Name: Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a dissociar enzimaticamente fibras musculares curtas, intermediárias e longas de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. Este método viabiliza estudos avançados de fisiologia muscular e acoplamento excitação-contração.

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Os autores expressam sua gratidão ao professor Robinson Ramírez, da UdeA, pela ajuda com os animais e algumas fotos e a Carolina Palacios pelo apoio técnico. Johan Pineda da Kaika nos ajudou a configurar as câmeras coloridas e de fluorescência. Shyuan Ngo, da Universidade de Queensland, gentilmente revisou o manuscrito. Este estudo foi financiado pelo CODI-UdeA (2020-34909 de 22 de fevereiro de 2021 e 2021-40170 de 31 de março de 2022, SIU), e pelo Escritório de Planejamento-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colômbia, ao JCC. Os financiadores não participaram da coleta e análise dos dados, redação ou submissão do manuscrito.

Isolamento enzimático e caracterização de fibras musculares de camundongos de comprimento variável

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Para complementar os modelos disponíveis para o estudo da biologia muscular esquelética madura, demonstramos aqui a dissociação enzimática bem-sucedida de uma variedade de músculos de camundongos com fibras curtas, intermediárias e longas. Essas fibras permitem demonstrar a generalização da cinética MT-II dos transientes de Ca2+ no músculo esquelético. Além disso, os tipos de fibras nos músculos inteiros intactos foram classificados. Tendo em vista que o FDB é o músculo mais utilizado para experimentos fisioló...

O músculo esquelético maduro de mamíferos é um tecido multifuncional. Regula fortemente o metabolismo, é a principal fonte de produção de calor e suas propriedades dinâmicas lhe conferem papel fundamental na respiração, movimentação de segmentos corporais ou deslocamento de um ponto a outro 1,2,3. O músculo esquelético também é relevante para a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo condições hereditárias e crônicas, como miopatias, distrofias ou sarcopenia, bem como muitas condições crônicas não musculares, como doenças cardiometabólicas 3,4,5,6,7,8.
O estudo ex vivo das propriedades estruturais e funcionais do músculo esquelético maduro no contexto da saúde e da doença tem sido possível principalmente através de dois modelos experimentais: músculo inteiro e fibras isoladas. Noséculo 20, pesquisadores exploraram as propriedades dos músculos extensor longo dos dedos (EDL), sóleo, tibial anterior e gastrocnêmio de diferentes espécies pequenas como modelos fundamentais para aprender sobre unidades motoras, tipos de fibras e propriedades dinâmicas, como força e cinética de contração e relaxamento 9,10,11,12,13,14,15,16. No entanto, o advento de estudos mais refinados de biologia celular direcionou a área para o estudo das fibras musculares únicas. Trabalhos pioneiros possibilitaram, então, o isolamento de fibras flexoras curtas dos dedos intactas (FDB) de ratos por dissociação enzimática para posterior caracterização17,18,19. Embora as fibras FDB também possam ser obtidas por dissecção manual20, a facilidade e o alto rendimento de dissociação enzimática dos músculos murinos, além de sua adequação a uma variedade de abordagens experimentais, tornaram este último modelo amplamente utilizado nas últimas duas décadas.
As fibras curtas de FDB são adequadas para estudos eletrofisiológicos e outros estudos biofísicos, análises bioquímicas, metabólicas e farmacológicas, experimentos de microscopia eletrônica e de fluorescência, transfecção para abordagens de biologia celular, ou como fonte de células-tronco em estudos de miogênese 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. No entanto, o uso apenas de fibras FDB em experimentos musculares estreita o escopo de pesquisas que lidam com tipos de fibras e limita a quantidade de material biológico disponível para algumas técnicas metodológicas ou para obter mais informações de um animal. Essas limitações impedem uma clara correlação dos fenômenos fisiológicos celulares com estudos bioquímicos e dinâmicos prévios realizados em diferentes músculos inteiros e intactos (por exemplo, EDL, sóleo, fibular).
Superando essas limitações, alguns grupos conseguiram dissociar os músculos EDL e sóleo mais longos 24,33,34,35,36,37,38,39,40, abrindo a porta para estender ainda mais o método para outros músculos relevantes. No entanto, o uso de EDL e fibras sóleos ainda é escasso, provavelmente devido à falta de detalhes metodológicos para obtê-las como fibras intactas. Aqui, descrevemos detalhadamente como isolar fibras de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos: três deles já descritos (FDB, EDL e sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux [EHL], fibular longo [PL] e fibular dos dedos [PDQA]). Os resultados do presente trabalho confirmam que o modelo de fibras enzimaticamente dissociadas é adequado para uma ampla gama de estudos e futuras correlações com dados previamente publicados, aumentando assim a disponibilidade de modelos para estudos de músculo esquelético maduro.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo antimiosina I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anti miosina II Anticorpo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anti miosina IIA Anticorpo</td><td>American Type Culture Collection</td><td>SC-71</td><td>Anticorpo primário. Derivado do hibridoma HB-277</td></tr><tr><td>Anti miosina IIB anticorpo</td> Estudos <td>de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Bis-acrilamida</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de cálcio</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Dicloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Consul-Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul brilhante R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Ácido edético (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glycine</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Preparado apenas em DMSO. O ácido plurônico não é necessário e não deve ser usado para evitar a deterioração da fibra.</td></tr><tr><td>Mercaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos</td><td>Vários</td><td></td><td>Vários Para este manuscrito, usamos apenas camundongos C57BL / 6. No entanto, alguns resultados preliminares mostraram que o protocolo funciona bem para camundongos Swiss Webster da mesma idade e peso.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzil-p-tolueno sulfonamida (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Composto de corte ideal (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Anticorpo Secundário Anti-IgG (H+L) de Cabra Anti-rato Anti-Absorção Cruzada, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hidroximetil)aminometano</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>MateriaisCâmara de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dissecção</td> Lâminas carregadas <td>feitas sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de banho experimental</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Câmara de banho estreita com estimulação de campo, montada em uma plataforma aquecida PH-6</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Tesoura 501778</td><td></td></tr><tr><td>Vidro Pipetas Pasteur</td><td>Várias</td><td></td><td>pontas</td></tr> <tr><td>polidas a fogoFrascos de vidro com tampa</td><td>Vários</td><td></td><td>volumes de 2-3 mL</td></tr><tr><td>Tesoura de operação</td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s e Axio 305</td><td>Axio 305, acoplada ao estereoscópio Stemi 508, foi utilizada para tirar fotos durante a dissecção; enquanto Erc 5s ou Axio 208, acoplado ao microscópio Axio Observer A1, foram utilizados para tirar imagens das fibras isoladas e dos ensaios de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de eletroforese</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido acoplado à fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Acoplado a uma fonte de luz apropriada, filtros e objetivas para fluorescência</td></tr><tr><td>Fotomultiplicador</td><td>Tubo Horiba</td><td>R928, Hamamatsu, em um fotômetro D104, Horiba</td><td>Acoplado à porta lateral do microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador&nbsp;</td><td>Instrumentos de grama&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software gratuito para análises de eletroforeses</td><td>University of Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Software gratuito para análise de imagens e morfometria</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Software licenciado para aquisição e análise de sinais Ca2+</td><td>Molecular Devices</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Software licenciado para análises estatísticas e gráficos</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Fibras musculares esqueléticas obtidas por dissociação enzimática de músculos de camundongos são um modelo útil para experimentos fisiológicos. No entanto, a maioria dos trabalhos trata das fibras curtas do flexor curto dos dedos (FDB), o que restringe o escopo de resultados que tratam dos tipos de fibras, limita a quantidade de material biológico disponível e impede uma clara conexão entre fenômenos fisiológicos celulares e conhecimentos bioquímicos e dinâmicos prévios obtidos em outros músculos.
Este trabalho descreve como obter fibras intactas de seis músculos com diferentes perfis e comprimentos de tipos de fibras. Usando camundongos adultos C57BL/6, mostramos o protocolo de dissecção muscular e isolamento de fibras e demonstramos a adequação das fibras para estudos transitórios de Ca2+ e sua caracterização morfométrica. A composição do tipo de fibras dos músculos também é apresentada. Quando dissociados, todos os músculos ficaram intactos, fibras vivas que se contraem rapidamente por mais de 24 h. FDB deu curto (<1 mm), fibular dos dedos (PDQA) e fibular longo (PL) deu intermediário (1-3 mm), enquanto extensor longo dos dedos (EDL), extensor longo do hálux (EHL) e músculos sóleo liberaram fibras longas (3-6 mm).
Quando registrados com o corante rápido Mag-Fluo-4, os transientes de Ca2+ das fibras PDQA, PL e EHL mostraram a cinética rápida e estreita que lembra a morfologia tipo II (MT-II), conhecida por corresponder às fibras tipo IIX e IIB. Isso é consistente com o fato de que esses músculos têm mais de 90% de fibras do tipo II em comparação com FDB (~80%) e sóleo (~65%). Indo além do FDB, demonstramos pela primeira vez a dissociação de vários músculos, que tornam fibras que abrangem uma faixa de comprimentos entre 1 e 6 mm. Essas fibras são viáveis e dão rápidos transientes de Ca2+ , indicando que a MT-II pode ser generalizada para fibras rápidas IIX e IIB, independentemente de sua fonte muscular. Esses resultados aumentam a disponibilidade de modelos para estudos do músculo esquelético maduro.

Concentração de Ca2+ sarcoplasmático durante uma contração Para demonstrar a viabilidade de experimentos fisiológicos no conjunto de fibras dissociadas e estender nossos achados anteriores sobre acoplamento excitação-contração (CCE) e tipos de fibras, transientes de Ca2+ foram adquiridos em fibras de todos os músculos. Primeiro, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) apresentaram cinética de Ca2+ conhecida como morfologia tipo II (MT-II). Estes são sinais rápidos, espinhosos, cujo ...

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

Neste estudo, descrevemos um método para isolar fibras de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de membros posteriores de camundongos. Além disso, testamos a adequação das fibras para experimentos fisiológicos que tratam do estudo do mecanismo de acoplamento excitação-contração. Durante anos, a obtenção de fibras musculares longas foi um desafio, limitando o escopo de muitos estudos na área.Agora mostramos que é possível obter fibras magras com flexores, extensores e evertores de camundongos com comprimentos de até seis milímetros. Como exemplo, a obtenção de fibras de seis músculos diferentes nos permitiu mostrar que a cinética transitória de cálcio, conhecida como morfologia tipo II, pode ser generalizada para os tipos IIB e IIX, independentemente da localização ou função de sua fonte muscular. Acreditamos que o modelo de fibras isoladas enzimaticamente é adequado para uma variedade de abordagens experimentais com diferentes tipos de tecnologias que nos permitem responder a questões mecanicistas dentro da gama de bioquímica, fisiologia, biofísica, biologia celular e biologia molecular.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em...

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

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Isolamento de miofibras: uma técnica para obter miofibras únicas do músculo extensor longo dos dedos (EDL) de camundongo colhido

Nós apresentamos protocolos detalhados para executar experimentos do difraction do raio X do pequeno-ângulo usando os músculos esqueletais do rato intact. Com a ampla disponibilidade de modelos de camundongo transgênicos para doenças humanas, esta plataforma experimental pode formar um leito de teste útil para elucidar a base estrutural de doenças musculares...

Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular

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Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

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A função muscular esquelética pode ser avaliada pela quantificação da contratilidade de fibras musculares isoladas, tradicionalmente utilizando abordagens trabalhosas e de baixo rendimento. Aqui, descrevemos um método óptico de alto rendimento para quantificar a contratilidade de fibras musculares emblocadas em hidrogel. Essa abordagem tem aplicações na triagem de fármacos e no desenvolvimento terapêutico.

Medidas contráteis de alto rendimento de fibras musculares intactas de camundongos embutidas em hidrogel usando um sistema baseado em óptica

Este protocolo visa isolar e purificar vesículas extracelulares intersticiais do músculo esquelético (SkM-EVs) de tecidos musculares de roedores por meio de descolamento mecânico, dissociação enzimática, filtração e ultracentrifugação diferencial. Demonstra consistência e confiabilidade. Os SkM-EVs isolados fornecem informações sobre a homeostase e doenças musculares, com aplicações potenciais como biomarcadores diagnósticos ou veículos terapêuticos.

Isolamento enzimático de vesículas extracelulares intersticiais do músculo esquelético

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Esse protocolo descreve o isolamento de fibras musculares únicas intactas do sóleo oxidativo e o estabelecimento de culturas de mioblast altamente purificadas derivadas dessas fibras. O procedimento otimizado gera de forma confiável aproximadamente 300–500 miofibras intactas por camundongo, permitindo análises moleculares e celulares posteriores.

Ensaio de Isolamento de Fibra Única para Avaliação do Comportamento da Miofibra Oxidativa

Aprenda a dissociar enzimaticamente fibras musculares curtas, intermediárias e longas de seis músculos dos membros posteriores de camundongos. Este método viabiliza estudos avançados de fisiologia muscular e acoplamento excitação-contração.

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos (Vídeo) | JoVE Journal

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

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