Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

A pesquisa sobre distúrbios que afetam principalmente pessoas do sexo feminino é pouco estudada e subfinanciada. O prolapso de órgãos pélvicos é o distúrbio fortemente associado ao sexo feminino. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina.

Pouco se sabe sobre as interações celulares no contexto dessa fisiopatologia, nem como os fatores no nível do tecido afetam o sucesso das intervenções cirúrgicas. O isolamento de fibroblastos primários da vagina humana pode ser útil para estudar os mecanismos biológicos subjacentes ao prolapso de órgãos pélvicos. O prolapso de órgãos pélvicos geralmente afeta indivíduos mais velhos ou na pós-menopausa.

O estudo do isolamento e proliferação de fibroblastos primários dessa condição é desafiador devido à redução das populações de células e à capacidade clonogênica de doadores mais velhos. A maioria dos artigos que usam amostras vaginais humanas utiliza tecido de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos. Embora alguns artigos relatassem o uso de amostras de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa, eles não descreveram com detalhes suficientes o protocolo usado para isolar com sucesso os fibroblastos de doadores mais velhos ou na pós-menopausa.

O isolamento e a modelagem da doença usando fibroblastos do tecido pós-menopausa podem ser essenciais para entender a fisiopatologia celular do prolapso de órgãos pélvicos, pois essa condição tem a maior prevalência em indivíduos na década seguinte à menopausa, Descrevemos um método para isolamento e cultura de uma suspensão de célula única enriquecida com fibroblastos de tecido vaginal humano usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática. Este artigo descreve um protocolo confiável sobre como adquirir fibroblastos vaginais humanos na pós-menopausa ou envelhecidos. Os tecidos colhidos foram analisados histologicamente para validar o protocolo.

Meça e corte o tecido no tamanho de aproximadamente um centímetro quadrado. Garanta a medição precisa do tamanho da biópsia. Prepare duas a três biópsias vaginais adicionais, medindo um centímetro quadrado cada de um único doador e deixe as biópsias de lado.

Depois de colocar a biópsia vaginal em uma placa de Petri de cultura de células, pique o tecido vaginal em pequenos fragmentos, usando dois bisturis estéreis. Certifique-se de que as pontas das lâminas estejam perpendiculares à superfície do tecido. Aplique pressão igual e constante na superfície do tecido, usando dois bisturis.

Execute uma ação de puxar alternada para cortar os tecidos em pedaços muito pequenos. Repita esta técnica de picagem, usando dois bisturis, até que a amostra tenha uma consistência uniforme com pedaços de um a dois milímetros. Adicione dois a três mililitros de meio de cultura de células sem soro à placa, suspendendo o tecido picado.

Pipete a solução contendo fragmentos de tecido para cima e para baixo para quebrar quaisquer aglomerados. Transferir a solução contendo fragmentos de tecido para um tubo cónico de 15 mililitros. Adicionar outros meios de cultura de células isentos de soro até que o volume total seja de 10 mililitros.

Armazene Liberase em alíquotas de 230 microlitros para uso. Adicione 230 microlitros de Liberace ao tubo. Incube os tubos por três horas a 37 graus Celsius com agitação vigorosa constante, usando um misturador de amostras.

Mantenha agitação constante. Vortex os tubos em intervalos de 30 minutos durante a incubação. Centrifugue as amostras durante cinco minutos a 3000 G. Retire e elimine o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um a dois mililitros de meios de cultura de células com 10% de soro bovino fetal para diluir a Liberase. Pipetar vigorosamente até que o pellet esteja totalmente suspenso. Coe a suspensão enzimática tecidual pipetando suavemente a solução sobre o filtro de células.

Junte as suspensões de células de várias biópsias de tecido do mesmo doador. Com o êmbolo de uma seringa estéril de cinco mililitros, pressione a suspensão enzimática tecidual sobre o filtro. Repita esta etapa até que os fragmentos de tecido restantes pareçam estar totalmente pressionados.

A placa puxou a suspensão celular de várias biópsias vaginais do mesmo doador em uma única placa de Petri. Após a incubação noturna a 37 graus Celsius, observe as células com um microscópio de contraste de fase. Certifique-se de que o foco do microscópio esteja na parte inferior da placa.

Um pequeno número de fibroblastos será anexado ao fundo. Aqui está uma representação diagramática do protocolo, destacando as principais etapas. A Figura dois mostra uma imagem de contraste de fase de células suspensas no dia zero.

A Figura três é uma imagem de contraste de fase de fibroblastos primários vaginais no dia 14 de cultura com ampliação de 100X de uma suspensão puxada de três biópsias de tecido de um centímetro quadrado. A Tabela um mostra os resultados do uso de outros protocolos para tentar o isolamento de fibroblastos vaginais neste estudo. Os fibroblastos foram identificados por coloração positiva do menton.

A análise de imunofluorescência foi realizada nos tecidos vaginais pré-menopausa e pós-menopausa mostrados aqui. As imagens foram tiradas com ampliação de 200X. Fibroblastos isolados também foram corados com actina de músculo liso alfa e actina F em amostras de tecido pré-menopausa e pós-menopausa.

Desenvolvemos um protocolo otimizado e confiável para isolamento de fibroblastos primários da mucosa vaginal em doadoras mais velhas. O uso de protocolos publicados anteriormente para tecidos animais e humanos para dissociação de células primárias não conseguiu extrair nenhum fibroblasto de amostras vaginais humanas neste estudo. Nossa hipótese é duas razões prováveis para os desafios da dissociação celular do tecido vaginal humano.

A espessura dérmica da mucosa é maior em doadores mais velhos e quando comparada à do tecido não mucoso, e a densidade de fibroblastos pode ser acentuadamente reduzida em indivíduos mais velhos. Algumas etapas críticas não devem ser modificadas. A implementação de uma digestão mecânica muito rigorosa, usando a técnica de dois bisturis, e reunindo as suspensões celulares de três a quatro biópsias de espessura total de um único doador.

Nosso protocolo tem uma vantagem distinta. A digestão mecânica e enzimática levam a melhores rendimentos para o tecido pós-menopausa, mas não têm impacto negativo nas amostras pré-menopausa. Reconhecemos várias limitações ao nosso protocolo.

O acesso ao tecido vaginal humano pode ser desafiador em situações em que a cirurgia de prolapso vaginal não está sendo realizada, e a necessidade de extração de suspensões celulares de várias amostras de biópsia de tecido também pode ser uma limitação. Este protocolo para a necessidade de fibroblastos vaginais humanos será uma ferramenta útil para futuras investigações em distúrbios do assoalho pélvico, especialmente em indivíduos na pós-menopausa, bem como uma adição importante à pesquisa em saúde da mulher.