Name: Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos primários de tecido vaginal humano usando digestão mecânica e enzimática. Este método otimizado melhora o rendimento em amostras pós-menopausais para pesquisa de prolapsos pélvicos.

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<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Bio Techne</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (100 &mu; m)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos (15 mL)</td> <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Feather Bisturi Descartável No. 15</td><td>Socorex</td><td>FB.15</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC1983075</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos de Alta Clareza (50 mL)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de amostras HulaMixer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>Pró-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISA</td><td>R & D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (5000U/ml)</td>Placas de Petri <td>15070063</td><td></td> <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>, poliestireno (100 mm x 20 mm)</td>Pipetas sorológicas <td>Millipore Sigma</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>(10 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Seringas estéreis (5 mL)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

O tecido vaginal foi coletado de 10 doadores independentes submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Usando o protocolo descrito, as células foram isoladas do tecido vaginal humano. As populações de células tinham uma aparência alongada, plana e fusiforme característica. Como outros estudos, observamos capacidades de duplicação celular significativamente mais lentas e capacidade clonogênica reduzida dos fibroblastos com o aumento da idade do doador. Essas diferenças foram marcantes quando comparados fibroblastos isolados de indivíduos mais velhos (75-78 anos) com aqueles isolados de indivíduos jovens (35-47 anos). As células de doadores de meia-idade exibiram um perfil intermediário (56-61 anos). As taxas de proliferação celular foram inicialmente estimadas por visualização direta usando um microscópio de contraste de fase com a mesma densidade de semeadura conhecida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg"> Figura 1: Representação diagramática do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 1 mostra uma representação diagramática do protocolo de dissociação e isolamento. Seguindo essas etapas, este protocolo produziu uma taxa de sucesso de 90% do isolamento primário de fibroblastos em nove em cada dez doadores em número de células suficiente para permitir a subcultura de células. A idade média dos doadores era de 59 anos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Protocolo (Autor, ano)</td>
			<td>Tecido doador do protocolo original</td>
			<td>Número de doadores</td>
			<td>Idade do doador em anos</td>
			<td>Fibroblastos obtidos</td>
			<td>Morfologia</td>
		</tr><tr><td>Ruiz-Zapata et al., 2013</td>
			<td>Vagina humana</td>
			<td>3</td>
			<td>56-78</td>
			<td>Não</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Khan et al., 2016</td>
			<td>Orelha e cauda do rato</td>
			<td>2</td>
			<td>48-65</td>
			<td>Não</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Waise et al., 2019</td>
			<td>Tecido humano</td>
			<td>3</td>
			<td>56-75</td>
			<td>Não</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Nadalutti et al., 2020</td>
			<td>Prepúcio humano</td>
			<td>1</td>
			<td>65</td>
			<td>Não</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Atual</td>
			<td>Vagina humana</td>
			<td>10</td>
			<td>35-79</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Em forma de fuso</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Comparação de protocolos para isolamento bem-sucedido de fibroblastos vaginais humanos. Comparação de diferentes protocolos existentes com o nosso e evidenciado por resultados morfológicos.
A Tabela 1 mostra os resultados do uso de outros protocolos para tentar o isolamento de fibroblastos vaginais neste estudo. Desenvolvemos um protocolo padrão para o isolamento de fibroblastos primários da mucosa vaginal e de doadoras mais velhas5.
Testamos vários protocolos estabelecidos, incluindo os listados na Tabela 1, e não observamos sucesso no isolamento celular usando esses protocolos em nosso estudo. Propomos as seguintes razões para suas limitações.
O protocolo publicado por Ruiz et al.3 envolve a raspagem da fáscia e o corte do tecido em pequenos pedaços. Em nossa experiência, é difícil distinguir a fáscia, e as tentativas de raspagem podem resultar em uma redução significativa no rendimento celular. Embora esse método seja direto, ele carece de detalhes críticos, o que limita sua generalização. Além disso, a digestão mecânica neste protocolo parece insuficiente para o tecido pós-menopausa, que tende a ser mais denso.
Os protocolos publicados por Khan et al.9 e Waise et al.13 empregam tesouras para picagem de tecidos, que não introduzem forças de cisalhamento multidirecionais significativas em comparação com a técnica de bisturi. Em nossa experiência, o método da tesoura também não funcionou de forma eficaz.
Por fim, o protocolo de Nadalutti et al.14 , que utilizou o método do explante, não produziu fibroblastos com sucesso em nossas mãos. Este método pode ser menos eficaz devido à natureza do tecido pós-menopausa, que pode exigir processamento mecânico e enzimático mais agressivo para dissociar os fibroblastos com sucesso.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg"> Figura 2: Imagem de contraste de fase de células suspensas no dia 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 2 mostra as células suspensas no dia 0 usando nosso protocolo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg"> Figura 3: Imagem de contraste de fase de fibroblastos primários vaginais no dia 14 de cultura com aumento de 100x de uma suspensão de células agrupadas de três biópsias de tecido de 1 cm2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 3 mostra fibroblastos primários com aumento de 100x de uma suspensão de células agrupadas de 3 biópsias de tecido de 1 cm² de dimensões.
A identidade dos fibroblastos foi investigada por técnicas de imunofluorescência, conforme descrito anteriormente, com pequenas modificações. Para verificar a origem celular das células vaginais primárias, utilizamos biomarcadores específicos de origem fibroblástica via coloração imunofluorescente. As células foram identificadas como fibroblastos com base na coloração positiva de vimentina (Figura 4), F-actina e α-SMA de amostras de tecido na pré-menopausa e pós-menopausa (Figura 5). Os fibroblastos foram cultivados para expansão com alta viabilidade (&gt;90%) para uso em experimentos.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg"> Figura 4: Coloração positiva de vimentina de fibroblastos vaginais. Os fibroblastos primários de tecido pré-menopausa e pós-menopausa isolados foram submetidos à análise de FI e as imagens foram obtidas com aumento de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg"> Figura 5: Coloração positiva de F-actina e α-SMA de fibroblastos vaginais. Os resultados da expressão proteica em comparação com o controle de IgG. As imagens foram coletadas com aumento de 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

Pelvic organ prolapse is a disorder that seriously impacts the quality of life of women. It occurs when muscles and ligaments weaken and cause pelvic ...

tissue-processing-isolation-primary-fibroblasts-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

O protocolo de cultura de explantes de fibroblastos de soco biópsias da pele humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar células da pele dentro de 4-8 semanas para o banco de cerca de 15-20 milhões de células em um número baixo passagem.

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e estabelecer culturas primárias de fibroblastos/miofibroblastos (MF) de células gástricas, pequenas intestinais e produtoras de tecido colônico congeladas com fenótipo MF. Essas células expressam CD90, α-SMA e vimentina. Os MFs podem ser usados para uma variedade de ensaios funcionais, incluindo atividade enzimática e produção de citocinas.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que podem fornecer de forma eficaz e constante fibroblastos puros e viáveis.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano

Aprenda a isolar fibroblastos primários de tecido vaginal humano usando digestão mecânica e enzimática. Este método otimizado melhora o rendimento em amostras pós-menopausais para pesquisa de prolapsos pélvicos.

Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

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