Name: Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a visualizar monocarboxilatos e ATP em cérebros ex vivo de larvas de Drosophila usando sensores FRET codificados geneticamente. Este método permite estudar dinâmicas metabólicas em células gliais e neurônios.

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Agradecemos a todos os membros do Sierralta Lab. Este trabalho foi apoiado pela FONDECYT-Iniciación 11200477 (para AGG) e FONDECYT Regular 1210586 (para JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glicose) foi gentilmente doado por Pierre-Yves Plaçais e Thomas Preat, CNRS-Paris.

1. Manutenção de cepas volantes e sincronização larval
<ol><li>Para a realização desses experimentos, utilizaram-se culturas de moscas criadas a 25 °C em alimento padrão de Drosophila composto por 10% de levedura, 8% de glicose, 5% de farinha de trigo, 1,1% de ágar, 0,6% de ácido propiônico e 1,5% de metilparabeno.</li>
	<li>Para seguir este protocolo, use as seguintes linhas: w1118 (fundo de controle experimental), OK6-GAL4 (driver para neurônios motores), repo-GAL4 (driver para todas as células gliais), CG-GAL4 (driver para corpos gordos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glicose), UAS-Laconic (sensor de lactato), UAS-GCaMP6f (sensor de cálcio), UAS-AT1.03NL (sensor ATP) e UAS-Chk RNAi GD1829. Todas as linhagens que expressam sensores ou RNAi estão no background genético w1118 .</li>
	<li>Para obter larvas errantes sincronizadas de terceiro ínstar, colocar 300 moscas (3-5 dias de idade, 100 machos, 200 fêmeas virgens) do cruzamento genético desejado na câmara de oviposição, que contém uma placa de Petri de 60 mm coberta com agarose a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque uma gota de levedura líquida/cremosa (1,5 cm de diâmetro) no centro da placa para incentivar as moscas a botar ovos (Figura 1).</li>
	<li>Manter as moscas a 25 °C durante 3 dias, substituindo a placa de Petri de agarose por uma fresca e levedura recém-dissolvida duas vezes por dia.</li>
	<li>Deixe as moscas botarem ovos por 4 h no quarto dia antes de trocar a placa de Petri. Remova esta placa. Em seguida, por 3 h, deixe as moscas depositarem ovos em uma nova placa de agarose com levedura recém-dissolvida. Use essas larvas nos experimentos.</li>
	<li>Após 3 h, retire a placa que contém os ovos e coloque-a em uma incubadora de 25 °C por 24 h.</li>
	<li>Recolher 50 a 100 larvas recém-eclodidas desta placa (0 h após a eclosão das larvas) e colocá-las num frasco de plástico contendo alimento padrão. Para permitir que as larvas se alimentem corretamente, certifique-se de que o alimento esteja moído e macio. Use as larvas 96 h após a transferência.</li>
</ol>2. Faça as tampas de vidro com poli-L-lisina
<ol><li>Realizar esta etapa 1 h antes da dissecção larval. Em uma placa de cultura celular de 6 poços, coloque lamínulas de vidro de 25 mm (o diâmetro das tampas a serem usadas depende da câmara de registro disponível no microscópio).</li>
	<li>Coloque uma gota (300 μL) de poli-L-lisina no centro de cada lamínula durante 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar cada lamínula 3x com água destilada e, em seguida, 2x com uma solução salina desprovida de Ca2+ (a mesma solução utilizada para dissecar as larvas, ver passo 3.2). Instale as tampas na câmara de gravação e preencha-a com solução salina livre de Ca2+. NOTA: Embora o cérebro da larva possa aderir diretamente às lamínulas de vidro, a adesão é fraca, e o cérebro ocasionalmente se move ou desloca durante o experimento devido ao fluxo contínuo de solução salina. A adição da etapa de poli-L-lisina reduz o risco de movimentos ou mesmo perda cerebral como resultado das lavagens.</li>
</ol>3. Dissecção do cordão nervoso ventral (VNC) e corpos gordurosos (corpos estranhos)
<ol><li>Reúna as larvas errantes de terceiro ínstar do cruzamento genético desejado (a partir do passo 1.7) e lave-as completamente 3x com água destilada.</li>
	<li>Colocar as larvas em uma placa de dissecção de vidro contendo 750 μL de solução salina gelada nominalmente zero de Ca2+ composta por NaCl 128 mM, KCl 2 mM, MgCl2 mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM (pH = 6,7, medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH 1 M e HCl 37% v/v). NOTA: Ajustar o pH para 6,7 é crítico porque, como observado anteriormente, o transporte de monocarboxilato é altamente dependente do pH da solução. Além disso, 6,7 corresponde ao pH na hemolinfa de uma larva de terceiro ínstar17,18.</li>
	<li>Coloque a larva sob um estereomicroscópio e faça um corte transversal na parte de trás do abdômen com um par de pinças.</li>
	<li>Empurre a mandíbula com a pinça enquanto vira as larvas do avesso.</li>
	<li>Observe o cordão nervoso ventral (VNC) próximo à mandíbula. Remova cuidadosamente os discos imaginários e os tecidos cérebro-caudais remanescentes.</li>
	<li>Separe o VNC com o cérebro central e lobos ópticos do resto do tecido, cortando os nervos. Transferir a CNV, pegando-a com pinça dos nervos restantes e colocando-a na câmara de gravação contendo a solução de registro livre de Ca2+ (mesma solução do passo 3.2). Os VNCs aderirão imediatamente às tampas.</li>
	<li>Para evitar a interferência dos nervos remanescentes, fixe-os na parte inferior da lamínula usando pinça (os nervos também serão fluorescentes dependendo da linha de driver utilizada) (Figura 2).</li>
	<li>Para realizar experimentos em corpos gordurosos (corpos estranhos) medindo o transporte de glicose ou monocarboxilato em outro conjunto de experimentos, proceder ao isolamento dos tecidos seguindo as etapas 3.1-3.4. Uma vez que as larvas estão viradas do avesso, observe que o corpo estranho é um tecido branco, bilateral e plano.</li>
	<li>Colocar os corpos estranhos isolados que expressam os sensores FRET (obtidos a partir de um cruzamento genético utilizando os condutores apropriados) na câmara de registo que contém a solução de registo sem Ca2+. OBS: O CORPO ESTRANHO é altamente hidrofóbico (tende a flutuar na superfície da solução) e extremamente vulnerável à manipulação com pinças, devendo ser manuseado com cuidado. Qualquer manuseio áspero desse tecido resultará em células mortas mais tarde (com uma diminuição da fluorescência dos sensores).</li>
	<li>Coloque a câmara de registro contendo VNCs/FBs no palco do microscópio.</li>
</ol>4. Imagem de células vivas
<ol><li>Para obter imagens dos sensores que expressam tecidos, use um microscópio de fluorescência vertical acoplado a um sistema de divisão de emissão e uma câmera CCD. Ligue o sistema de iluminação do microscópio 30 minutos antes de iniciar qualquer experimento. NOTA: Aqui usamos um microscópio de fluorescência Spinning Disk equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x/0,5 para observar VNCs e FBs. A Figura 2 também mostra o uso de uma objetiva de imersão em água de 40x/0,8.</li>
	<li>Para visualizar a fluorescência GCaMP6f, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão em 488 nm e 540 nm, respectivamente. Para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glucose, defina o comprimento de onda de excitação em 440 nm e os comprimentos de onda de emissão em 488 nm (mTFP, CFP) e 540 nm (Vênus, YFP).</li>
	<li>Adquira imagens de 512 x 512 pixels a cada 2 s para GCaMP6f e a cada 10-30 s para sensores Laconic/Pyronic/ATP/glicose. Determinar a exposição ótima à fonte de luz observando a qualidade da imagem obtida. Para seguir este protocolo, certifique-se de que as imagens sejam de exposição de 300 ms para os sensores Laconic e Pyronic e de 100-150 ms para os sensores de glicose e ATP . NOTA: A exposição pode variar dependendo do uso de um microscópio de fluorescência confocal ou normal.</li>
	<li>Uma vez instalada a câmara de registro no estágio do microscópio, coloque cuidadosamente a objetiva de imersão em água e certifique-se de que a objetiva permaneça submersa durante todo o experimento. Manter a temperatura ambiente a 25 °C.</li>
	<li>Conectar a câmara de registro a um sistema de perfusão e manter os tecidos banhados na solução de registro contendo NaCl 128 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 4 mM, trealose 5 mM, HEPES 5 mM e sacarose 35 mM, pH 6,7 (medido com um medidor de pH e ajustado com NaOH e HCl).</li>
	<li>Manter um fluxo constante de 3 mL/min de solução de registro através do tecido usando gravidade, acoplado a uma bomba peristáltica de baixo fluxo para extrair o líquido da câmara, mantendo o volume constante. Para atingir o fluxo necessário, posicione os tubos contendo solução (tubos plásticos de 50 mL) 25 cm acima do estágio do microscópio. NOTA: Este fluxo impulsionado pela gravidade é usado para evitar o movimento do tecido causado por bombas peristálticas, permitindo uma análise de imagem mais precisa mais tarde.</li>
	<li>Antes de qualquer estimulação, mantenha a solução de gravação fluindo por 5-10 min para obter uma linha de base estável de fluorescência dos sensores. Altere a duração conforme necessário para obter essa linha de base.</li>
	<li>Substitua a solução fluida pela solução de estimulação durante 5 minutos para estimular os VNC/FB (com glicose, piruvato ou lactato na concentração descrita para cada experimento dissolvido em solução salina; ver cada figura). NOTA: A duração da estimulação pode ser variada de acordo com as necessidades do experimento (por exemplo, pulsos de glicose podem ser aumentados para 10 min para atingir um platô nos neurônios, como relatado anteriormente16).</li>
	<li>Para manter a osmolaridade na solução de estimulação, retifique a concentração de sacarose (um carboidrato não metabolizável pelo cérebro de Drosophila ) de acordo com a concentração do monocarboxilato ou glicose adicionada.</li>
	<li>Troque as soluções usando um sistema simples de válvulas. Tenha cuidado para não mover o estágio do microscópio.</li>
	<li>Expor o VNC a 80 μM de picrotoxina (PTX, fluxo contínuo) para estimular a atividade neuronal. Esse procedimento aumenta a frequência de oscilações de Ca2+ , tornando possível observar mudanças em moléculas metabolicamente relevantes (por exemplo, ATP intracelular).</li>
	<li>No final de qualquer experimento, lavar cuidadosamente todo o sistema de fluxo, incluindo os tubos e a câmara de registro, por pelo menos 10 min com a solução salina e outros 10 min com água destilada para eliminar qualquer vestígio das soluções utilizadas.</li>
</ol>5. Processamento de imagens e análise de dados
<ol><li>Para processar as imagens obtidas, prossiga com os passos mostrados na Figura 3.</li>
	<li>Importe a imagem (Laconic) para o software ImageJ. A imagem tem duas visões da amostra: a esquerda é o sinal mTFP e a da direita é o sinal de Vênus. Selecione uma região que inclua as células a serem analisadas e separe essas imagens (mTFP e Vênus) em uma nova janela. Certifique-se de que essas imagens contenham exatamente a mesma área.</li>
	<li>Abra o plugin de registro e corrija a pequena deriva do tecido que normalmente é observada no experimento com a função corpo rígido. Execute isso em ambas as imagens (mTFP e Vênus).</li>
	<li>Selecione pelo menos 10 regiões de interesse (ROIs) no citosol das 10 células correspondentes no sinal mTFP (488 nm) e transfira as seleções para a imagem de Vênus (540 nm).</li>
	<li>Selecione duas ou três ROIs próximas às células analisadas, mas sem sinal discernível (sempre dentro da VNC ou do tecido analisado, ver Figura 3). Estes são os ROIs de fundo.</li>
	<li>Com as ROIs selecionadas em ambas as imagens, obtenha-se o valor médio de cinza de cada sinal usando a medida da função. Transfira os dados para uma folha de dados e subtraia o valor médio de fundo para cada sinal.</li>
	<li>Determine a razão de fluorescência mTFP sobre Vênus (para Lacônico e Pirônico). Este valor é calculado de forma diferente dos outros sensores FRET descritos aqui (onde a razão é geralmente YFP/CFP) porque quando ligados aos seus respectivos substratos, tanto o Laconic quanto o Pyronic reduzem suas eficiências de FET.</li>
	<li>Normalize os dados dividindo cada valor registrado pela linha de base. Em uma folha de dados separada, calcule a linha de base tomando o valor médio da razão mTFP/Vênus durante os 2 min que antecedem o estímulo.</li>
	<li>Para as medições de glicose e ATP usando sensores baseados em FRET, calcule a razão YFP/CFP e normalize os dados conforme descrito na etapa 5.8.</li>
</ol>

Monitoramento do transporte de metabólitos cerebrais em Drosophila usando sensores FRET

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<li>Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glucose+uptake+in+Drosophila+models+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).</li>
<li>Dienel, G., Rothman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calibration+of+genetically+encoded+metabolite+biosensors+must+account+for+metabolite+metabolism+during+calibration+and+cellular+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume.</a> Journal of Neurochemistry. , (2023).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+toolkit+for+the+analysis+of+metabolic+changes+in+Drosophila+provides+new+insights+into+metabolic+responses+to+stress+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation.</a> Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).</li>
<li>Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+FRET+sensors+in+intact+organs%3A+Applying+spectral+unmixing+to+acquire+reliable+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals.</a> BioRxiv. , (2023).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses concorrentes ou financeiros.

O uso do modelo de Drosophila para o estudo do metabolismo cerebral é relativamente novo26, e tem sido demonstrado que ele compartilha mais características com o metabolismo de mamíferos do que o esperado, o que tem sido estudado principalmente in vitro em culturas de neurônios primários ou fatias cerebrais. Drosophila se destaca em experimentos in vivo graças à bateria de ferramentas genéticas e sensores codificados geneticamente disponíveis que permitem aos pe...

O cérebro apresenta elevadas necessidades energéticas devido ao alto custo de restauração de gradientes iônicos em neurônios causados pela geração e transmissão de sinais elétricos neuronais, bem como pela transmissão sináptica 1,2. Há muito se pensa que essa alta demanda energética é atendida pela oxidação contínua da glicose para produzir ATP3. Transportadores específicos na barreira hematoencefálica transferem a glicose no sangue para o cérebro. Níveis glicêmicos constantes garantem que o cérebro receba um suprimento constante de glicose4. Curiosamente, crescentes evidências experimentais sugerem que moléculas derivadas do metabolismo da glicose, como o lactato e o piruvato, desempenham um papel importante na produção de energia das células cerebrais 5,6. No entanto, ainda há algum debate sobre a importância dessas moléculas para a produção de energia e quais células do cérebro as produzem ou utilizam 7,8. A falta de ferramentas moleculares apropriadas com a alta resolução temporal e espacial necessárias para esta tarefa é uma questão significativa que tem impedido que esta controvérsia seja completamente resolvida.
O desenvolvimento e a aplicação de vários sensores metabólicos fluorescentes projetados resultaram em um aumento notável em nossa compreensão de onde e como os metabólitos são produzidos e usados, bem como como os fluxos metabólicos ocorrem durante a atividade neuronal basal e alta9. Sensores metabólicos codificados geneticamente, baseados na microscopia de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), como ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glicose), lacônico (lactato) e pirônico (piruvato), têm contribuído para o entendimento do metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. No entanto, devido aos altos custos e equipamentos sofisticados necessários para a realização de experimentos em animais vivos ou tecidos, os resultados em modelos de vertebrados ainda são primariamente limitados a culturas de células (células gliais e neurônios).
O uso emergente do modelo de Drosophila para expressar esses sensores revelou que as principais características metabólicas são conservadas em todas as espécies e sua função pode ser facilmente abordada com esta ferramenta. Mais importante, o modelo de Drosophila lançou luz sobre como a glicose e o lactato/piruvato são transportados e metabolizados no cérebro das moscas, a ligação entre o consumo de monocarboxilato e a formação da memória, e a notável demonstração de como aumentos na atividade neural e fluxo metabólico se sobrepõem 14,15,16,17. O método apresentado aqui para medir os níveis de monocarboxilato, glicose e ATP usando sensores FRET codificados geneticamente expressos no cérebro da larva permite que os pesquisadores aprendam mais sobre como o cérebro de Drosophila usa energia, que pode ser aplicada aos cérebros de outros animais.
Mostramos que este método é eficaz na detecção de lactato e glicose em células gliais e neurônios, e que um transportador monocarboxilato (Chaski) está envolvido na importação de lactato para as células gliais. Também demonstramos um método simples para estudar as alterações dos metabólitos durante o aumento da atividade neuronal, que pode ser facilmente induzido pela aplicação em banho de um antagonista do receptorGABA A . Finalmente, mostramos que esta metodologia pode ser usada para medir o transporte de monocarboxilato e glicose em outros tecidos metabolicamente significativos, como corpos adiposos.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera ORCA-R2</td><td>Hamamatsu-Cell-R</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Software</td><td></td> Olympus-CG-GAL4 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7011</td><td>Driver de corpo gordo</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de divisão de emissão DV2</td><td>Lamínulas fotométricas</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>vidro (25 mm de diâmetro)</td><td>Marienfeld</td><td>111650</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma GraphPad</td><td>Software</td><td>Versão 8,0,2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institues of Health</td><td>Versão 1,53t</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LUMPlanFl 40x/0.8 objetiva de imersão em água</td><td></td> Olympus-Metilparabeno <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>OK6-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td>Driver de neurônio motor</td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma</td><td>P1675S</td><td>CUIDADO-Fatal se ingerido</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Sigma</td><td>P1386</td><td></td></tr><tr><td>Repo-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7415</td><td>Driver de célula glial (todos)</td></tr><tr><td>Lactato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de disco giratório BX61WI</td><td>Olympus-Sucrose</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>US Biological</td><td>T8270</td><td></td></tr><tr><td>UAS-AT1.03NL&nbsp;</td><td>Centro de Estoque de Drosophila de Kyoto</td><td>117012</td><td>Sensor ATP</td></tr><tr><td>UAS-Chk RNAi GD1829</td><td>Centro de Recursos de Drosophila de Viena</td><td>v37139</td><td>Linha Chk RNAi</td></tr><tr><td>UAS-FLII12Pglu700md6&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>93452</td><td>Sensor de glicose</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>42747</td><td>Sensor de cálcio</td></tr><tr><td>UAS-Laconic</td><td>Sierralta Lab-Sensor</td> <td>de</td> <td>lactato</td></tr><tr><td>UAS-Pyronic</td><td>Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UMPlanFl 20x/0.5 objetiva de imersão em água</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de drosophila usando sensores codificados geneticamente

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

As altas necessidades energéticas dos cérebros devido à atividade elétrica são uma de suas características mais distintivas. Esses requisitos são atendidos pela produção de ATP a partir da glicose e seus metabólitos, como os monocarboxilatos lactato e piruvato. Ainda não está claro como esse processo é regulamentado ou quem são os principais atores, particularmente em Drosophila.
Usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente, apresentamos um método simples para medir o transporte de monocarboxilatos e glicose em células gliais e neurônios em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila . O protocolo descreve como dissecar e aderir um cérebro larval expressando um dos sensores a uma lamínula de vidro. 
Apresentamos os resultados de um experimento inteiro em que o transporte de lactato foi medido em cérebros de larvas derrubando transportadores monocarboxilatos previamente identificados em células gliais. Além disso, demonstramos como aumentar rapidamente a atividade neuronal e rastrear alterações de metabólitos no cérebro ativo. O método descrito, que fornece todas as informações necessárias, pode ser usado para analisar outros tecidos vivos de Drosophila .

Por até 1 h, esse procedimento permite a fácil medição de alterações intracelulares na fluorescência de sensores de monocarboxilato e glicose. Como mostrado na Figura 4, sensores lacônicos tanto nas células gliais quanto nos neurônios motores respondem a 1 mM de lactato em uma taxa semelhante no início do pulso, mas os neurônios motores atingem um aumento maior em relação à linha de base durante o pulso de 5 min, como demonstrado anteriormente17. Essa concentração de ...

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar o transporte de monocarboxilatos, glicose e ATP em células gliais e neurônios usando sensores baseados em transferência de energia de ressonância de Förster codificados geneticamente em uma preparação cerebral ex-vivo de larvas de Drosophila .

Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the ...

O cérebro é um tecido com alto consumo de energia que utiliza principalmente a glicose como combustível. Por outro lado, dados experimentais sugerem que outros metabólitos como corpos cetônicos e monocarboxilatos podem ser úteis como fontes de energia. No entanto, ainda há um debate sobre quais células cerebrais são as produtoras e consumidoras primárias.Demonstrou-se que o lactato é um metabólito relevante em vertebrados para conduzir a atividade cerebral in vivo. Nosso grupo e outros mostraram em Drosophila a importância das moléculas de monocarboxilato para alimentar as altas necessidades energéticas em neurônios, bem como a necessidade de corpos lactatos e cetonas derivados da glia na formação da memória. Descrevemos transportadores de monocarboxilato no cérebro de Drosophila e determinamos que a transferência de lactato das células gliais para os neurônios é necessária para manter a atividade neural durante períodos de alta demanda.A principal vantagem é ter a possibilidade de determinar a dinâmica intracelular da glicose e seus metabólitos, como lactato, piruvato e ATB em células gliais e neurônios durante a atividade neural basal e alta. Além disso, para medir a transferência dessas moléculas em outros tecidos vivos, como os corpos gordurosos. O uso da Drosophila como modelo in vivo para o estudo do metabolismo energético cerebral usando uma configuração simples.Isso permitirá a modelagem de doenças metabólicas ou entender melhor o gerenciamento de energia no cérebro normal ou durante o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

visualizing-monocarboxylates-other-relevant-metabolites-ex-vivo

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Neurociência

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de...

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Este vídeo demonstra um método para imagens de cálcio in vivo usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em moscas. Ele descreve as etapas para preparar as moscas para microscopia, conduzir o condicionamento olfativo e visualizar o influxo de cálcio induzido por odor.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

Imagens de cálcio ex vivo para estudar as respostas cerebrais de Drosophila a neuropeptídeos

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Apresentamos um método especificamente adaptado para a imagem de todo o cérebro da Drosophila adulta durante o comportamento e em resposta a estímulos. A cabeça está posicionada para permitir acesso óptico a todo o cérebro, enquanto a mosca pode mover suas pernas e antenas, a ponta do proboscis, e os olhos podem receber estímulos sensoriais.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Apresentamos protocolos de imagem de cálcio para um neurônio olfatório larval de Drosophila , usando um adesivo tecidual tópico para imobilização. Este método aumenta a estabilidade, facilitando experimentos in vivo e ex-vivo confiáveis. Os scripts R personalizados analisam os sinais de cálcio, fornecendo uma plataforma eficiente para pesquisas neurofisiológicas detalhadas.

Imagem de cálcio in vivo e ex-vivo de um neurônio do circuito olfatório na larva de Drosophila melanogaster de terceiro ínstar

Aprenda a visualizar monocarboxilatos e ATP em cérebros ex vivo de larvas de Drosophila usando sensores FRET codificados geneticamente. Este método permite estudar dinâmicas metabólicas em células gliais e neurônios.

Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

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