Name: Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a gerar células CAR-T murinas de forma eficiente usando vetores retrovirais e transdução de células T. Este protocolo padronizado permite estudar terapias de câncer em modelos sinigênicos com sistema imunológico completo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a L. Brockmann pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.

Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolos AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) em camundongos fêmeas BALB/c ou CF57BL/6 com 6-8 semanas de idade, pesando entre 20-25 g. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este protocolo é estruturado em torno dos "dias pós-ativação" das células T murinas, e a produção viral começa no Dia -2. O retrovírus pode ser armazenado a -80 °C após a produção inicial e, para uso futuro deste protocolo, pode-se iniciar com a etapa 2, isolamento e ativação de células T no Dia 0.
1. Produção de vetor retroviral
NOTA: Os produtos virais tornaram-se defeituosos de replicação pela separação dos genes de embalagem em dois plasmídeos separados (ver Tabela de Materiais), reduzindo consideravelmente a probabilidade de eventos de recombinação e produção inadvertida de vírus competente em replicação.
<ol><li>Preparar células Phoenix Eco um dia antes da transfecção (procedimento Dia -2).<ol><li>Placa aproximadamente 1 x 107 células em placa tratada com CT de 15 cm ou frasco de cultura T150, utilizando 30 mL de meio de cultura (meio de cultura Phoenix Eco, conforme detalhado na Tabela 1).</li>
		<li>Incubar durante a noite a 37 °C. Após 18-24 h, as células devem ser aproximadamente 70% confluentes e uniformemente distribuídas para garantir um alto rendimento viral sem crescimento excessivo. NOTA: Para obter os melhores resultados, use células com uma passagem baixa e passe-as no dia anterior ao plaqueamento para a produção viral. Não permita que as células Phoenix Eco cresçam demais durante a cultura de rotina.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar a mistura de transfecção contendo os reagentes de lipofecção e intensificador, pCL-Eco (Gag/Pol) e plasmídeo de expressão de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) em meios de soro reduzido (ver Tabela de Materiais) (procedimento Dia -1). NOTA: A co-transfecção deve ser realizada na proporção de 1:1 de pMSCV e pCL-Eco.<ol><li>Preparar o tubo A: Diluir 105 μL do reagente de transfecção em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm e misturar completamente por vórtice ou pipetagem para cima e para baixo.</li>
		<li>Preparar o tubo B: diluir o plasmídeo de expressão de pMSCV (21 μg) e pCL-Eco (21 μg) com 90 μL de reagente intensificador em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm. Misture bem pipetando para cima e para baixo. NOTA: Se gerar vários produtos virais, configure uma mistura mestre contendo pCL-Eco e o reagente intensificador.</li>
		<li>Adicione o tubo A ao tubo B e misture bem por pipetagem. Incubar por 10-20 min à temperatura ambiente, resultando em um volume total de aproximadamente 7,5 mL.</li>
		<li>Remover cuidadosamente 10 mL de meio de cultura celular da(s) placa(s) Phoenix Eco e adicionar todo o volume da mistura de transfecção ao meio restante, inclinando a placa e pipetando gota a gota. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Trocar a mídia em células Phoenix Eco transfectadas 16-20 h pós-transfecção (procedimento Dia 0).<ol><li>Meio de células T murino pré-aquecido e β-mercaptoetanol (2-ME, ver Tabela de Materiais) (colheita viral mTCM, conforme listado na Tabela 1) a 37 °C usando água ou banho de contas.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o meio de cultura Phoenix Eco inclinando a placa e colocando a ponta da pipeta no canto inferior, usando um vácuo, se possível. Evite secar demais as células.</li>
		<li>Adicione suavemente o meio de colheita mTCM-viral aquecido ao lado da placa inclinada pipetando 30 mL na configuração mais lenta. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C. NOTA: Esta etapa pode fazer com que as células Phoenix Eco se desprenda da placa e reduzam os títulos virais. A mídia pré-aquecida e a pipetagem suave minimizarão a interrupção.</li>
	</ol></li>
	<li>Colher o sobrenadante viral 48 h pós-transfecção (procedimento Dia 1).<ol><li>Recolher o sobrenadante viral e filtrá-lo através de filtros PVDF de 0,45 μm (ver Tabela de Materiais) para remover células e detritos. Aliquot e congelar o vírus a -80 °C ou prosseguir diretamente para o Dia 1 da etapa 3 se estiver usando vírus novo.</li>
		<li>Determinar o título viral (unidades de transdução/mL) por citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente9. Esta etapa é opcional.<ol><li>Determinar o título viral por transdução em pequena escala de 1 x 105 células T murinas ativadas em placas de 96 poços tratadas com cultura de tecidos (TC) não tratadas com TC, pré-revestidas com retronectina (ver Tabela de Materiais) e carregadas com diluições seriadas triplas de sobrenadante retroviral em um volume final de 100 μL de meio de colheita viral mTCM. NOTA: Consulte as etapas 2 e 3 abaixo para obter instruções detalhadas sobre isolamento, ativação e transdução de células T.</li>
			<li>Determinar a expressão da superfície do CAR 4-5 dias após a transdução por citometria de fluxo.</li>
			<li>Calcular o título viral de acordo com a fórmula10: (N x F x D)/V, onde N é o número de células transduzidas, F é a frequência de células CAR-positivas, D é o fator de diluição e V é o volume de transdução em mL para obter unidades de transdução (UT)/mL. NOTA: O título viral pode diminuir após o congelamento/descongelamento; portanto, o título viral é idealmente determinado no vírus congelado e subsequentemente descongelado.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento de células T murinas
<ol><li>Isolar e ativar células T murinas (procedimento Dia 0). NOTA: Estas etapas podem ser realizadas à temperatura ambiente (TR) ou 4 °C e devem ser realizadas em um ambiente estéril.<ol><li>Colher o(s) baço(s) da cepa de camundongo de interesse (por exemplo, Balb/c, C57BL/6) conforme descrito anteriormente11 e obter uma suspensão unicelular por dissociação mecânica.</li>
		<li>Usando a parte de trás de uma seringa estéril, esmague o(s) baço(s) através de um filtro de células de 70-100 μm em um tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Após deixar a seringa de lado, lave o filtro com 5 mL de tampão de isolamento de células T (solução salina tamponada com fosfato, PBS, suplementado com soro fetal bovino a 2%, FBS).</li>
		<li>Repita a etapa de trituração e lave o filtro novamente com 5 mL de tampão de isolamento de células T. Levar o volume final para 50 mL com tampão de isolamento de células T.</li>
		<li>Conte as células vivas usando um hemocitômetro manual ou um contador automático de células diluindo na proporção de 1:20 e, em seguida, misturando a 1:1 com azul de tripano.</li>
		<li>Pellet as células por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspender os espleenócitos a 1 x 108/mL se usar o kit de isolamento de células T recomendado (ver Tabela de Materiais). NOTA: Os espleenócitos podem ser re-esticados através de um filtro de 40-70 μm nesta fase para remover aglomerados.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolar células T CD3+ por seleção negativa seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Após a separação magnética, transferir o isolado para um tubo cônico de 15 mL e realizar uma contagem final de células vivas.</li>
	<li>Pastilhar as células T isoladas por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspendê-las a 1 x 106/mL em meio de ativação mTCM (Tabela 1).</li>
	<li>Ativar células T adicionando esferas magnéticas murinas revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD28 (ver Tabela de Materiais) na proporção de 25 μL/1 x 106 células T e 100 U/mL IL-2.</li>
	<li>Coloque as células numa incubadora a 37 °C e deixe-as durante a noite. NOTA: Devido ao pequeno tamanho das células T, uma contagem de células T vivas mais precisa pode ser obtida diluindo-se em uma proporção de 1:10-1:20 e misturando-se a 1:1 com azul de tripano para contagem manual usando um hemocitômetro. A pureza pode ser determinada por citometria de fluxo pela coloração das células com um anticorpo αCD3 conjugado fluorescentemente. Cada baço produzirá entre 7-10 x 106 células T, dependendo da idade e cepa do camundongo.</li>
</ol>3. Transdução de células T murinas
<ol><li>Preparar placas para transdução (procedimento Dia 0).<ol><li>Pré-revestir placas estéreis de 24 poços não tratadas com 0,5 mL de reagente intensificador de transdução de fibronectina humana (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 20-40 μg/mL, diluindo-o em PBS estéril e armazenando a 4 °C durante a noite. NOTA: Esta etapa também pode ser realizada no Dia 1 revestindo-se placas de 24 poços não tratadas com o reagente de transdução e incubando-as à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar transdução de células T (procedimento Dia 1).<ol><li>Prepare a placa pré-revestida para transdução. Remova o reagente de transdução de cada poço da placa pré-revestida de 24 poços e bloqueie com um volume equivalente de PBS filtrado estéril + albumina de soro bovino (BSA) a 2% (0,5 mL) por 30 min na RT.</li>
		<li>Lavar uma vez com 0,5-1 mL de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 0,5-1 mL de retrovírus puro da etapa 1 ou diluído com base no título viral a cada poço pré-revestido e centrifugar por 90 min a 2.000 x g e 32 °C.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de células T activadas a cada poço carregado com vírus e centrifugar durante 10 minutos a 450 x g e 32 °C. Retornar as células para uma incubadora de 37 °C durante a noite.</li>
	<li>24 h após a transdução, remova 1-1,5 mL de meio de cultura celular e substitua-o por 1-1,5 mL de mTCM-completo e 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes (ver Tabela de Materiais). Células de retorno para uma incubadora de 37 °C (procedimento do dia 2). NOTA: Durante a cultura ex vivo , 10 ng/mL de citocinas devem ser adicionados à cultura a cada 48 h, e as células T não devem ser diluídas além de 1 x 106/mL.</li>
	<li>48 h após a transdução, transferir as células da placa de transdução para uma placa fresca de 24 ou 6 poços e retornar as células para uma incubadora de 37 °C (procedimento do Dia 3). NOTA: A viabilidade das células T pode melhorar transferindo células em 24 h a 2 dias após a transdução, dependendo da viabilidade inicial das células T e do título viral.</li>
	<li>De-bead as células T e confirmar a expressão CAR (procedimento Dia 5-6).<ol><li>Ressuspenda completamente as células para dissociar as células T ativadas das esferas revestidas com αCD3/CD28 (ver Tabela de Materiais) e coloque a suspensão celular em um ímã por 30 s. Transferir a suspensão celular para o recipiente de cultura ex vivo desejado e devolvê-la a uma incubadora a 37 °C. NOTA: As células T podem ser cultivadas em frascos de cultura ou placas de cultura de poço profundo. Recomenda-se plaquear um mínimo de 5 x 106 células T em 30 mL de meio mTCM-completo por poço em um poço profundo de uma placa de formato de 6 poços (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Determinar a expressão do CAR por citometria de fluxo8. Nota: A expressão de GFP-CAR foi determinada por incubação com 100 ng/mL de GFP purificada. A incorporação de um epítopo N-terminal facilitará a detecção de construções alternativas do CAR.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar cultura ex vivo de células CAR-T (procedimento Dia 7-10).<ol><li>Durante o cultivo ex vivo , manter as células removendo 50% do meio de cultura e substituindo-o por mTCM-completo fresco + 2x 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 a cada 48 h. NOTA: As células CAR-T murinas estão prontas para uso em aplicações a jusante 7 dias após a ativação e não devem ser criopreservadas devido à baixa viabilidade pós-descongelamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocolo simplificado para geração de células CAR-T de camundongo em modelos singênicos

<ol><li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li>
<li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li>
<li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li>
<li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).</li>
<li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li>
<li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+new+roads+for+cars%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li>
<li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li>
<li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).</li>
<li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li>
<li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299(2021).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Sterile+Tissue+Harvest%22">Sterile Tissue Harvest</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li>
<li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li>
<li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li>
<li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li>
<li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy%3A+Challenges+and+ways+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702(2020).</li>
<li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li>
<li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li>
</ol>

Não foram declarados conflitos de interesse.

Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.
Enquanto este protocolo descreve a geração de exemplo de um CAR específico para GFP, esses métodos podem ser adaptados para gerar células CAR-T de camundongo visando qualquer antígeno extracelular de interesse. O pMSCV_PGK vetor retroviral usado neste estudo permite a liberação eficiente da sequência de nanocorpos específicos de GFP por digestão enzimática com NotI e BamHI e pode ser substituído por um domínio de reconhecimento de antígeno definido pelo usuário, como um scFv, nanocorpo, ou domínio de ligação ao ligante (Arquivo Suplementar 1). Para facilitar a avaliação da expressão alternativa do CAR, recomenda-se projetar CARs com um tag de epítopo N-terminal, como os tags Myc (EQKLISEEDL) ou Flag (DYKDDDDK), que podem ser detectados usando anticorpos conjugados fluorescentemente12. Além disso, o presente estudo demonstra a produção de um único transgene; entretanto, a incorporação de peptídeos de autoclivagem (sequências 2A) ou sítios internos de entrada do ribossomo (IRES) possibilitaria a coprodução de múltiplos transgenes, incluindo tecnologias adicionais para melhorar a função das células T in vivo 8,13,14.
Embora esse protocolo tenha sido desenvolvido para eliminar a necessidade de equipamentos especializados por omitir a ultracentrifugação (24.000 x g, 2 h, 4 °C), vale ressaltar que a concentração do sobrenadante viral pode alcançar títulos virais mais elevados e reduzir o volume de vírus necessário para atingir alta expressão de CAR8. Este protocolo adicionalmente agiliza a produção do vetor retroviral, alcançando títulos virais reprodutavelmente altos (~2 x 107 TU/mL) e expressão constante de CAR sem a necessidade de determinação do título viral antes do uso. No entanto, além de facilitar a padronização, a determinação do título viral antes da transdução de células T também pode aumentar a viabilidade das células T, reduzindo a toxicidade potencial causada por concentrações virais desnecessariamente altas10,15.
A suplementação com IL-7 e IL-15 é recomendada para promover a expansão das células T e preservar as populações de memória das células T; entretanto, a IL-2 humana recombinante pode ser utilizada como alternativa para diminuir o número de reagentes necessários para cultura ex vivo 16,17,18,19. No entanto, os métodos para geração de células CAR-T descritos aqui permanecem limitados pela expansão relativamente pobre de células T murinas. No entanto, as medidas para melhorar a viabilidade das células T discutidas acima poderiam ser aprimoradas com a inclusão de suplementos adicionais e 2-ME no meio de cultura mTCM durante todo o processo de transdução20. Embora essas modificações possam melhorar a expansão das células T de 15 para até 20 vezes20, elas podem resultar em menor eficiência de transdução e expressão reduzida de CAR.
Em última análise, a produção de células CAR-T murinas permite o desenvolvimento de modelos singênicos para avaliar a função das células CAR-T dentro de um sistema imunológico intacto - facilitando uma avaliação contexto-específica de sua potência, durabilidade e segurança. Já os modelos em camundongos imunodeficientes permitem importantes estudos pré-clínicos de um produto de células T humanas visando um antígeno tumoral humano. A combinação desses sistemas de modelos complementares será indispensável para entender a complexidade da biologia celular CAR-T, otimizar novos projetos de CAR e, finalmente, traduzir achados pré-clínicos em terapias clínicas eficazes.

Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas1. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se tornando cada vez mais evidente que modelos pré-clínicos individuais não predizem com precisão a farmacodinâmica e a eficácia clínica de um medicamento vivo 2,3. Portanto, os pesquisadores começaram a expandir o estudo pré-clínico de produtos de células CAR-T para incluir avaliações paralelas em modelos de xenoenxerto e singênicos de cânceres humanos e murinos, respectivamente.
Ao contrário dos modelos de xenoenxerto, em que tumores humanos e células T são enxertadas em camundongos imunodeficientes, os modelos singênicos permitem o exame das respostas das células CAR-T no contexto de um sistema imunológico funcional. Especificamente, camundongos imunocompetentes portadores de tumores singênicos fornecem um sistema para estudar a interação entre células T transferidas adotivamente e meios contexto-específicos - incluindo macrófagos associados a tumores (TAMs) e células T reguladoras (Tregs) conhecidas por suprimir a função de células T no microambiente tumoral (TME)4,5,6. Além disso, os modelos singênicos oferecem uma plataforma adicional para avaliar a toxicidade no alvo, fora do tumor e a interação de células CAR-T com fatores do hospedeiro que podem levar a toxicidades adicionais, incluindo a síndrome de liberação de citocinas7.
Apesar dessas vantagens, o número de estudos singênicos com células CAR-T permanece limitado. Notadamente, modelos singênicos requerem engenharia autóloga de células CAR-T da mesma linhagem de camundongos e, portanto, apresentam um desafio adicional devido à falta de metodologia para transdução eficiente de células T murinas e expansão ex vivo 2,8. Este protocolo descreve os métodos para alcançar a expressão estável do CAR através da produção de vetores retrovirais e transdução otimizada de células T. Um esquema de todo o processo é mostrado na Figura 1. O uso desta abordagem demonstra a transdução retroviral eficiente de células CAR-T murinas e a obtenção de alta expressão de CAR sem a necessidade de concentração viral através da ultracentrifugação. Estratégias para alterar a antigenespecificidade do construto CAR são discutidas, além da co-expressão de transgenes adicionais.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtros</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-408-135</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m coador</td><td>Corning</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>15 cm TC placas de cultura de células tratadas</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>130183</tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m coador&nbsp;</td>Tubos cônicos <td>Corning</td><td>07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro m</td><td>Corning</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Citômetro de Fluxo&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C, 6-8 semanas de idade&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina&nbsp;</td><td>GOLDBIO</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sem Cálcio e Magnésio&nbsp;</td><td>Ímã Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Ímã Invitrogen</td><td>12-321-D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp;</td>Kit de Isolamento de Células T de Camundongo <td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>BDB554657</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex6</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 humano recombinante&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante humana</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-748</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 recombinante humana</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-363</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD3 BV421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11-453-D</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD4 BV605</td><td>BD</td><td>563151</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD44 APC&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>103011</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD62L PE-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 60-0621-U025</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD8 APC-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 25-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2 com câmera Prime 95B&nbsp;</td><td>Placas de</td> 24 poços não tratadas da Nikon<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31-985-062</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Addgene</td> <td># 12371</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina / Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix Eco células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>pMDG.2</td><td>Addgene</td> <td># 12259</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV_PGK_GFP28z</td><td>N / A</td><td>Produzido por R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>SfGFP N / A purificado</td><td></td><td>Produzido por R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin ('reagente de transdução')</td><td>Takara Bio</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 10 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 25 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 5 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr> Placas de 24 poços tratadas com TC <tr><td>Pyruvate</td><td></td><td>Gibco 11-360-070</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Corning</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Azul Tripano&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

geração eficiente de células t do receptor de antígeno quimérico murino (car)-t

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.

O protocolo aqui descrito visa padronizar o processo de transdução de células T murinas para a geração de células CAR-T de camundongo. A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas. O processo começa com a produção de vetores retrovirais via co-transfecção de componentes virais em células Phoenix Eco. A Figura 2 fornece uma imagem da densidade ideal de células Phoenix Eco no dia da transfecção. As células T isoladas são então ativadas 24 h após a transfecção, ou 'Dia 0' deste protocolo, em preparação para a transdução no Dia 1. Após a transdução, as células CAR-T são cultivadas na presença de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes para alcançar expansão de dobras suficientes, preservando populações de memória de células-tronco.
O uso do kit de isolamento de células T murinas recomendado (ver Tabela de Materiais) com este protocolo produz purezas de células T de &lt;98% antes da transdução, conforme determinado por citometria de fluxo (Figura 3A). Além disso, taxas de expressão reprodutíveis de CAR de 65%-75% podem ser obtidas usando este protocolo e o vetor retroviral pMSCV modificado para expressar a construção CAR a partir de um promotor PGK (Figura 3B,C). A determinação do título retroviral revela títulos de até ~2 x 107 TU/mL e expressão de CAR de 74% com 1/3do sobrenadante viral colhido após co-transfecção de pMSCV com pCL-Eco (Figura Suplementar 1).
Finalmente, a cultura ex vivo com 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 leva a uma expansão de aproximadamente 15 vezes, resultando em ~150 x 106 células T no Dia 10 pós-ativação a partir de um único baço (Figura 3D). A cultura com IL-7 e IL-15 leva a frequências comparáveis de linfócitos T CD8+ e CD4+ (Figura 3E) e populações preservadas de memória de células-tronco determinadas pela expressão de CD62L+CD44- após 10 dias de cultura ex vivo (Figura 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo. Painel superior: uma visão geral esquemática da linha do tempo do protocolo. Painel inferior: Instruções passo a passo para produção de vetor retroviral e transdução de células T de camundongo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig02.jpg"> Figura 2: Densidade celular ótima para transfecção. Imagem de microscopia de campo brilhante de células Phoenix Eco na densidade ideal antes da transfecção com pMSCV e pCL-Eco. Capturado usando uma lente objetiva de 10x. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig03.jpg"> Figura 3: Produção de células CAR-T murinas e cultura ex vivo. (A) Gráfico de citometria de fluxo mostrando a frequência de células BALB/c CD3+ após o isolamento de células T murinas. (B) Representação esquemática do vetor retroviral pMSCV utilizado para expressão de GFP-CAR em células T murinas. (C) Histogramas de citometria de fluxo demonstrando a expressão superficial de CAR em células T de camundongo após incubação com sfGFP purificado. UT, não transduzida. (D) Expansão dobrada das células CAR-T até o 10º dia pós-ativação e cultura com IL-17 e IL-15 humanas recombinantes. Aproximadamente 8 x 106 células T murinas foram ativadas antes da transdução e atingiram aproximadamente 1,28 x 108 no dia 10 pós-ativação. (E) Gráfico de citometria de fluxo mostrando a frequência de células CAR-T CD8+ e CD4+ no dia 10 pós-ativação. (F) Gráfico de citometria de fluxo demonstrando a frequência de populações de memória de células T CD8+ determinadas pela expressão de superfície de CD62L e CD44. A memória de células-tronco (MST) é caracterizada por CD62L+CD44-, memória central (MTC) por CD62L+CD44+ e memória efetora (TEM) por CD62L-CD44+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Formulação de meios de cultura celular. Os detalhes da formulação para os meios de cultura celular utilizados no protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Figura suplementar 1: Expressão da superfície do CAR e títulos retrovirais. (A) Histogramas de citometria de fluxo mostrando a expressão da superfície de CAR em células T BALB/c após incubação com sfGFP purificado. O retrovírus foi gerado pela transfecção de células Phoenix Eco com pMSCV_PGK_mGFP28z em combinação com pCL-Eco e pMD2.G (I), pCL-Eco (II) ou isoladamente (III). As células T foram transduzidas com retrovírus diluído, conforme indicado. (B) Títulos retrovirais determinados pela expressão superficial de células T transduzidas por CAR. As unidades de transdução (UT)/mL foram calculadas pela fórmula: (N∙F∙D)/V, onde N é o número de células transduzidas (1 x 105), F é a frequência das células CAR+ , D é o fator de diluição e V é o volume de transdução em mL (0,2 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: sequência vetorial de expressão pMSCV. A sequência do CAR GFP28z e sequências de flanco (itálico) no vetor de expressão pMSCV, com os sítios das enzimas NotI e BamHI destacados em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Nossa pesquisa explora combinações eficazes de bactérias projetadas e células T CAR para o tratamento de tumores sólidos. É importante para nós estudar como essas duas terapias celulares funcionam dentro do contexto de um sistema imunológico completo usando modelos singênicos de câncer de ovário. O estudo da função das células T CAR em modelos tumorais singênicos tem sido limitado pela falta de protocolos padronizados para a geração de células T CAR murinas.As células T murinas são particularmente difíceis de transduzir em cultura ex vivo usando métodos tradicionais. Desenvolvemos este protocolo para agilizar a produção de células T CAR murinas para possibilitar o estudo em modelos singênicos que fornecem contexto importante para avaliar a atividade de novas tecnologias CAR.

efficient-generation-of-murine-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra uma técnica para fabricar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. As células T humanas são incubadas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, juntamente com um meio suplementado com interleucina-2 (IL-2), levando à ativação e proliferação de células T. Vetores lentivirais transgênicos são introduzidos, permitindo que o RNA transgênico se integre ao genoma do hospedeiro e expresse o transgene. Isso resulta nas células T...

Uma técnica ex vivo para fabricar células T receptoras de antígeno quimérico

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação,...

Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para gerar células T do receptor de antígeno quimérico transitório (CAR) usando mRNA não integrante para imunoterapia contra o câncer e fornece métodos confiáveis para avaliar as células CAR-T e sua função citotóxica.

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Aprenda a gerar células CAR-T murinas de forma eficiente usando vetores retrovirais e transdução de células T. Este protocolo padronizado permite estudar terapias de câncer em modelos sinigênicos com sistema imunológico completo.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Explorar mais vídeos