Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV
10 de novembro de 2023
Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.
O objetivo geral deste ensaio é administrar uma abordagem multiplex para a detecção simultânea de vírus respiratórios comumente circulantes, como SARS-CoV-2, MERS, influenza A e influenza B. As tecnologias predominantes que impulsionam os avanços em nosso campo incluem CRISPR, ensaios amino de fluxo lateral, sensores biomoleculares baseados em papel, teste de Sherlock em um pote, aptâmeros de DNA e RT-qPCR multiplex integrado com amplificação isotérmica mediada por loop, LÂMPADA. No entanto, o RT-qPCR multiplex é o mais sensível, comum e é o padrão-ouro para diagnosticar vários vírus. O desafio experimental atual é estabelecer um protocolo que possa ser usado para detectar cópias de RNAs tão baixas quanto 10 cópias.
Usamos o kit interno de RT-qPCR para o ensaio, que é econômico e de tempo. Para começar, prepare o tampão 2x para RT-qPCR em água livre de DNAs/RNAs Armazene o tampão a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Em seguida, misture os primers e as sondas em um tubo de 1,5 mililitro.
Completar o volume com tampão de eluição e, em seguida, armazenar o tubo a menos 20 graus Celsius. Prepare uma mistura enzimática com taq polimerase e MMLV-RT em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Aumente o volume com tampão de armazenamento da taq polimerase.
Agora ressuspenda os RNAs sintéticos virais em tubos separados com 100 microlitros de tampão Tris-EDTA para fazer estoques de 10 a sextas cópias de RNA por microlitro. Para misturar os estoques de vírus, adicione cinco microlitros de SARS-CoV-2, influenza A e B a 50 microlitros de tampão Tris-EDTA. Da mesma forma, misture SARS-CoV-2 e MERS-CoV para obter uma segunda mistura viral.
Diluir ambas as misturas dez vezes para obter uma diluição final de 10 cópias de RNA por microlitro. Para cada poço de uma placa de 96 poços, pipete 2x tampão, primer, enzima, água livre de DNAs/RNAs e as misturas de RNA correspondentes. Sele a placa com um selo de placa adesiva.
Em seguida, centrifugue a placa por um minuto para coletar o líquido no fundo do poço. Em seguida, programe a máquina de PCR para aceitar o tipo de bloco rápido de 96 poços com o tipo experimental definido para a curva padrão. Defina os reagentes para reagentes TaqMan e selecione as propriedades de execução padrão.
Defina os alvos genéticos e o corante repórter. Em seguida, defina os nomes das amostras para cada reação a ser testada e atribua alvos e amostras ao layout da placa. Agora insira o programa de ciclo no instrumento.
Transfira a placa para a máquina QPCR em tempo real na orientação correta e pressione run para iniciar o ciclo. Escolha o local do arquivo para salvar os dados experimentais. Em seguida, examine os gráficos de amplificação fornecidos pelo programa QPCR.
Os dois kits desenvolvidos foram capazes de amplificar com sucesso todos os três genes-alvo simultaneamente, com apenas 10 cópias de RNA por reação. As eficiências de amplificação para todas as titulações virais foram superiores a 99%
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Visão Geral
Este estudo apresenta o desenvolvimento de dois kits baseados em sondas para RT-qPCR em um único passo, projetados para a detecção simultânea de vírus respiratórios comuns, incluindo SARS-CoV-2, MERS e várias cepas de Influenza. Esses kits ampliam as capacidades diagnósticas de laboratórios especializados por meio de uma abordagem economicamente viável e eficiente em termos de tempo.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Detecção de vírus respiratórios
- Técnica de RT-qPCR
- Desenvolvimento de ensaio multiplex
Contexto
- A necessidade de um diagnóstico rápido e sensível de vírus respiratórios.
- As limitações das tecnologias atuais de detecção.
- A importância de uma abordagem multiplex para detecção simultânea.
Métodos Utilizados
- Kits de RT-qPCR desenvolvidos internamente
- Detecção de RNA viral
- RT-qPCR multiplex combinada com sondas específicas
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de SARS-CoV-2 e MERS juntamente com Influenza A e B.
- Amplificação alcançada com quantidades tão baixas quanto 10 cópias de RNA por reação.
- Alta eficiência de amplificação demonstrada, acima de 99%, para os genes-alvo.
Conclusões
- Os kits de RT-qPCR desenvolvidos são eficazes para a detecção multiplex de vírus respiratórios.
- Este estudo contribui para estratégias diagnósticas melhores na pesquisa em virologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Ensaios multiplex de RT-qPCR em tempo real para SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV atendem à necessidade crítica de detecção rápida, sensível e específica de vírus respiratórios em circulação conjunta na pesquisa básica e translacional. Esses ensaios permitem diferenciar com alta confiança os alvos virais, apoiando a validação robusta de alvos e reduzindo ambiguidades no desenvolvimento precoce de diagnósticos. Sua integração aumenta a confiança preditiva e a eficiência operacional em portfólios de P&D voltados a ameaças de doenças infecciosas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação precisa de alvos virais para validação funcional em modelos de doenças respiratórias.
- Apoia a redução de riscos biológicos ao distinguir patógenos virais estreitamente relacionados em amostras complexas.
- Facilita a confiança preditiva na seleção e triagem de alvos para programas diagnósticos e terapêuticos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas de ensaio multiplex validados para triagem subsequente de compostos antivirais ou diagnósticos.
- Fornece saídas padronizadas, reprodutíveis e quantitativas para comparação e otimização de ensaios.
- Permite a preparação para triagem escalonável e de alto rendimento para avaliação rápida de intervenções candidatas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a detecção simultânea de múltiplos vírus respiratórios.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, fornecendo detecção viral robusta e quantitativa.
- Reduz o risco no avanço de candidatos ao assegurar a identificação precisa de patógenos em sistemas relevantes para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Ensaios de RT-qPCR multiplex se enquadram na continuidade entre descoberta e pré-clínico, apoiando testes iniciais de hipóteses, desenvolvimento de ensaios e pesquisas translacionais para portfólios de doenças infecciosas.
- Biologia da Descoberta: Fornece detecção de alta sensibilidade para validação de alvos virais orientada por hipóteses.
- Triagem: Oferece resultados quantitativos reprodutíveis para padronização de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados robustos de amplificação e métricas de especificidade para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Permite o alinhamento de biomarcadores e a continuidade entre as fases da pesquisa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e adaptável para detecção multiplex de vírus em diversos ambientes de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na detecção viral.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho diagnósticos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir a diferenciação precoce e precisa de patógenos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para doenças infecciosas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em virologia molecular e no design de ensaios de PCR quantitativa.
- Necessita de acesso a instrumentação de PCR em tempo real e infraestrutura de software analítico.
- Exige padronização entre equipes para configuração do ensaio, interpretação de dados e controle de qualidade.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de amostras ou variantes virais emergentes.
- O desempenho depende da especificidade dos iniciadores/sondas e da qualidade do RNA, conforme apoiado pela fonte.
