Cristalização ABCG5/G8 em Ambiente Bitela Lipídica para Cristalografia de Raios-X
25 de agosto de 2023
Este protocolo descreve um setup para a cristalização do transportador de esterol ABCG5/G8. ABCG5/G8 é reconstituído em bicelas para cristalização em gota suspensa. O protocolo não requer materiais ou substratos especializados, tornando-o acessível e de fácil adaptação em qualquer laboratório para determinação da estrutura da proteína através da cristalografia de raios X.
Olá, minha equipe estuda o tipo de perda de proteína através da membrana celular, e estamos olhando para a relação com a medicina e a biologia. Especificamente, estamos olhando para uma proteína em particular que exigiria ATP para conduzir sua função, e então, o nome é chamado ATP transportador de de ligação. Em particular, estamos olhando para sua relação de função de estrutura fundamental e, em seguida, usar isso para entender muitas doenças crônicas, especialmente doenças cardiovasculares.
Devido à complexidade da purificação das proteínas de membrana e sua estabilidade em temperaturas nativas, a obtenção de cristais de proteína 3D é o principal desafio no campo, além de limitar as aplicações na descoberta de fármacos. Nossa equipe estabeleceu métodos em crio-EM e cristalografia de Raios-X para estudos estruturais de proteínas transportadoras de membrana. E anteriormente nosso laboratório também resolveu a estrutura cristalina do primeiro heterodímero obrigatório ABCG5/G8 humano, tanto em estados apo quanto ligados ao colesterol.
Nossos resultados podem fornecer um avanço na descoberta de pequenas moléculas ou reaproveitamento de fármacos. A obtenção de cristais de proteína 3D também pode permitir experimentos de imersão para a cocristalização de complexos proteicos e ligantes. Nosso laboratório tem como objetivo determinar as bases moleculares do reconhecimento e translocação lipídica por proteínas transportadoras de lipídios dependentes de ATP.
E também pretendemos estabelecer novos métodos no desenvolvimento de fármacos para o estudo da dinâmica molecular e aspectos estruturais de transportadores ABC.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para cristalização do transportador de esteróis ABCG5/G8, utilizando bicamadas lipídicas (bicelles) para cristalização em gota suspensa. A abordagem foi projetada para ser simples e adaptável a diversos ambientes laboratoriais, facilitando a determinação da estrutura proteica por cristalografia de raios X.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Estrutural
- Proteínas de Transporte de Membrana
Contexto
- ABCG5/G8 é um transportador da superfamília de caixa de ligação de ATP envolvido no transporte de lipídios.
- Compreender sua estrutura é essencial para obter informações sobre doenças crônicas, particularmente condições cardiovasculares.
- Os desafios na purificação de proteínas de membrana dificultam os esforços de descoberta de fármacos.
- Estudos anteriores elucidaram a estrutura cristalina de ABCG5/G8 em diversos estados.
Objetivo do Estudo
- Investigar a base estrutural do reconhecimento e da translocação de lipídios por transportadores ABC.
- Desenvolver novas metodologias para descoberta de fármacos relacionadas a proteínas de transporte de membrana.
- Permitir experimentos de cocristalização para estudar interações proteína-ligante.
Métodos Utilizados
- Modificação química de frações proteicas por metilação redutiva.
- Uso de colunas de NTA-níquel para purificação de proteínas.
- Preparação de solução estoque de linfócitos B para cristalização.
- Método de difusão de vapor em gota suspensa para montagem da cristalização.
Resultados Principais
- Observou-se cristalização bem-sucedida de ABCG5/G8 dentro de uma a duas semanas.
- Cristais adequados para coleta de dados mediam tipicamente 50 mícrons por 100 mícrons por 2 mícrons.
- A metodologia permite estudos adicionais sobre interações com lipídios e desenvolvimento de fármacos.
- Os resultados contribuem para a compreensão da relação estrutura-função dos transportadores ABC.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar a estrutura de ABCG5/G8.
- Os achados podem facilitar avanços na descoberta de fármacos para doenças relacionadas.
- Trabalhos futuros focarão na exploração da dinâmica dos mecanismos de transporte de lipídios.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A elucidação estrutural de alta resolução da ABCG5/G8 em um ambiente de bicamada lipídica resolve um gargalo crítico na descoberta de fármacos para proteínas de membrana. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e apoia a redução de riscos mecanicistas em portfólios focados em transportadores. A cristalização confiável de transportadores ABC permite o design de ligantes orientado por estrutura e acelera decisões de triagem em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de transporte de lipídios dependentes de ATP em resolução atômica.
- Apóia a validação funcional de alvos ao preservar a conformação nativa da proteína em ambientes de bicelas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para alvos transportadores implicados em doenças crônicas.
- Fornece modelos estruturais para triagem de portfólio orientada por hipóteses.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece cristais de proteína validados adequados para estudos de imersão com ligantes e co-cristalização.
- Padroniza o preparo de proteínas de membrana para fluxos de trabalho reprodutíveis de triagem.
- Permite a avaliação quantitativa de interações proteína-ligante por meio de cristalografia de raios X.
- Apoia o desenvolvimento escalonável de ensaios para bibliotecas de compostos direcionados a transportadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha informações estruturais com a função de transportadores relevantes para doenças na pesquisa cardiovascular.
- Oferece continuidade da descoberta molecular à validação pré-clínica de moduladores de transportadores.
- Reduz o risco de translação ao orientar estudos de biomarcadores e mecanismos.
- Permite o design racional de modelos pré-clínicos com base em relações estrutura-função de transportadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de cristalização baseado em bicamadas integra-se ao processo de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias para a função de transportadores ABC.
- Triagem: Fornece cristais de alta qualidade e reproduzíveis para triagem baseada em estrutura e avaliação de ligantes.
- Análises: Permite leituras estruturais quantitativas para comparar estados ligados a ligantes e estados apo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a estrutura molecular à atividade de transportadores relevantes para doenças e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para cristalização de diversas proteínas de membrana em pipelines de descoberta de fármacos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos transportadores.
- Valor Operacional: Padroniza a cristalização de proteínas de membrana para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e melhora a eficiência do capital em programas focados em transportadores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos transportadores e o avanço de ativos guiados por estrutura.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de purificação e cristalização de proteínas de membrana.
- Exige acesso a infraestrutura analítica para difração de raios X e caracterização de proteínas.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de preparação de bicelas e cristalização.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes famílias de transportadores ou composições lipídicas.
- A estabilidade e o rendimento da proteína podem limitar a produtividade e a escalabilidade em alguns sistemas.
