhos. A ruptura do osso também pode ocorrer durante a remoção do conteúdo coclear; Deve-se tomar cuidado para remover suavemente a lâmina espiral óssea com manipulação mínima do osso coclear circundante.
Um detalhe importante a ser considerado com este modelo é a viabilidade da RMP após o explante. Grupos anteriores sugeriram que o RWM de mamíferos permanece viável por 24-48 h após a extração17. O presente estudo refletiu esses achados; estudos de transporte consistentes e análises histológicas demonstrando estruturas celulares intactas (Figura 2A) têm apoiado a viabilidade da cobaia RWM no momento dos experimentos. Para manter a saúde geral do espécime extraído, o RWM é extraído e incorporado dentro de 3 h após a eutanásia.
No estudo da farmacocinética de fármacos através do RWM in vivo, ainda há considerável dificuldade técnica em fazer medidas de distribuição e concentração perilinfática1. Mudanças nos métodos de parto intra-timpânico e na quantidade aplicada resultaram em resultados terapêuticos variados. Essas dificuldades são agravadas pela complexa dinâmica dos fluidos dentro do labirinto, bem como pela saída irregular do material injetado através da tuba auditiva. O método de explante descrito permite o estudo isolado da MUR e dos fatores que afetam sua permeabilidade como modelo ex vivo . Além disso, o explante também permite a interrogação direta e a visualização de vários métodos atualmente empregados para aumentar a permeabilidade do MUR, como microbolhas ultrassônicas18 e modulação juncional quimicamente induzida19. Estudos futuros sobre mecanismos específicos de endocitose implicados na liberação de fármacos também se beneficiariam desse modelo de bancada.

Novas classes de terapêuticas têm surgido para o tratamento da perda auditiva neurossensorial. A tradução dessas terapêuticas para populações clínicas é limitada por vias seguras e eficazes de transporte para a orelha interna. Os métodos atuais de liberação in vivo em estudos com animais baseiam-se tanto na fenestração para a orelha interna quanto na difusão através da membrana da janela redonda (MRP), uma barreira não óssea que separa o espaço da orelha média da cóclea1.
A fenestração cirúrgica e a microinjeção na orelha interna são invasivas e podem representar riscos à função residual da orelha interna2. Portanto, a RWM é uma importante via para liberação local de fármacos, e as cobaias são o principal modelo animal pré-clínico utilizado para estudar a farmacocinética local de fármacos em toda a RWM e na orelha interna para o desenvolvimento farmacêutico 3,4. Embora mais fina que a RWM humana, a cobaia RWM compartilha uma estrutura idêntica de três camadas. Tem aproximadamente 1 mm de diâmetro, 15-25 μm de espessura e é composto por duas camadas de células epiteliais que formam uma camada de tecido conjuntivo5. A camada epitelial voltada para a orelha média é densamente compactada e conectada através de tight junctions, enquanto a camada voltada para a orelha interna e escala timpânica tem arquitetura mais frouxa e não tem aderências intercelulares significativas.
Os estudos pré-clínicos atuais que investigam a permeabilidade de drogas na cobaia RWM baseiam-se em injeções in vivo na orelha média seguidas da amostragem do fluido da perilinfa dentro da orelha interna, o que não permite o estudo específico do transporte da RMP 6,7. Fragmentos de explantes RWM têm sido usados em estudos pré-clínicos, mas devido à sua fragilidade e pequeno tamanho, eles não são adequados para investigações microfluídicas sistemáticas de transporte de drogas e veículos que requerem uma vedação estanque em todo o RWM2. Outros grupos empregaram modelos in vitro com cultura de células epiteliais humanas para aproximar o RWM 8,9,10. No entanto, a maioria desses construtos focaliza apenas a camada epitelial externa e não captura a complexidade da arquitetura do tecido nativo. Para uma compreensão mais detalhada dos mecanismos de transporte através do RWM, são necessários estudos ex vivo direcionados.
Neste estudo, demonstramos o explante de uma cobaia RWM com suporte ósseo circundante para preservar a integridade da membrana e ilustramos seu uso em um paradigma experimental desenhado para o estudo específico do transporte RWM de veículos de entrega de drogas.

<table><tbody><tr><td>Broca de Bola de Diamante de 1 mm</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>Broca de Bola de Diamante de 2 mm</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>Broca de Bola de Diamante de 6 mm</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>Qualquer sistema de perfuração de corte ósseo funcionará</td></tr><tr><td>Agulha BD Eclipse 27 G x 1/2 pol. com seringa BD Luer-Lok destacável de 1 mL</td><td>Becton, Dickinson e Co.&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>Qualquer agulha de 27-28 G</td></tr><tr><td>Gorilla Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

A liberação eficiente e minimamente invasiva de fármacos na orelha interna é um grande desafio. A membrana da janela redonda (MRP), sendo um dos poucos pontos de entrada para a orelha interna, tornou-se um foco vital de investigação. No entanto, devido às complexidades do isolamento do RWM, nossa compreensão de sua farmacocinética permanece limitada. O RWM compreende três camadas distintas: o epitélio externo, a camada média de tecido conjuntivo e a camada epitelial interna, cada uma potencialmente possuindo propriedades de liberação únicas.
Os modelos atuais para investigar o transporte através do RWM utilizam modelos animais in vivo ou modelos RWM ex vivo que dependem de culturas de células ou fragmentos de membrana. As cobaias servem como um modelo pré-clínico validado para a investigação da farmacocinética de drogas na orelha interna e são um modelo animal importante para o desenvolvimento translacional de veículos de entrega para a cóclea. Neste estudo, descrevemos uma abordagem para explante de uma cobaia RWM com osso coclear circundante para experimentos de liberação de fármacos em bancada. Este método permite a preservação da arquitetura RWM nativa e pode fornecer uma representação mais realista das barreiras ao transporte do que os modelos atuais de bancada.

Como demonstrado na Figura 3A, este método permite o explante da membrana da janela redonda intacta da cobaia com um anel de osso rígido circundante. A RMP deve estar totalmente conectada circunferencialmente ao anel ósseo. Nenhuma fratura do osso coclear deve ser apreciada. Em comparação com espécimes humanos de janela redonda, a cobaia RWM não tem uma pseudomembrana sobrejacente. Além disso, ao contrário dos seres humanos, existe uma ponte óssea entre as cruras do estribo da cobaia, que requer fratura e remoção antes da extração da superestrutura do estribo. A análise histológica (Figura 3B) do MRP representativo mostra uma estrutura epitelial clara de três camadas com um nicho de janela redonda adjacente intacto.
Do ponto de vista técnico, há duas etapas críticas. Primeiramente, ao fazer a cochectomia no passo 2.7, é importante usar o equador da broca, ao invés da ponta, para fazer o corte, pois o nervosismo na ponta da broca pode levar a fraturas traumáticas no osso coclear que podem se estender para a membrana da janela redonda. Em segundo lugar, é importante a perfuração completa do conduto auditivo interno, pois permite a remoção completa do nervo coclear e a dissecção mais fácil da lâmina espiral óssea, resultando em uma cavidade unificada na face intracoclear para amostragem experimental (Figura 2C).
Após a extração com sucesso do RWM, nosso grupo utilizou uma câmara de Ussing modificada para avaliar as propriedades farmacocinéticas da membrana. A câmara de Ussing modificada foi validada por outros grupos nas membranas timpânica e janela redonda, bem como no tecido da retina, para avaliar as propriedades de transporte das membranas epiteliais14,15. Este dispositivo impresso em 3D foi construído usando Poly-Jet Vero e consiste de duas peças de base triangulares, cada uma com uma câmara de fluido de 400 μL (Figura 3). A borda óssea do RWM é afixada à base usando epóxi de 2 partes (Gorila, ver Tabela de Materiais), seguido de selante de silício (ver Tabela de Materiais) para garantir uma vedação estanque (Figura 4). Cuidados meticulosos são tomados para evitar qualquer contato com epóxi ou selante com a membrana. Com o RWM ensanduichado no lugar, as duas bases são então coladas com epóxi. Durante os experimentos de transporte, o carregamento (voltado para a orelha média) é preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo o veículo de entrega (ou qualquer molécula de interesse), e a câmara de amostragem (voltada para a escala timpânica) é preenchida apenas com PBS. Em intervalos de tempo regulares, o fluido da câmara de amostragem é completamente aspirado e substituído por PBS fresco.
Medidas de controle de qualidade são tomadas durante cada experimento para garantir que haja uma vedação estanque ao redor do espécime dentro do aparelho, bem como uma membrana totalmente intacta sem microperfurações. Resultados representativos com uma solução de nanopartículas de núcleo de ferro marrom são mostrados abaixo. A verificação quantitativa de uma vedação estanque é realizada aspirando o volume total da câmara de amostragem durante cada intervalo de amostragem; o vazamento de líquido para fora da câmara de amostragem resultaria em menos do que o volume total de aspiração. Ao final de cada experimento, o volume de fluido na câmara de carregamento também deve permanecer o mesmo. Além disso, como nosso fluido alvo é de cor marrom, ele também é facilmente visível no caso de um vazamento.
Para garantir que não houvesse vazamento dentro da membrana, várias abordagens foram tomadas. Primeiro, os espécimes RWM usados neste estudo são todos imediatamente extraídos, e imagens de microscopia óptica, confocal e eletrônica confirmam estruturas celulares e de membrana intactas sem microperfurações (Figura 3A,B). Em segundo lugar, microperfurações foram deliberadamente criadas em um subconjunto de espécimes RWM para comparar o efeito na liberação de nanopartículas. A inspeção visual do aspirado da câmara de amostragem e de carregamento serve como confirmação adicional da integridade do espécime e da fixação estanque. Na RMP com perfurações, há um rápido equilíbrio da câmara de carregamento e amostragem, que pode ser observado através de uma mudança de cor distinta (Figura 1 Suplementar). Além disso, verificou-se que o transporte em MMR microperfurados foi maior do que a variância máxima observada em membranas íntegras (Figura 2 Suplementar). Juntos, eles servem como mecanismos de controle de qualidade para a integridade da vedação estanque ao redor do espécime, bem como do RWM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> Figura 1: Imagem pré-operatória do osso temporal da cobaia. A bula timpânica, o conduto auditivo externo e o conduto facial (*) são mostrados nesta imagem pré-operatória do osso temporal da cobaia. Barra de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> Figura 2: Imagens intraoperatórias. Imagens intraoperatórias demonstrando a relação entre a membrana da janela redonda e a bigorna (*), cóclea (**), estribo (†) e conduto auditivo interno descomprimido (‡). Áreas sombreadas indicam partes do espécime que serão removidas. (A) Cavidade da orelha média da cobaia após remoção da membrana timpânica e nervo facial (passo 2.3). (B) Cavidade da orelha média após descompressão do tensor do canal timpânico (passo 2.6). (C) Visão basal da RMP após a cocleostomia e remoção do conteúdo da orelha interna (passo 2.11). (D) Visão da RMP após retirada do estribo e identificação do vestíbulo (passo 2.13). Barra de escala = A,B (1 cm); C,D (5 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> Figura 3: Espécime RWM final e histologia. (A) Espécime grosseiro RWM de cobaia com anel ósseo. Barra de escala = 1 cm. (B) A histologia da membrana da janela redonda da cobaia explantada demonstra uma estrutura intacta de três camadas. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> Figura 4: Dispositivo microfluídico para experimentos de transporte transmembrana. (A) Diagrama do dispositivo microfluídico usado para experimentos de transporte transmembrana. (B,C) Dispositivo microfluídico impresso para os experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Conteúdo da câmara de carregamento e amostragem ao longo de um experimento de entrega de nanopartículas de núcleo de ferro e núcleo de 5 horas. (A) A câmara de carregamento de RWM intacto mostra uma diminuição gradual na intensidade de cor à medida que a concentração de nanopartículas diminui. (B) A câmara de amostragem de RWM intacta mostra coloração estável ao longo do tempo, consistente com baixos níveis de liberação de nanopartículas. (C) A câmara de carregamento do RWM perfurado demonstra uma rápida diminuição na intensidade da cor à medida que o conteúdo se equilibra com a câmara de amostragem. (D) A câmara de amostragem do RWM perfurado mostra um aumento gradual da cor ao longo do tempo, consistente com altos níveis de liberação de nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Resultados representativos do transporte para entrega de nanopartículas. Resultados representativos do transporte para a liberação de nanopartículas (núcleo de Fe3O4 com revestimento de polietilenoglicol, raio médio de 77 nm) através da cobaia RWM, intactas e com perfurações (média ± DP, n ≥ 3 experimentos RWM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve um método para o explante da membrana da janela redonda de ossos temporais de cobaias, fornecendo um recurso valioso para estudos ex vivo .

Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Nosso grupo está investigando medicamentos e veículos de entrega de medicamentos para o tratamento de doenças do ouvido interno, como a perda auditiva. A membrana da janela redonda é a barreira crítica que impede que drogas aplicadas localmente entrem na cóclea e atualmente estamos trabalhando para entender como os veículos de entrega de nanopartículas podem ser projetados para passar por essa barreira. Entender como a membrana da janela redonda funciona em termos de transporte de drogas é crucial no desenvolvimento de estratégias eficazes de liberação de drogas para o ouvido.A cobaia é um importante modelo animal pré-clínico para estudar a liberação de drogas na orelha. No entanto, isolar essa frágil membrana, que tem apenas 17 mícrons de espessura, para estudos de transporte de fármacos continua sendo um desafio significativo. Aqui, descrevemos um método para extração da membrana da janela redonda da cobaia que permite estudos eficientes de transporte de drogas em bancada.As investigações atuais da liberação de fármacos para o ano interno baseiam-se principalmente em modelos experimentais in vivo seguidos de amostragem de perilinfa que não permitem um estudo específico e direcionado dos mecanismos de transporte da membrana da janela redonda. Neste estudo, demonstramos a extração da membrana da janela redonda da cobaia com suporte ósseo circundante. Este método preserva a integridade da arquitetura do tecido nativo e permite estudos precisos e direcionados da liberação de fármacos através da membrana da janela redonda.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra como cirurgicamente obstruem o ducto endolinfático cobaia para produzir hydrops endolinfático.

Indução cirúrgica da hidropisia endolinfática por obliteração do ducto endolinfático

Neste vídeo, descrevemos uma técnica para isolar células epiteliais pigmentares da íris e da retina de olhos suínos para obter suas culturas primárias para estudos in vivo e ex vivo. Essas células pigmentares podem ser geneticamente modificadas para estudar abordagens regenerativas para tratar distúrbios oculares.

Isolamento de células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentadas de olho suíno isolado

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para extrair tecidos bronquiolares de um pulmão de porco colhido. O tecido bronquiolar ex vivo pode ser usado para desenvolver modelos de infecção para o estudo de infecções pulmonares crônicas.

Extração de tecido bronquiolar de porco: um procedimento para dissecar seções de tecido bronquiolar de pulmões suínos

Aqui nós apresentamos um protocolo para a indução de cryoinjury ventricular esquerdo, seguido da implantação de um patch do músculo cardíaco, derivado de células iPS humana cardiomyocytes em um modelo de cobaia.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Este artigo demonstra uma abordagem extradural para obliterar o saco endoglifático da cobaia e ferir o ducto endoglicêtico com uma picareta fina, a fim de induzir hidrops endolímfaticos experimentais.

Uma abordagem cirúrgica revisada para induzir hidrops endoglicêsticos na Cobaia

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

O implante sub-retiniano de epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina. No entanto, o desempenho de estudos pré-clínicos em modelos animais de olhos grandes permanece desafiador. Este relato apresenta diretrizes para o transplante sub-retiniano de EPR em um portador de células em miniporcos.

Implante sub-retiniano de EPR em portador de miniporcos: diretrizes para preparos pré-operatórios, técnicas cirúrgicas e cuidados pós-operatórios

A taxa de filtração glomerular (TFG) é o marcador ideal para avaliar a função renal. No entanto, o método de medição padrão usando injeção de inulina com análise seriada de sangue e urina é impraticável. Este artigo delineia um método prático para medir a TFG por via transdérmica em leitões.

Medição Transdérmica da Taxa de Filtração Glomerular em Leitões Ventilados Mecanicamente

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

Este estudo apresenta um método escalável, confiável e reprodutível para registros corticais crônicos repetidos em um modelo suíno. O método tem aplicações em vários campos da neurociência, incluindo pesquisa da dor e diagnóstico de doenças neurológicas.

Técnica de janela craniana crônica para registros corticais repetidos durante anestesia em suínos

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Aprenda a extrair a membrana da janela redonda de cobaia para estudos ex vivo de transporte de fármacos na orelha interna. Este método preserva a integridade tecidual e possibilita pesquisas direcionadas sobre estratégias de liberação de medicamentos para perda auditiva.

Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Explorar mais vídeos