Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica
27 de outubro de 2023
O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.
Estamos trabalhando na descoberta de biomarcadores baseados em vesículas extracelulares. Um passo importante é isolá-los de forma eficiente e seletiva. O EVtrap, que é baseado na separação baseada em esferas magnéticas, pode realmente nos ajudar, fornecendo alto rendimento, fácil de usar, em particular, fácil para aplicações clínicas.
Temos usado este protocolo para a descoberta em proteínas e biomarcadores de fosfoproteínas para diferentes doenças, tais como cancro da mama, cancros renais, e doença de Parkinson. Este biomarcador é derivado do biofluido. Os EVs podem ser potencialmente usados para biópsias líquidas, o que pode melhorar ainda mais o diagnóstico clínico e o tratamento.
Atualmente, a abordagem mais utilizada para o isolamento de vesículas extracelulares são a ultracentrifugação e a precipitação, mas esses métodos são limitados ao co-isolamento de contaminantes e também à baixa eficiência. Assim, nosso método EVtrap fornecerá uma maneira mais eficaz de isolar EVs, o que permitirá um método mais reprodutível e sensível e também beneficiará a análise a jusante. Estamos trabalhando em duas coisas.
Primeiro, continuamos desenvolvendo os métodos e protocolos para isolamento de EV e uma análise downstream, em particular, uma análise baseada em backup em massa. A segunda é que estamos explorando diferentes aplicações no campo clínico por causa da vantagem do EVtrap.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o isolamento eficiente de vesículas extracelulares (EVs) urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Também detalha análises subsequentes, como western blot, proteômica e fosfoproteômica, essenciais para a descoberta de biomarcadores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Descoberta de Biomarcadores
- Vesículas Extracelulares
Antecedentes
- As vesículas extracelulares são importantes para biópsias líquidas.
- Elas podem fornecer informações sobre várias doenças.
- O isolamento eficiente é crucial para aplicações clínicas.
- Proteínas e fosfoproteínas de fluidos biológicos são biomarcadores potenciais.
Objetivo do Estudo
- Para acelerar a descoberta de biomarcadores.
- Para isolar EVs de forma eficiente e seletiva.
- Para melhorar o diagnóstico e tratamento clínicos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de vesículas extracelulares urinárias utilizando microesferas magnéticas.
- Western blotting para análise de proteínas.
- Proteômica e fosfoproteômica para identificação de biomarcadores.
- Métodos de alto rendimento para aplicações clínicas.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de EVs a partir de biofluidos.
- Identificação de proteínas e fosfoproteínas associadas a doenças.
- Potencial demonstrado para aplicações de biópsia líquida.
- Facilitação da descoberta de biomarcadores para cânceres e doença de Parkinson.
Conclusões
- O protocolo aumenta a eficiência do isolamento de vesículas extracelulares (EV).
- Ele auxilia na descoberta de biomarcadores clinicamente relevantes.
- Potencial para melhorar estratégias diagnósticas e terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento eficiente e seletivo de vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos representa um ponto crítico para a descoberta de biomarcadores orientada por proteômica na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico. Este protocolo baseado em afinidade química com esferas magnéticas permite o isolamento de EVs com alto rendimento e reprodutibilidade, apoiando diretamente análises proteômicas e fosfoproteômicas quantitativas essenciais para a detecção precoce de doenças e validação de alvos. O método aumenta a confiança preditiva nos fluxos de trabalho de biomarcadores translacionais e apoia o avanço de portfólios com ajuste de risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação robusta de assinaturas de proteínas e fosfoproteínas relevantes para doenças a partir de biofluidos derivados de pacientes.
- Apoia a validação funcional de alvos ao fornecer carga de EV de alta qualidade para estudos mecanicistas posteriores.
- Facilita a desconsideração biológica por meio de perfilagem molecular reprodutível e quantitativa.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece preparações padronizadas de EVs de alta pureza adequadas para fluxos de trabalho de espectrometria de massa quantitativa.
- Melhora a reprodutibilidade e a sensibilidade do ensaio ao minimizar contaminantes e maximizar o rendimento de EVs.
- Permite o preparo escalonável de amostras de EVs para triagem de alto rendimento e reutilização da plataforma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao capturar instantâneos moleculares em tempo real a partir de biofluidos clínicos.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, possibilitando análises consistentes do proteoma e fosfoproteoma de vesículas extracelulares (EV).
- Oferece desvio mecanicista de riscos para biomarcadores candidatos antes do desenvolvimento clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de EVs integra-se na interface entre descoberta inicial e pesquisa translacional, conectando a preparação da amostra com análises quantitativas de proteômica e fosfoproteômica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir o acesso à carga molecular derivada de vesículas extracelulares (EV).
- Triagem: Fornece amostras reprodutíveis e quantitativas de EVs para o desenvolvimento de ensaios subsequentes e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição de alta produtividade e estatisticamente robusta da abundância de proteínas e fosfoproteínas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Possibilita o alinhamento e a continuidade de biomarcadores desde amostras de pacientes até modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada e escalável de isolamento de EVs para diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na descoberta de biomarcadores.
- Valor Operacional: Fornece isolamento padronizado, reproduzível e escalonável de vesículas extracelulares (EVs) para fluxos de trabalho de proteômica.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir um perfil molecular robusto.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos a biomarcadores e terapêuticas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em proteômica, fosfoproteômica e biologia de vesículas extracelulares para execução ideal e interpretação dos dados.
- Exige acesso a sistemas de separação baseados em microesferas magnéticas e plataformas de espectrometria de massa de alta resolução.
- Necessita padronização entre equipes dos procedimentos de manipulação de amostras e protocolos analíticos para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos tipos de biofluidos, mas pode exigir otimização para diferentes matrizes.
- A reprodutibilidade quantitativa e a sensibilidade dependem do rigoroso cumprimento do protocolo e da calibração analítica.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
