Name: Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a isolar astrócitos e microglia viáveis da medula espinhal de camundongos adultos usando dissociação enzimática e separação magnética. Este protocolo permite estudos transcriptômicos e cultura celular in vitro.

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Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de trabalho do protocolo é apresentada na Figura 1.
1. Preparação da medula espinhal
<ol><li>Anestesiar os animais com Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-Tribromoetanol e 2,5% de 2-metil-2-butanol em água estéril) (ver Tabela de Materiais). Confirme a ausência de resposta aos beliscões dos dedos dos pés e da cauda nos ratos.</li>
	<li>Realizar perfusão cardíaca com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) 1x Dulbecco a frio para remover as células mononucleares do sangue periférico.<ol><li>Coloque o animal em uma bandeja rasa e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural. Insira uma agulha de perfusão 23 G conectada a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo e ative a bomba. Uma vez que a DPBS fria flui através do coração, crie uma pequena incisão no átrio direito. NOTA: Uma taxa de perfusão mais rápida é preferida nesta etapa para aumentar a viabilidade celular. O sangue deve ser liberado em menos de 1 minuto. A limpeza do fígado indica perfusão bem-sucedida.</li>
	</ol></li>
	<li>Decapitar o animal com uma tesoura grande e retirar a coluna vertebral14. Submergir em 1x DPBS frios com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose em uma placa de Petri sobre gelo para enxágue tecidual.</li>
	<li>A partir de agora, certifique-se de que todas as etapas sejam realizadas em um ambiente estéril. Use extrusão hidráulica14 para isolar toda a medula espinhal. Empregar uma agulha de 18 G e uma seringa de 10 mL preenchida com 1x DPBS frios com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri colocada em blocos de gelo contendo 1x DPBS frios suficientes com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose para submergir todo o tecido.</li>
	<li>Remova cuidadosamente as meninges sob um microscópio dentro de uma capela de fluxo laminar. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri vazia em bolsas de gelo e, usando um bisturi cirúrgico com lâmina nº 10, corte toda a medula espinhal em seções de 2-3 mm.</li>
</ol>2. Dissociação enzimática celular
<ol><li>Adicione a mistura de enzimas 1 e a mistura de enzimas 2 do Kit de dissociação cerebral para adultos disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Agite as enzimas no prato várias vezes para garantir um revestimento uniforme da medula espinhal e, em seguida, incube a 37 °C durante 30 minutos. A cada 5 minutos, gire suavemente o prato para evitar aglomeração de tecidos e facilitar a distribuição uniforme de reagentes.</li>
	<li>Retire a placa da incubadora e adicione 350 μL de 0,46 mg/mL de DNAse I em Meio Essencial Mínimo (MEM) (ver Tabela de Materiais). Misture girando suavemente.</li>
	<li>Adicione 1 mL de DMEM frio/0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB) e misture girando suavemente. Transfira imediatamente todo o conteúdo para um tubo de 5 mL.</li>
</ol>3. Dissociação mecânica celular
<ol><li>Usando uma pipeta P1000, triture suavemente o tecido três vezes, garantindo que pedaços de tecido sejam retirados cada vez para dissociar ainda mais o tecido. Em seguida, usando uma pipeta de vidro Pasteur plugada de 9", triture suavemente mais cinco vezes, garantindo que nenhuma bolha seja gerada durante o processo.</li>
	<li>Coloque o tubo de 5 mL na vertical e deixe o tecido se acomodar no fundo por 30 s. Uma vez que o tecido tenha se acomodado, extrair o sobrenadante usando uma pipeta P1000 e passá-lo através de um filtro de 30 μm para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Ao mesmo tubo de 5 mL com o tecido restante, adicionar 1 mL de DMEM frio/SFB a 0,5%. Usando uma pipeta Pasteur, triture suavemente três vezes.</li>
	<li>Deixe o tecido assentar no fundo por 30 s, depois passe o sobrenadante através de um filtro de 30 μm e colete-o no mesmo tubo de 15 mL de antes. Repita as etapas 3.3 e 3.4 mais uma vez.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR). Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante resultante usando um aspirador a vácuo.</li>
</ol>4. Remoção da mielina
<ol><li>Remova a mielina usando a solução de remoção de detritos (DRS) fornecida no Kit de Dissociação Cerebral para Adultos seguindo o protocolo do fabricante. Após a remoção dos detritos, adicionar 5 mL de DMEM frio/FBS a 0,5% ao pellet de células e inverter suavemente o tubo três vezes. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR). NOTA: Se as células serão usadas para estudos in vitro e permanecerão em cultura, deve-se usar DMEM/FBS pré-aquecido a 0,5%.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de DPBS/FBS a 0,5% (frio para estudos de RNA e quente para ensaios in vitro ). Conte as células e avalie a viabilidade usando Trypan Blue. NOTA: Suspensões celulares de vários animais podem ser combinadas para aumentar a concentração celular.</li>
	<li>Lave as células adicionando DPBS/FBS a 0,5% até um volume total de 5 mL. Centrifugar a suspensão a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.</li>
</ol>5. Isolamento de micróglias e astrócitos
<ol><li>Rotule as células com microesferas anti-CD11b ou anti-ACSA-2 seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Classifique as células por seleção positiva usando as colunas MS de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Após a triagem, centrifugar as células classificadas a 300 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.</li>
</ol>6. Plating de células para ensaios in vitro
NOTA: Se as células não forem plaqueadas e forem usadas imediatamente para análise de RNA, prossiga para a etapa 8.
<ol><li>Ressuspender as células em 1 mL de DMEM quente/SFB a 0,5%. Conte as células e avalie sua viabilidade usando um hemacitômetro (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Ajustar a concentração celular para 75.000 células por 50 μL. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada lamínula revestida de poli-L-lisina11 em uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 2 h para permitir que as células adiram à lamínula.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 450 μL de DMEM quente/5% FBS/Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep, ver Tabela de Materiais) a cada poço.</li>
	<li>Após 3 dias, substituir metade do meio por 250 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep. Para manutenção, substitua completamente o meio por 500 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep a cada 4-5 dias.</li>
</ol>7. Imuno-histoquímica
NOTA: É melhor realizar análises imunohistoquímicas após pelo menos 3 dias quando o meio tiver sido substituído pelo menos uma vez. Isso garante que os detritos tenham sido removidos e que as células tenham aderido completamente à lamínula.
<ol><li>Remover o meio e rotular as células com mAb O4 anti-rato (1:100) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% soro normal de cabra (NGS) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) ou a 37 °C. Observação : ignore esta etapa e prossiga para a etapa 7.3 se as células não serão rotuladas com O4.</li>
	<li>Enxágue suavemente as lamínulas mergulhando-as em DMEM/5% FBS morno três vezes. Adicionar cabra anti-rato 594 IgM (1: 300) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% NGS e incubar em RT por 15 min no escuro. Enxaguar suavemente três vezes em DMEM/5% FBS quente.</li>
	<li>Fixar as células com ácido acético a 5% a frio/metanol durante 15 minutos a 4 °C. Lave três vezes com 1x PBS e, em seguida, rotule com o anticorpo apropriado: GFAP anticoelho (1: 500), GFAP anti-rato (1: 500) ou Iba1 anticoelho (1: 500) em 1% Triton-X100/10% NGS em 1x DPBS (ver Tabela de Materiais). Incubar por 1 h no TR. OBS: Mantenha as lamínulas no escuro caso já tenham sido manchadas com O4.</li>
	<li>Enxágue suavemente três vezes com PBS. Rótulo com o anticorpo secundário apropriado: anti-camundongo 594 IgG (1: 500), anti-coelho 488 IgG (1: 500) (ver Tabela de Materiais). Incubar por 30 min no TR no escuro.</li>
	<li>Enxágue suavemente três vezes com PBS. Contramanchar com DAPI (1: 1000) por 1 min em RT. Enxágue três vezes com PBS, adicione o meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e monte as lamínulas nas lâminas.</li>
</ol>8. Extração de RNA
NOTA: Idealmente, deve haver pelo menos 100.000 células para extrair RNA suficiente para análise. Se necessário, células de 2-3 medulas, podem ser combinadas.
<ol><li>Extraia o RNA usando um kit de isolamento de RNA disponível comercialmente seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para cada etapa de lavagem com o tampão de lavagem RW1 fornecido no kit, deixe as células no tampão de lavagem por mais 2 min.</li>
	<li>Remova qualquer DNA genômico remanescente usando DNase I de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Incubar com DNase em TR durante 15 minutos e, em seguida, lavar com tampão RW1.</li>
	<li>Para aumentar o rendimento de RNA, antes da eluição incubar as amostras em água livre de RNAse em TR por 10 min. Avalie a integridade e a quantidade de RNA usando um bioanalisador15 (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

Extração eficiente de astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
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<li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).</li>
<li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li>
<li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175(2022).</li>
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<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).</li>
<li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li>
</ol>

Nenhum

O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura celular, citomet...

Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias após insultos ou lesões 5,6,7. As respostas astrocitárias na doença são igualmente diversas, englobando contribuições para a inflamação, a formação de cicatrizes gliais e o comprometimento da barreira hematoencefálica 8,9. Embora nossa compreensão dos papéis prejudiciais e reparadores da micróglia e dos astrócitos no SNC tenha crescido, a heterogeneidade inerente em sua estrutura e função requer ferramentas robustas para estudá-los em vários contextos.
Obter mais informações sobre os papéis da micróglia e dos astrócitos na saúde e na doença requer uma abordagem combinada de investigações in vivo e in vitro . Técnicas in vivo alavancam o intrincado crosstalk entre células gliais e neurônios dentro do SNC, enquanto metodologias in vitro mostram-se valiosas ao avaliar funções ou respostas unicelulares sob estímulos específicos. Cada método oferece vantagens únicas; Estudos in vitro são essenciais para a compreensão dos papéis específicos desses tipos celulares sem a entrada direta ou indireta de células vizinhas. Além disso, ensaios in vitro utilizando linhagens celulares imortais apresentam certos benefícios, incluindo a capacidade de proliferação indefinida, custo-benefício e facilidade de manutenção. No entanto, é importante notar que as células primárias imitam mais de perto as respostas fisiológicas normais em comparação com as linhagens celulares. Essa relevância fisiológica é crucial em ensaios funcionais e análises transcriptômicas.
Um dos desafios na obtenção de células primárias, particularmente da medula espinhal de camundongos adultos, está na quantidade e viabilidade das amostras. A medula espinhal adulta, sendo menor que o cérebro e contendo uma quantidade significativa de mielina, apresenta dificuldades únicas. Embora existam vários protocolos publicados detalhando o isolamento de células gliais puras e viáveis de animais neonatais ou do cérebro de camundongos adultos 10,11,12,13, essas metodologias podem não ser adequadas para o estudo de doenças e lesões específicas da medula espinhal. Neste protocolo, oferecemos um procedimento abrangente para isolar eficientemente a micróglia e os astrócitos puros e viáveis da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações a jusante em cultura de células e análises transcriptômicas. Este protocolo tem sido empregado com sucesso para isolar essas células de camundongos adultos com idade entre 10 semanas e 5 meses, demonstrando sua utilidade em vários contextos, incluindo estudos envolvendo camundongos knockout condicionais, respostas a drogas, pesquisa de desenvolvimento e modelos relacionados à idade.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr>24 placa boa <td>Avantor</td><td>10861-558</td><td></td>da<td>cultura de tecidos 24</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol, 98%</td><td>Thermo Fisher</td><td>A18304-0F</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, solução boa Corning</td> 25-037-CI da glicose de <td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>45% de Dihydrochloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos tampados de 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122305</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociação cerebral adulto</td><td>Miltenyi</td><td>103-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microesferas anti-ACSA2</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-679</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Tecnologias</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57BL/6J do tipo selvagem (WT)&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 30 &micro; m filtro</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Contagem (Hemacitômetro)</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-40KU</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>TMO</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DNase para purificação de RNA</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher</td><td>A5209401</td><td></td></tr><tr><td>GFAP anticorpo (camundongo)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-33673</td><td>1:500</td></tr><tr><td>GFAP anticorpo (coelho)</td> <td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>cabra anti-rato 594 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11032</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato 594 IgM</td><td>Invitrogen</td><td>a21044</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho 488 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>a11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Iba1 anticorpo (coelho)</td><td>Wako</td><td>019-1974</td><td>1:500</td></tr><tr><td>MACS Separador</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L Sistema de Bomba</td><td>Thermo Fisher</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Montagem Meio Vector</td><td>Laboratórios</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>MS Colunas</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>O4 Anticorpo</td><td>R& D</td><td>MAB1326</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de vidro plugada de 9"</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico Royal-tek nº 10</td><td>Fisher scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de infusão de veias pequenas, 23 G x 19 mm</td><td>Kawasumi</td><td>D3K2-23G</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de astrócitos puros e microglia da medula espinhal de camundongos adultos para ensaios in vitro e estudos transcriptômicos

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.

Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA.
Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células isoladas de animais neo...

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Nossa pesquisa visa caracterizar populações celulares específicas no sistema nervoso central, especificamente na medula espinhal, utilizando modelos pré-clínicos de doença. E estamos tentando determinar como essas células são afetadas em condições patológicas e em diferentes pontos de tempo. Pode ser desafiador analisar células, especialmente no sistema nervoso central, porque as células do cérebro e da medula espinhal formam uma matriz altamente complexa e tudo está muito bem conectado, então pode ser difícil isolar essas células sem danificar o sistema.Nosso protocolo aborda as limitações nos métodos existentes para estudar doenças da medula espinhal, isolando eficientemente astrócitos viáveis da microglia da medula espinhal de camundongos adultos ricos em mielina. Isso permite a pesquisa in vitro sobre doenças relacionadas à medula espinhal na análise a jusante, preenchendo uma lacuna crucial de pesquisa. Este protocolo apresenta várias vantagens, como a análise de astrócitos e microglia em condições patológicas e em momentos específicos.Ele também se concentra exclusivamente em isolar as células gliais desta medula espinhal adulta sozinho, excluindo o envolvimento cerebral. Isso permite que os pesquisadores estudem patologias da medula espinhal em nível celular.

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Neste vídeo, descrevemos o método para obter uma preparação pura de astrócitos de camundongos recém-nascidos.

Isolamento de astrócitos: um método para obter preparação pura de astrócitos corticais de camundongos

O vídeo demonstra uma técnica para isolar a microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto. Primeiro, o córtex sofre segmentação e homogeneização para remover neurônios e outras células gliais, preservando a microglia. Em seguida, a suspensão celular é exposta a microesferas magnéticas anti-mielina e a um campo magnético, separando efetivamente as células da micróglia e mielóides dos detritos de mielina e células contendo mielina.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

Os astrócitos têm sido reconhecidos como células versáteis que participam em processos biológicos fundamentais, que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais, e reparação do sistema nervoso central. Aqui apresenta-se um processo rápido de obtenção de culturas de astrócitos de rato puros para estudar a biologia desta classe importante de centrais células do sistema nervoso.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.

Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.

Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Aprenda a isolar astrócitos e microglia viáveis da medula espinhal de camundongos adultos usando dissociação enzimática e separação magnética. Este protocolo permite estudos transcriptômicos e cultura celular in vitro.

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Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

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