Name: Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Aprenda a gerar itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas via superexpressão de Scleraxis e tensão uniaxial em bioreator 2D. Este método avança a engenharia de tecidos tendíneos.

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Este estudo foi parcialmente apoiado pelo NIH/NIAMS K01AR071512 e CIRM DISC0-14350 para Dmitriy Sheyn. Os dois plasmídeos de embalagem de lentivírus foram um presente do laboratório Simon Knott (Departamento de Ciências Biomédicas, Cedars-Sinai Medical Center).

Aproveitando iTenócitos Derivados de iPSC para Terapia Eficaz Baseada em Células

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<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiate+into+functional+mesenchymal+stem+cells+and+repair+bone+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).</li>
<li>Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenogenic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+dictated+by+properties+of+braided+submicron+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).</li>
<li>Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tendon-specific+markers+in+various+human+tissues%2C+tenocytes+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells.</a> Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).</li>
<li>Shukunami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleraxis+is+a+transcriptional+activator+that+regulates+the+expression+of+Tenomodulin%2C+a+marker+of+mature+tenocytes+and+ligamentocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).</li>
<li>Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+tendon+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of tendon cell fate during development.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).</li>
<li>Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tppp3%28%2B%29Pdgfra%28%2B%29+tendon+stem+cell+population+contributes+to+regeneration+and+reveals+a+shared+role+for+PDGF+signalling+in+regeneration+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis.</a> Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).</li>
<li>Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+and+ligament+regeneration+and+repair%3A+clinical+relevance+and+developmental+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+loading+models+for+tendon+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro loading models for tendon mechanobiology.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).</li>
<li>Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cellular+strain+models+of+tendon+biology+and+tenogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).</li>
<li>Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+the+effects+of+the+hierarchical+structure+of+tendon+fascicles+on+micromechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%22%5BJournal%5D)">An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).</li>
<li>Tatullo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influence+of+tissue+culture+plates+and+extracellular+matrix+on+mesenchymal+stem+cell+behavior%3A+A+topical+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Immunopathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).</li>
<li>Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+behavior+using+biophysical+and+biochemical+cues%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).</li>
<li>Papalamprou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+iPSC+differentiation+into+iTenocytes+using+combined+scleraxis+overexpression+and+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).</li>
<li>Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+tendon+reporters%2C+ScxGFP+and+ScxAP%2C+using+regulatory+elements+of+the+scleraxis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-based+product+characterization+for+clinical+trials%3A+an+FDA+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).</li>
<li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal%2Fstem+cells%3A+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+%28IFATS%29+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+%28ISCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li>
<li>Dunkman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tendon+injury+response+is+influenced+by+decorin+and+biglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+transcription+factors+in+tendon+development+and+differentiation%3A+their+potential+for+tendon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).</li>
<li>Bloor, A. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+safety+and+efficacy+of+iPSC-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+acute+steroid-resistant+graft+versus+host+disease%3A+a+phase+I%2C+multicenter%2C+open-label%2C+dose-escalation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).</li>
<li>McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compatible+and+xeno-free+cultivation+of+mesenchymal+progenitors+derived+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).</li>
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<li>Kataoka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neo-genesis+of+tendon%2Fligament-like+tissue+by+combination+of+mohawk+and+a+three-dimensional+cyclic+mechanical+stretch+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).</li>
</ol>

Todos os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Neste protocolo, os iTenócitos são gerados através de três etapas principais: (1) indução de iPSCs para iMSCs, (2) superexpressão de SCX usando um vetor lentiviral e (3) maturação das células através de tensão uniaxial 2D.
O protocolo apresentado para diferenciar iPSCs em iMSCs foi previamente descrito por nosso grupo2. Desde essa publicação, vários protocolos foram desenvolvidos, incluindo um protocolo estabelecido para o uso de iMSCs em ensaios clínicos 21,22,23, bem como kits de diferenciação disponíveis comercialmente. Uma revisão do potencial de trilinhagem das iMSCs também foi investigada anteriormente2. Embora as metodologias difiram, todos os protocolos enfatizam a necessidade de expansão pós-diferenciação das iMSCs por várias passagens para garantir a expressão estável dos marcadores de superfície das CTM. Nesta fase, o uso de uma razão de divisão de 1:3 em aproximadamente 70% de confluência resultará em uma placa relativamente confluente dentro de 4-6 dias após a passagem.
Ao selecionar o título ideal para transdução, é crucial encontrar um equilíbrio entre a viabilidade e a eficiência da célula. Embora as iMSCs transduzidas com o título de 100% possam mostrar o nível mais alto de células SCX-GFP positivas, é importante notar que essas células deixaram de se dividir três passagens após a transdução (Figura 3C), possivelmente devido à toxicidade induzida pelo DNA. Portanto, é aconselhável usar um título inferior a 100%. Antes de semear as placas de silicone, recomenda-se reavaliar os níveis de SCX-GFP por citometria de fluxo. Se os dados indicarem que a eficiência está abaixo do limite desejado, é aconselhável classificar as células iMSCSCX+ antes da semeadura, especialmente para aplicações in vivo .
Uma vez que as células iMSCSCX+ tenham sido semeadas nas placas de silicone, elas devem ser incubadas a 37 °C durante a noite para permitir a fixação celular antes do alongamento. A densidade celular descrita de 1,25 x 104 células/cm2 nas placas de silicone foi otimizada para evitar o crescimento excessivo de monocamadas, o que pode contribuir para a tensão estática24. Além disso, estudos sugerem que o contato direto célula-célula em culturas confluentes em substratos de rigidez variável pode alterar o comportamento celular 24,25,26. Durante os experimentos piloto, observou-se algum descolamento visível das células das placas de silicone, principalmente em momentos posteriores (Figura 4D). Isso pode ser atribuído à formação de folhas celulares de MEC devido à superconfluência24. Portanto, os parâmetros críticos incluem a densidade celular e o número de crises de estiramento. Nos métodos atuais, as células foram coletadas aos dias 3 e 7 para a avaliação do potencial tenogênico via análise de expressão gênica. No entanto, recomenda-se que as células sejam esticadas no biorreator 2D por pelo menos três dias, com posterior monitoramento de placas esticadas e estáticas para evitar crescimento excessivo e desprendimento celular.
Após várias crises de alongamento, observa-se um grau de alinhamento e organização celular (Figura 4C1,E). Isso se alinha a muitos estudos em que o alinhamento celular perpendicular ao eixo de deformação é observado em resposta à deformação uniaxial in vitro24,27. Em comparação, a placa estática apresenta a organização celular estocástica (Figura 4C2,E).
Até onde sabemos, poucos estudos exploraram os efeitos sinérgicos da superexpressão da SCX e da estimulação mecânica para a diferenciação das CTMs em tenócitos ou ligamentócitos 24,28,29. empregaram um sistema de biorreator 2D semelhante ao aqui descrito, mas aplicaram níveis mais elevados de deformação total (10% a 1 Hz por 12 h/dia). Curiosamente, eles foram incapazes de detectar alterações na expressão de SCX, TNMD e COL1a1 em CTMs-BM e tenócitos humanos. No entanto, isso pode ser atribuído às maiores cepas aplicadas em seu estudo24. utilizaram um vetor lentiviral para superexpressar a SCX em CTMs-hESC montadas em folhas multicamadas. Aplicaram carga cíclica uniaxial (10% de deformação a 1 Hz por 2 h/dia por até 21 dias) e observaram upregulation de COL1a1, COL1a2, COL14 e TNMD, bem como aumento da deposição de MEC29. transfectaram transitoriamente células C3H10T1/2 com cDNA murino de Scx e cultivaram as células em hidrogéis de colágeno 3D sob cepa cíclica uniaxial (1%, 1 Hz, 30 min/dia por até 14 dias). Semelhante aos nossos achados, seu grupo observou expressão elevada de SCX e COL1A1 nos construtos tenso e superexpresso, mas não encontrou alteração na expressão de TNMD em resposta ao alongamento cíclico28.
Além disso, pode ser intrigante considerar a superexpressão de outros marcadores relacionados ao tendão, como MKX. exploraram o efeito combinado de superexpressar MKX em células C3H10T1/2 e submetê-las a estiramento mecânico cíclico em um sistema 3D. Eles demonstraram um aumento significativo da SCX, COL1a1, DCN e COL3a1, juntamente com o alinhamento dos feixes de fibrilas de colágeno e filamentos de actina30.
É importante reconhecer que este método de geração de iTenócitos tem suas limitações. Embora o biorreator 2D disponível comercialmente seja vantajoso para o trabalho de prova de conceito, seu tamanho restringe o rendimento. Se essas células forem necessárias para ensaios de alto rendimento ou como uma potencial fonte de células de prateleira para terapias de reparo tendíneo, a exploração de sistemas capazes de implementar o alongamento uniaxial em maior escala deve ser considerada. Além disso, novas investigações devem abranger a expansão dos iTenócitos para confirmar a expressão tenogênica estável, e avaliar sua contribuição para a regeneração in vivo é crucial para avaliar seu potencial tenogênico.

Para resolver as questões contemporâneas no reparo de tendões e ligamentos, há um requisito para um candidato celular pertinente adequado para terapias baseadas em células. Uma via de investigação em engenharia tecidual para reparo tendíneo envolve a exploração de células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (CTMs-MO) e células estromais derivadas do tecido adiposo (CTAs) como estratégias potenciais. Essas células têm capacidade multipotente, grande abundância e potencial regenerativo in vivo. Além disso, demonstraram maior capacidade de cicatrização e melhora dos resultados funcionais em modelos animais1. No entanto, essas células exibem capacidades restritas de auto-renovação, diversidade fenotípica e, notadamente, capacidade limitada de formação de tendões. A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) oferece uma solução para essas restrições devido à sua notável capacidade de auto-renovação e adaptabilidade de desenvolvimento incomparável. Nossa equipe de pesquisa e outros conseguiram diferenciar com sucesso as iPSCs em entidades mesenquimais estromais semelhantes a células (iMSCs)2,3. Como tal, as iMSCs têm o potencial de ser uma fonte alogênica para aplicações de terapia com células tendíneas.
A escleraxis (SCX) é um fator de transcrição essencial para o desenvolvimento tendíneo e é considerada o marcador detectável mais precoce para tenócitos diferenciados. Além disso, a SCX ativa marcadores de diferenciação tendínea a jusante, incluindo colágeno tipo 1a1 (COL1a1), moicano (MKX) e tenomodulina (TNMD), entre outros 4,5,6. Outros genes expressos durante a maturação tendínea incluem o membro 3 da família de proteínas promotoras da polimerização da tubulina (TPPP3) e o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRa)7. Embora esses genes sejam essenciais para o desenvolvimento e maturação tendínea, infelizmente não são exclusivos do tecido tendíneo e são expressos em outros tecidos musculoesqueléticos, como osso oucartilagem5,7.
Além da expressão de marcadores durante o desenvolvimento tendíneo, a mecanoestimulação é um elemento essencial para o desenvolvimento e cicatrização do tendão embrionário 4,5,6. Os tendões são mecanoresponsivos e seus padrões de crescimento mudam em resposta ao ambiente. Em nível molecular, pistas biomecânicas afetam o desenvolvimento, maturação, manutenção e respostas cicatriciais dos tenócitos8. Vários sistemas de biorreatores têm sido utilizados para modelar cargas fisiológicas e pistas biomecânicas. Alguns desses sistemas modelo incluem carregamento tecidual ex vivo, sistemas de carregamento de células 2D aplicando tensão biaxial ou uniaxial e sistemas 3D usando scaffolds e hidrogéis 9,10. Os sistemas 2D são vantajosos quando se estudam os efeitos da estimulação mecânica sobre genes tendão-específicos ou a morfologia das células no contexto do destino celular, enquanto sistemas 3D podem replicar com mais precisão as interações célula-MEC 9,10.
Em sistemas de carregamento 2D, a deformação entre as células e o substrato de cultura é homogênea, o que significa que a carga aplicada no citoesqueleto das células pode ser totalmente controlada. Em comparação com a carga biaxial, a carga uniaxial é fisiologicamente mais relevante, uma vez que os tenócitos são predominantemente submetidos à carga uniaxial dos feixes de colágeno in vivo9. Verifica-se que, durante as atividades diárias, os tendões são submetidos a cargas uniaxiais de tração de até 6%de deformação11. Especificamente, estudos prévios verificaram que a carga dentro das faixas fisiológicas de 4%-5% demonstrou promover diferenciação tenogênica ao preservar a expressão de marcadores relacionados ao tendão como SCX e TNMD, bem como aumentar a produção de colágeno 9,10. Cepas acima de 10% podem ser traumaticamente relevantes, mas não fisiologicamente relevantes12,13.
Aqui, é apresentado um protocolo que leva em consideração o efeito sinérgico da estimulação mecânica e biológica que pode ser essencial para a geração de tenócitos. Inicialmente, descrevemos um método reprodutível para induzir iPSCs em iMSCs via exposição de curto prazo de corpos embrionários a fatores de crescimento, confirmado por marcadores de superfície de CTM usando citometria de fluxo. Em seguida, detalhamos um método de transdução lentiviral para projetar iMSCs para ter superexpressão estável de SCX (iMSCSCX+). Para maior maturação celular, as iMSCSCX+ são semeadas em placas de silicone revestidas com fibronectina e submetidas a um protocolo de tensão uniaxial otimizado usando o biorreator CellScale MCFX. O potencial tenogênico foi confirmado pela observação da suprarregulação de marcadores tendinosos precoces e tardios, bem como da deposição de colágeno14. Este método de geração de iTenócitos é uma prova de conceito que pode oferecer uma fonte alogênica ilimitada para aplicações de terapia celular de tendão.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Solução antibiótica-antimicótica</td><td>Thermofisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105</td><td>Ancell</td><td>326-050</td><td></td></tr><tr><td>APC camundongo anti-humano CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>APC mouse IgG2 K isotipo controle</td><td>BD Biosciences</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark soro fetal bovino</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00959143_m1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3733</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo I alfa 1 cadeia humana Taqman primer</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00164004_m1</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo III alfa 1 cadeia humana Taqman primer</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem fenol vermelho</td><td>Thermofisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>meio essencial mínimo de águia (EMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Plasma bovino de fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FITC camundongo anti-humano CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti camundongo IgG1-PE</td><td>Bio-Rad</td><td>STAR117</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T / 17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, sem vermelho de fenol</td><td>Thermofisher</td><td>21056023</td><td></td></tr><tr><td>iPSCs: 83i-cntr-33n1</td><td>Cedars-Sinai iPSC Core Facility</td><td>N/A</td><td>https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/</td></tr> <tr><td>Anticorpo de controle de isotipo, camundongo IgG2a-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-271</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut substituição de soro</td><td>Thermofisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>ácido L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>2503081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>MechanoCulture FX</td><td>CellScale</td><td>N/A</td><td>aparelho de alongamento</td></tr><tr><td>MEM solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Thermofisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mohawk primer humano Taqman</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00543190_m1</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas Um primer Taqman humano</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00998018_m1</td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hidroxietil metacrilato)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de infecção/transfecção Polybrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante&nbsp; TGF-beta 1 proteína humana Taqman primer</td><td>RnD Systems</td><td>240-B</td><td></td></tr><tr><td>Scleraxis humano Taqman primer</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03054634_g1</td><td></td></tr><tr><td>SCXA (SCX) (NM_00108050514) humano marcado ORF clone</td><td>OriGene</td><td>RC224305L4</td><td></td></tr><tr><td>Placas de silicone</td><td>CellScale</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tenascina C primer Taqman humano</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00370384_m1</td><td></td></tr><tr><td>Tenomodulin primer Taqman humano</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00223332_m1</td><td></td></tr><tr><td>Trombospondina 4 primer Taqman humano</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00170261_m1</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção, BioT</td><td>Bioland Scientific LLC</td><td>B01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td> <td>Thermofisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Membro da família de proteínas promotoras de polimerização de tubulina 3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043892_m1</td><td></td></tr><tr><td>dicloridrato Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2d

Generation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived iTenocytes via Combined Scleraxis Overexpression and 2D Uniaxial Tension

Os desafios atuais no reparo de tendões e ligamentos requerem a identificação de um candidato adequado e eficaz para a terapia baseada em células para promover a regeneração tendínea. Células estromais mesenquimais (CTMs) têm sido exploradas como uma potencial estratégia de engenharia tecidual para reparo tendíneo. Embora sejam multipotentes e tenham potencial regenerativo in vivo, são limitados em sua capacidade de autorrenovação e exibem heterogeneidade fenotípica. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem contornar essas limitações devido à sua alta capacidade de autorrenovação e plasticidade de desenvolvimento incomparável. No desenvolvimento de tenócitos, a Scleraxis (Scx) é um regulador molecular direto crucial da diferenciação tendínea. Além disso, a mecanoregulação tem se mostrado um elemento central que orienta o desenvolvimento e a cicatrização do tendão embrionário. Como tal, desenvolvemos um protocolo para encapsular o efeito sinérgico da estimulação biológica e mecânica que pode ser essencial para a geração de tenócitos. As iPSCs foram induzidas a se tornarem células estromais mesenquimais (iMSCs) e foram caracterizadas com marcadores clássicos de células estromais mesenquimais via citometria de fluxo. Em seguida, usando um vetor lentiviral, as iMSCs foram transduzidas para SCX superexpressas estavelmente (iMSCSCX+). Essas célulasiMSC SCX+ podem ser posteriormente amadurecidas em iTenócitos via carga de tração uniaxial usando um biorreator 2D. As células resultantes foram caracterizadas observando-se a suprarregulação dos marcadores tendinosos precoce e tardio, bem como a deposição de colágeno. Este método de geração de iTenócitos pode ser usado para auxiliar os pesquisadores no desenvolvimento de uma fonte alogênica alogênica potencialmente ilimitada para aplicações de terapia celular de tendão.

Diferenciação de iPSCs humanas para iMSCs Como descrito anteriormente, o protocolo atual para diferenciar iPSCs em iMSCs envolve a formação de corpos embrionários2. Esse processo leva aproximadamente dez dias para induzir iMSCs a partir de iPSCs (Figura 1A). No entanto, é altamente recomendável passar pelos iMSCs recém-gerados pelo menos duas vezes. Isso não só ajuda a eliminar a necessidade de placas revestidas com gelatina, mas também estabelece a expressão estável de CTM. A quantificação por citometria de fluxo, realizada após seis passagens após a diferenciação, demonstra uma população celular quase pura com alta expressão de marcadores clássicos de superfície das CTM, incluindo CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) e CD105 (99,2%)17,18 (Figura 1B). Em termos morfológicos, as CTMs devem assemelhar-se muito às CTMs de medula óssea, apresentando-se alongadas e semelhantes a fibroblastos (Figura 1C).
Engenharia genética de iMSCs para superexpressão de SCX usando transdução lentiviral Lentivírus foram produzidos pela transfecção de células HEK293T/17 com o vetor pLenti-C-mGFP, no qual SCXB foi inserido para expressar SCX-GFP+, juntamente com dois plasmídeos de empacotamento. As transfecções foram realizadas pelo método BioT15,16 com uma relação de 1,5:1 de BioT (μl) para DNA (μg).
HEK293T/17 células foram semeadas a uma densidade de 5,3 x 104 células/cm2 18-24 h antes da transfecção. No momento da transfecção, as células devem atingir 80%-95% de confluência para evitar títulos de baixa eficiência (Figura 2B1, esquerda). Dentro de 24 h após a adição do coquetel de plasmídeos, alguma toxicidade foi observada, que atingiu o pico em 48 h (Figura 2B2). Como o vetor lentiviral da SCX é conjugado à GFP, a expressão da GFP deve ser observável após 48 h (Figura 2B3). A presença de alta toxicidade combinada com a expressão de GFP é um indicador confiável de sucesso na transfecção. Os lentivírus foram coletados em 48 h e 72 h, e a eficiência da transdução foi avaliada por citometria de fluxo e análise de expressão gênica. A intensidade absoluta de células positivas para GFP foi utilizada como proxy para integrações SCX, sendo significativamente maior nos títulos mais altos (Figura 3A). A eficiência da transdução, medida como a porcentagem de células SCX-GFP+ , demonstrou um efeito dose-resposta baseado na carga lentiviral (Figura 3B). A citometria de fluxo das iMSCSCX+ em diferentes passagens também mostrou alta estabilidade, sem alterações nos níveis de expressão transgênica ou na proporção de células transduzidas (Figura 3C). Além disso, após 4 semanas de cultura regular sem triagem, o iMSCSCX+ manteve a superexpressão estável de SCX (Figura 3D). A transdução em larga escala foi realizada com base no título, utilizando-se lentivírus a 75% (Figura 2C).
Carregamento mecânico do iMSCSCX+ As células iMSCSCX+ foram semeadas em placas de silicone deformáveis a uma densidade celular de 1,25 x 104 células/cm2 (Figura 4A,B) para permitir a fixação celular antes de iniciar o protocolo de alongamento. A densidade final de semeadura foi otimizada para evitar o crescimento excessivo de monocamadas. É importante notar que densidades de semeadura excessivamente altas resultaram em contração celular prematura e morte celular precoce (Figura 4D). Para o grupo controle estático, as células foram plaqueadas em placas idênticas, mas sem sofrer qualquer alongamento. As células iMSCSCX+ foram submetidas ao alongamento em biorreator 2D por no mínimo três dias, até sete dias, com deformação uniaxial de 4% e 0,5 Hz por 2 h por dia. Esse regime de alongamento é consistente com o que tem sido descrito como fisiologicamenterelevante9. Após vários dias de alongamento, pode-se observar algum grau de organização celular em relação ao grupo estático, que apresentou organização celular aleatória (Figura 4C). A coloração com faloidina dos filamentos de actina destaca ainda mais como as células parecem crescer perpendicularmente à direção do estiramento, em contraste com a organização celular aleatória observada nas placas estáticas (Figura 4E). Para caracterizar os iTenócitos recém-gerados, células foram coletadas aos três e sete dias para análise da expressão gênica, conforme previamente relatado14. A análise da expressão gênica revela que as célulasSCX+ das iMSC são mecanoresponsivas, pois há um aumento significativo na regulação de genes tenogênicos (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX e TPPP3)5,7,19,20 tanto em três quanto em sete dias, em comparação com apenas as iMSCs no dia 0 (Figura 5A). Além disso, a deposição de colágeno na camada média após 7 dias de alongamento foi significativamente maior no grupoiMSC SCX+ esticado em comparação com todos os outros grupos (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de diferenciação das iMSC e caracterização da citometria de fluxo. (A) Esquema geral da geração de iTenócitos e cronograma para indução de iMSC. Reproduzido com permissão de Papalamprou A. et al.14. (B) A quantificação por citometria de fluxo mostra uma alta porcentagem de células expressando marcadores clássicos de superfície de CTM para CTMs derivadas de iPSC após 6 passagens após a diferenciação. Adaptado com permissão de Sheyn D. et al.2. (C) Imagens de contraste de fase das células após a diferenciação demonstram morfologia semelhante à dos fibroblastos. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig02v2.jpg"> Figura 2: Esquema de produção do iMSCSCX+ . (A) Esquema geral de transfecção usando vetor de lentivírus SCX de2ª geração e transdução de iMSCs. Reproduzido com permissão de Papalamprou A. et al.14. (B1) HEK293T/17 células antes da adição do coquetel de plasmídeos. (B2) HEK293T/17 células, após 48 h, expressam GFP e apresentam toxicidade. (B3) A expressão de GFP que pode ser observada em células HEK293T/17 indica sucesso na transfecção. (C) As células iMSCSCX+ geradas (com título de 75%) expressam SCX-GFP+ nos núcleos. Barras de escala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig03.jpg"> Figura 3: Determinação da eficiência da transdução com citometria de fluxo e expressão gênica. A intensidade absoluta de células positivas para GFP foi usada como proxy para integrações SCX usando citometria de fluxo. Os títulos vetoriais foram validados por citometria de fluxo para todas as células para avaliar MOI lentiviral. (A) Fluorescência absoluta por título de vírus. (B) Eficiência de transdução avaliada como a porcentagem de células SCX-GFP+ . Um efeito dose-resposta da carga lentiviral na eficiência da transdução foi observado quando os resultados de fluxo foram apresentados como uma porcentagem de células GFP+. MOI, multiplicidade de infecção, n = 3 transduções independentes. A ANOVA one-way foi utilizada para comparar os títulos; os dados são médios ± DP; *p &lt; 0,05. (C) A citometria de fluxo do iMSCSCX+ após várias rodadas de passagem indica que não há alteração no nível de expressão estável de transgênicos e nenhuma alteração na proporção de células transduzidas. Nota-se que as iMSCs transduzidas com títulos de 100% pararam de se dividir em P3. (D) iMSCs transduzidas com vetor lentivírus SCX-GFP+ (75%, MOI = 2,9 e5 TU/mL) e avaliadas a expressão gênica de SCX em 4 semanas de cultura regular sem triagem. A expressão de SCX foi significativamente aumentada em iMSCSCX+, mostrando superexpressão estável de SCX após 4 semanas. UT, unidades de transdução; dados são médios ± DP, **p &gt; 0,01. Reproduzido com permissão de Papalamprou A. et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig04.jpg"> Figura 4: iMSCSCX+ semeado em um biorreator 2D e submetido a estiramento cíclico. (A) Biorreator 2D esquemático. Reproduzido com permissão de Papalamprou A. et al.12. (B) As células são primeiramente semeadas em placas flexíveis de silicone e incubadas a 37 °C para permitir a fixação antes do estiramento cíclico no biorreator 2D. (C) iMSCSCX+ foram estiradas em biorreator 2D por até 7 dias. Para os controles estáticos, as células foram plaqueadas em placas idênticas, mas sem alongamento. (C1) A placa de controle estático após 7 dias exibe arranjo estocástico das células. (C2) A placa esticada após 7 dias mostra relativamente mais organização celular. (D) Três exemplos do que não deve ser observado. Quando a densidade de semeadura celular é muito alta ou as células foram esticadas por muitos dias, as células começam a se destacar. (D1) As células estão apenas ligeiramente crescidas. As setas amarelas indicam o início da contração celular prematura. (D2) Nível moderado de crescimento excessivo. As células começam a se desprender da placa. (D3) Nível severo de crescimento excessivo. As células não estão mais crescendo em monocamada e formaram estruturas 3D. Barras de escala pretas = 400 μm. Barras brancas = 1000 μm. (E) Após 7 dias de estiramento (ou em cultura para a placa estática), as células foram fixadas com faloidina para filamentos de actina (vermelho) e contracoradas com DAPI para núcleos (azul). Barras brancas = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65837/65837fig05.jpg"> Figura 5: Estimulação da expressão gênica de marcadores tenogênicos por superexpressão de Scx e estiramento uniaxial em biorreator 2D. (A) iMSCSCX+ foram esticadas em biorreator 2D por 7 dias. Para os controles estáticos, as células foram plaqueadas em placas idênticas, mas sem alongamento. Análises de expressão gênica revelam que iMSCSCX+ é mecanoresponsiva. ND = sem detecção. A ANOVA one-way foi usada para comparar a expressão gênica em cada momento vs. d0º. N = 8/grupo. (B) Deposição de colágeno após 7 dias de estiramento no biorreator 2D. Os dados são médios ± DP; n = 8/grupo; *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. Reproduzido com permissão de Papalamprou A. et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65837/65837fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Today&#39;s challenges in tendon and ligament repair necessitate the identification of a suitable and effective candidate for cell-based therapy to ...

A lesão tendínea é um dos problemas musculoesqueléticos mais prevalentes nos EUA, afetando cerca de 33 milhões de pessoas anualmente. Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de uma abordagem de engenharia celular e tecidual para reparar tendões que pode melhorar drasticamente os resultados dos pacientes. As tecnologias atuais usadas para avançar a pesquisa de tendões incluem o uso de células-tronco de diferentes fontes, como células-tronco pluripotentes induzidas, em combinação com o uso de biorreatores, biomateriais de engenharia genética e outras técnicas de engenharia de tecidos para imitar as pistas ambientais necessárias para o tendão.Nossa compreensão de como os tendões se desenvolvem a partir de suas origens é limitada. Existem vários genes bem conhecidos que são altamente expressos durante a maturação tendínea. No entanto, eles infelizmente não são exclusivos do tecido tendíneo.Isso torna difícil para os pesquisadores avaliar de forma padrão a diferenciação tendínea bem-sucedida. Um protocolo aproveita o notável potencial de diferenciação do PCI e o que sabemos até agora sobre o desenvolvimento tendíneo. Nosso objetivo é desenvolver uma fonte alogênica de células para aplicações em terapia com células tendíneas.Nossos laboratórios se concentraram em elucidar as vias envolvidas com o sulfato tendíneo para melhor entender o desenvolvimento tendíneo. Queremos implementar esse conhecimento em combinação com tecnologias de engenharia de tecidos e biomateriais para desenvolver alternativas mais eficazes para o reparo tradicional de tendões.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

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Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

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Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Apresentamos aqui um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cada derivado do somite (Miótomo, sclerotome, dermátomo e syndetome) em condições quimicamente definidas, que tem aplicações em modelagem de doenças futuras e terapias baseadas em células em cirurgia ortopédica.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Aprenda a gerar itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas via superexpressão de Scleraxis e tensão uniaxial em bioreator 2D. Este método avança a engenharia de tecidos tendíneos.

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

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