Name: Análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a analisar a comunicação neural intestino-cérebro em camundongos usando injeção intragástrica de glicose e imagem de dinâmica de cálcio cortical. Este método minimiza trauma cirúrgico.

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Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ochanomizu, Japão (protocolos de estudo em animais 22017). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes para experimentação animal da Universidade de Ochanomizu que estão em conformidade com as Diretrizes Fundamentais para a Conduta Adequada de Experimentos com Animais e Atividades Relacionadas em Instituições de Pesquisa Acadêmica (Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão). Esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados. Este estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes ARRIVE.
1. Preparação de camundongos transgênicos
<ol>
	<li>Para seguir este experimento, use camundongos transgênicos BAC GLT-1-G-CaMP7 # 817 machos e fêmeas adultos, ou seja, camundongos G7NG81724,25 (com mais de 8 semanas). A linhagem de fundo de G7NG817 camundongos25 é C57BL / 6J.</li>
	<li>Aloje os ratos em um ciclo claro/escuro de 12 h / 12 h e crie-os em grupos de até cinco camundongos.</li>
</ol>
2. Criação de cateter
<ol>
	<li>Use uma tesoura para ajustar o tubo de silicone (diâmetro interno de 0,5 mm, diâmetro externo de 1,0 mm) para um comprimento preciso de 7 cm (Figura 1A-a). NOTA: Antes dos procedimentos, tesoura e tubo de silicone foram esterilizados.</li>
	<li>Cole contas de plástico diminutas (diâmetro interno de 3 mm, diâmetro externo de 5 mm) ao tubo adaptado, certificando-se de que estejam situadas a 3 mm de seu terminal (Figura 1A-b). Fixe as contas com segurança usando cola de cianoacrilato (variantes médicas ou padrão são aceitáveis).</li>
	<li>Extirpar o ápice de uma agulha de 23 G e, em seguida, cortar 1,5 cm da ponta da agulha (figura 1A-c).</li>
	<li>Introduza a agulha seccionada de 23 G do passo 2.3 na extremidade do tubo de silicone, oposta ao local onde as esferas foram afixadas (Figura 1A-d).</li>
</ol>
3. Criação do injetor
<ol>
	<li>Use um alicate estéril para extirpar 1 cm da ponta da agulha (Figura 1B-a). NOTA: Certifique-se de que o orifício na extremidade cortada mantenha sua integridade e não fique deformado, pois qualquer distorção pode obstruir o fluxo da solução de injeção.</li>
	<li>Acople a agulha de injeção de 23 G adaptada da etapa 3.1.1 a uma seringa de 2,5 mL (Figura 1B-b).</li>
	<li>Segmentar um tubo de silício com o comprimento necessário (um tubo de silício de 15 cm nesta experiência) e colocá-lo sobre a agulha de injecção de 23 G (figura 1B-c). NOTA: O volume de solução dispensado irá flutuar com base no comprimento da tubulação. Por exemplo, com um tubo de 15 cm, aproximadamente 50 μL de solução permanecerão após o experimento.</li>
	<li>Corte a agulha de injeção de 23 G a 1,5 cm da ponta da agulha.</li>
	<li>Junte a porção seccionada da etapa 3.4 com o cateter de silicone formado na etapa 3.3 (Figura 1B-d). NOTA: Certifique-se de que os orifícios criados nas etapas 3.1 e 3.4 permaneçam sem distorção após a incisão. Se a retificação for necessária, use um alicate para restaurar sua configuração circular.</li>
</ol>
4. Localização gástrica
<ol>
	<li>Administre anestesia ao camundongo por meio de inalação de isoflurano a 3,0% em uma câmara especificada. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
	<li>Transfira delicadamente o camundongo anestesiado da câmara de inalação para a mesa cirúrgica ao verificar o estado anestesiado do camundongo. Forneça suporte térmico durante todo o procedimento.</li>
	<li>Coloque o camundongo em decúbito dorsal, alinhando sua boca próxima ao aparelho de inalação, e module a concentração de isoflurano de 3,0% a 2,0%. NOTA: Desengate o segmento inferior da máscara de isoflurano de sua contraparte superior e ancore a máscara separada (segmento superior) à mesa cirúrgica usando fita adesiva.</li>
	<li>Complemente a cavidade oral, os membros anteriores e os membros posteriores do camundongo à mesa cirúrgica usando fita adesiva. NOTA: Ao fixar o mouse na mesa, erros cirúrgicos devido ao movimento podem ser evitados mesmo se o mouse estiver anestesiado.</li>
	<li>Remova o cabelo do camundongo da parte superior esquerda do abdômen (150% da área ao redor do local da cirurgia) usando creme depilatório. Aplique um analgésico local topicamente no local da cirurgia e aguarde 5 min antes de prosseguir.</li>
	<li>Aplique um gel anestésico local na pele abdominal e aguarde de 5 a 10 min. Em seguida, desinfete a área cirúrgica 3 vezes com rodadas alternadas de iodóforo e etanol a 70%. Confirme a profundidade da anestesia por meio de uma pinça no dedo do pé e cubra o animal com campos cirúrgicos estéreis. Faça uma incisão na pele com aproximadamente 1,5 cm de comprimento (Figura 1C-b), situada 1 cm à direita da mediana abdominal e 5 mm abaixo do apêndice xifóide (Figura 1C-c). Em seguida, crie uma incisão de 1,5 cm na parede abdominal no mesmo local da incisão inicial na pele. NOTA: Tenha cuidado para evitar causar danos ao fígado subjacente.</li>
	<li>Reposicione delicadamente o lobo hepático esquerdo lateralmente usando uma pinça de ponta romba, revelando o estômago abaixo.</li>
</ol>
5. Inserção do cateter
<ol>
	<li>Eleve o estômago e retire-o com cuidado através da incisão. NOTA: Tenha o máximo cuidado para preservar a integridade dos órgãos adjacentes, principalmente o fígado, e evite exercer força indevida no estômago.</li>
	<li>Use uma tesoura para criar uma perfuração diminuta (aproximadamente 1,5 mm de diâmetro) no antro pilórico.</li>
	<li>Introduza o terminal do cateter na perfuração, garantindo que o cordão esteja em contato direto com o antro pilórico. NOTA: O cateter é desinfetado com uma solução de gluconato de clorexidina a 0,1 a 0,5% antes da inserção.</li>
	<li>Cole o cordão do cateter no estômago empregando cola de cianoacrilato de grau médico. NOTA: Certifique-se de que o estômago permaneça solto dos órgãos circundantes.</li>
	<li>Verifique a fixação firme do cateter ao estômago e, em seguida, reposicione delicadamente o estômago em sua localização inata abaixo do lobo hepático esquerdo.</li>
	<li>Costure a parede abdominal, permitindo que o cateter se estenda externamente, usando uma sutura de polidioxanona (PDS). Em seguida, feche a incisão na pele de maneira análoga ao fechamento abdominal.</li>
	<li>Reposicione suavemente o mouse em uma gaiola higienizada. NOTA: Os camundongos pós-operatórios devem ser alojados individualmente. Aplique um analgésico local topicamente no fechamento da ferida e siga os planos analgésicos recomendados pelas diretrizes institucionais locais.</li>
	<li>Permitir um período mínimo de recuperação de 48 h em um ambiente padrão. NOTA: Uma extremidade do cateter inserida no estômago do camundongo é fechada com uma agulha 23G com uma ponta selada para evitar a entrada de substâncias estranhas e evitar mordidas. Como o cateter que se projeta do abdômen é curto, ele evita que o mouse o arraste pela cama, o que pode fazer com que ele se abra ou fique emaranhado.</li>
</ol>
6. Preparação para imagens transcranianas in vivo de Ca2+
<ol>
	<li>Administrar anestesia ao camundongo com isoflurano (indução a 2%; manutenção entre 0,8% e 1,0%).</li>
	<li>Prenda o mouse em uma plataforma estereotáxica usando barras de ouvido auxiliares para mitigar os efeitos da pulsação e da respiração. Em seguida, posicione o mouse sob um microscópio estéreo de fluorescência.</li>
	<li>Utilize um conjunto de filtros de fluorescência azul de banda larga (com excitação a 460-490 nm e emissão a 520 nm) em conjunto com uma fonte de luz de mercúrio.</li>
	<li>Capture as imagens usando uma câmera e processe-as usando o software de imagem designado.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o cabelo do couro cabeludo usando um barbeador elétrico ou creme depilatório. NOTA: Se estiver usando uma navalha, certifique-se de que ela esteja completamente desinfetada e tome cuidado para não cortar a pele.</li>
	<li>Desinfete a superfície do couro cabeludo usando um cotonete ou ferramenta semelhante com uma solução de gluconato de clorexidina diluída a 0,1-0,5%. Em seguida, desinfete com álcool e repita essas rodadas alternadas 3x.</li>
	<li>Aplique um gel anestésico local e aguarde 5-10 min.</li>
	<li>Prepare-se para aplicar cimento acrílico dental.<ol>
		<li>Use uma lâmina de bisturi estéril para cortar o couro cabeludo. Remova completamente o couro cabeludo ou faça um corte reto da parte de trás da cabeça até a testa.</li>
		<li>Use clipes para expor o crânio, estendendo o excesso de pele.</li>
		<li>Use um cotonete para remover o tecido conjuntivo do periósteo.</li>
		<li>Aplique imediatamente o cimento acrílico após a remoção do periósteo. Aja rapidamente para evitar que a superfície do crânio se torne opaca devido à evaporação do osso exposto.</li>
		<li>Aguarde cerca de 5 min para que o cimento seque.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Imagem transcraniana de Ca2+ com administração intraduodenal de glicose
<ol>
	<li>Equilibre a solução experimental e a solução salina à temperatura ambiente. Sujeitar os camundongos a uma restrição alimentar por um período especificado (por exemplo, 2 h).</li>
	<li>Purgue qualquer conteúdo residual dentro do cateter do lado do mouse usando ~ 0,03 mL de solução salina antes de iniciar a injeção.</li>
	<li>Aspire a solução experimental (por exemplo, uma solução de glicose a 10% preparada em 300 μL de água, complementada com 300 μL adicionais de água) para a seringa e, em seguida, conecte-a ao cateter. Determinar a dose óptima da solução adaptada ao objectivo experimental específico. NOTA: Durante esta fase, tenha cuidado para evitar tensão indevida no cateter, o que pode comprometer a anatomia interna do camundongo. Esforce-se para manipular o tubo do lado do mouse com a máxima gentileza. Além disso, certifique-se de que a seringa permaneça desprovida de aspiração de ar após a solução, pois o ar aprisionado e as bolhas podem induzir distensão gastrointestinal.</li>
	<li>Avalie o estado fisiológico do mouse e ative a função de gravação do software de imagem clicando no botão do processo de gravação do aplicativo de software.</li>
	<li>Capture imagens com resolução de 512 x 512 pixels, profundidade de 16 bits e taxa de quadros de 10 Hz. NOTA: Os parâmetros de gravação podem ser ajustados para se alinharem com requisitos experimentais específicos.</li>
	<li>Adquira dados espontâneos (por exemplo, abrangendo 50 s), seguidos pela infusão gradual da solução experimental a uma taxa adaptada ao experimento (aqui, 0,035 mL / s). NOTA: Ao final do experimento, o camundongo será sacrificado prontamente por luxação cervical sob anestesia com isoflurano.</li>
</ol>
8. Processamento e análise de dados de imagem
<ol>
	<li>Compartimentar dados de imagem em 64 x 64 pixels.</li>
	<li>Determine regiões de interesse (ROIs) desenhadas à mão usando ImageJ. Consulte o atlas do cérebro de camundongos para designar ROIs como a área frontal (M2), a área somatossensorial, incluindo o Barril (Somato), a área occipital (Visual) e a região retroesplenial (RSC).</li>
	<li>Use a função MATLAB ReadImageJROI para extrair as coordenadas correspondentes aos ROIs. Acesse a função MATLAB através do link fornecido: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi</li>
	<li>Calcule a taxa média de mudança de intensidade de fluorescência dentro do ROI usando o MATLAB.<ol>
		<li>Defina a taxa de variação da intensidade de fluorescência (ΔF/F) com a equação (1): 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65902/65902eq01.jpg" style="margin: auto;">Características (1) Em que Ft representa o valor da intensidade de fluorescência num momento específico e o valor médio da intensidade desde o início do registo até aos 50 s da injecção é indicado como F0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Considere o atraso na solução injetável que chega ao órgão. Use o valor médio de intensidade abrangendo os três segundos após a injeção como linha de base. Formas de onda alvo que ultrapassam o valor de intensidade basal + 1 DP para análise se ocorrerem 3 s ou mais tarde após a injeção.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Estudando a interação intestino-cérebro por meio de imagens transcranianas de cálcio em camundongos

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<li>Schwalm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+states+shape+the+spatiotemporal+representation+of+local+and+cortex-wide+neural+activity+in+mouse+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).</li>
<li>Ueno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intragastric+infusion+%28iG%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse intragastric infusion (iG) model.</a> Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).</li>
<li>Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-oral+glucose+stimulation+of+intake+and+conditioned+flavor+preference+in+C57BL%2F6J+mice%3A+A+concentration-response+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study.</a> Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Seringa TERUMO de 2,5 mL TERUMO</td><td></td><td>ss-02Sz</td><td></td></tr><tr><td>23 G agulha de injeção</td><td>TERUMO</td><td>4987350390691</td><td></td></tr><tr><td>anestésico (solução para inalação de ISOFLURANO)</td> <td>viatris</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>cotonete</td><td></td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>cola de cianoacrilato (AronArufa A)</td> <td>TOAGOSEI</td><td>7990700Q1022</td><td></td></tr><tr><td>odontológico cimento acrílico C& B&nbsp;</td><td>Sun Medical&nbsp;</td><td>221AABZX00115000</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Kracie</td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>Câmera digital CMOS&nbsp;</td><td>Fotônica de Hamamatsu&nbsp;</td><td>Barra de ouvido ORCA-Spark</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NARISHIGE</td><td>EB-5N</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros (U-MWB2)</td><td>Evident</td><td>U-MWB2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de Tesoura</td><td>Fina Ferramentas de Precisão</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>G7NG817 Mouses</td><td>RIKEN BRC</td><td>RBRC09650</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Hamamatsu Photonics&nbsp;</td><td>HC Image software</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano vaporizador de isoflurano</td><td></td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz (U-HGLGPS)</td><td>Microscopia evidente</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>(MVX10)</td><td>Contas</td> de plástico evidentes <td></td><td></td></tr><tr><td>(diâmetro interno 3 mm, diâmetro externo 5 mm)</td><td></td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>Alicate</td><td></td><td></td><td>empresa local</td></tr><tr><td>Sutura de polidioxanona, monodiox</td><td>Alfresa Pharma</td><td>HR1305MV45-KF2R</td><td>Esta sutura PDS monofilamentar absorvível é empregada para fechar a incisão cirúrgica</td></tr><tr><td>Pinça de extremidade redonda</td><td>F.S.T.&nbsp;</td><td>11617-12</td><td></td></tr><tr><td>solução salina</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>35061311</td><td></td></tr><tr><td>tubo de silicone (diâmetro interno 0,5 mm, diâmetro externo 1,0 mm)</td> <td>COMO UM&nbsp; CORPORATIO</td><td>33151413</td><td>empresa local</td></tr><tr><td>agulha de cirurgia de pequeno porte</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AC03DNT</tr><tr><td>Estágio estereotáxico</td><td>NARISHIGE</td><td>MA-6N</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2%</td><td>Sandoz K.K.</td><td>614429303</td><td>Esta geléia é usada como analgésico local para aliviar a dor cirúrgica</td></tr></tbody></table>

análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose

Real-time Analysis of Gut-brain Neural Communication: Cortex wide Calcium Dynamics in Response to Intestinal Glucose Stimulation

Imagem de Ca2+ largo do córtex transcraniano com um camundongo G7NG817 anestesiado com isoflurano O cateter foi criado seguindo o procedimento ilustrado na Figura 1. Após identificar cuidadosamente a posição do estômago, fixamos o cateter nesse local (Figura 1). Depois de permitir tempo de recuperação suficiente após a inserção do cateter (aproximadamente 48 h), medimos a atividade neural espontânea sob anestesia leve com isoflurano (0,8-1,0%) para estabelecer as alterações na intensidade da fluorescência basal para observações subsequentes de estimulação intestinal. Como resultado, confirmamos os padrões aleatórios de oscilação de Ca2+ que abrangeram todo o córtex (Figura 2A). A Figura 2 fornece exemplos representativos de atividade cerebral espontânea, com os cateteres inseridos previamente. Definimos o tempo do primeiro pico transitório observável de Ca2+ na região M2 após a injeção como 0,0 s. A representação de pseudo cor exibiu o pico desse transiente de Ca2+ como o valor máximo, com o valor médio mais um desvio padrão (1 DP) como o valor mínimo. Ficou claro que os hemisférios esquerdo e direito exibiram atividade síncrona em todas as regiões.
Em seguida, estabelecemos ROIs para caracterizar as ondas dentro de cada área funcional. Conforme mostrado na Figura 2B, apresentamos as mudanças temporais na taxa de intensidade de fluorescência para cada ROI (Figura 2B). Essas oscilações de superfície observadas de Ca2+ seguiram um padrão de supressão de explosão, alternando entre períodos de baixa atividade e mudanças de fluorescência de alta amplitude. Esse padrão de atividade se alinha com descobertas anteriores que mediram simultaneamente o EEG da superfície cortical e a dinâmica do Ca2+ 26.
Apesar das flutuações globais ou regionais de Ca2+ na superfície entre os estados de supressão e explosão, a região cortical específica que inicia o aumento de cálcio pode ser diferente. Como relatado anteriormente, quando um sinal estimula uma região cortical local, espera-se que a área seja ativada, subsequentemente levando a uma mudança global no estado cortical27,28.
Alterações na dinâmica do córtex Ca2+ após injeção intragástrica de glicose Em seguida, para elucidar como a administração de glicose ou água influencia a atividade cortical, monitoramos a dinâmica do Ca2+ em todo o córtex durante e após a injeção. Como resultado, encontramos alterações na dinâmica cortical de Ca2+ após a injeção intragástrica de glicose. Em contraste com a atividade espontânea ilustrada em diversas regiões de ativação cortical, observamos ativação imediata na área pré-frontal ou no córtex motor secundário (M2) após injeção direta de glicose no intestino através do cateter, um efeito não induzido pela injeção intragástrica de água (Figura 3A-C). Além disso, observamos que esses eventos transitórios e proeminentes de Ca2+ tenderam a ocorrer continuamente por aproximadamente 10 s após a injeção intragástrica de glicose. Tais fenômenos persistentes não foram aparentes quando a água foi administrada (Figura 3D-F).
Os eventos de Ca2+ em cada ROI foram caracterizados pelo cálculo da razão de mudança da intensidade de fluorescência, usando o córtex auditivo (Referência) como referência, no primeiro pico ocorrido dentro de 4-8 s após o término da administração de glicose. Como resultado, foi observada uma mudança significativa quando a glicose foi injetada após a comparação da resposta na região M2 usando o córtex auditivo como referência antes e após a injeção.
Em contraste, essa mudança não foi observada quando a água foi injetada (Figura 3G, água N = 7: antes vs. injeção, 2,38 ± 2,53 vs. 2,05 ± 1,84, p &gt; 0,05; glicose N = 7: antes vs. injeção, 2,48 ± 0,97 vs. 3,76 ± 2,76, p &lt; 0,01, teste dos postos sinalizados de Wilcoxon). Em seguida, definindo os níveis de ativação em cada região cortical pela razão entre o valor de após a injeção e antes da injeção, foi observada uma diferença significativa apenas na região M2 (Figura 3H, M2: 0,92 ± 0,89 vs. 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Somato: 0,95 ± 0,076 vs. 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Visual: 0,92 ± 0,3 vs. 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 vs. 1,10 ± 0,27, p = 0,60, teste t).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig01.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do método. (A) Criação do cateter: (a) Corte o tubo de silicone. (b) Fixe um cordão de plástico no tubo de silício usando cola médica de cianoacrilato. (c) Corte a agulha de 23 G a 1,5 cm da ponta. (d) Prenda a extremidade cortada da agulha ao tubo de silicone. (B) Conjunto do injetor: (a) Apare uma agulha de injeção de 23 G em 1 cm. (b) Conecte a agulha de injeção aparada a uma seringa de 2,5 mL. c) Bainhar a secção cortada da agulha de injecção com um tubo de silicone. d) Corte a agulha de 23 G a 1,5 cm da ponta. (e) Prenda a extremidade cortada da agulha ao tubo de silicone. (C) Procedimento cirúrgico: (a) Depilar a área cirúrgica. (b) Incisar a pele e a parede abdominal com um comprimento de aproximadamente 1,5 cm. (c) Criar uma pequena perfuração (cerca de 1,5 mm de diâmetro) no antro pilórico usando uma tesoura e inserir o cateter (tubo de silicone). Prenda o cateter ao antro pilórico usando cola médica de cianoacrilato. (d) Costure a parede abdominal e a pele usando material de sutura de seda 5/0 e agulha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig02.jpg"> 
Figura 2: Oscilações espontâneas de Ca2+ em camundongos G7NG817 com um cateter acoplado. (A) Um exemplo representativo de oscilações de Ca2+ em todo o córtex exibidas em intervalos de 0,2 s. As mudanças na intensidade da fluorescência são representadas com uma sobreposição de pseudo-cor. A janela de tempo circundada pela linha tracejada em B mostra o primeiro transiente Ca2+ que aparece, com seu pico definido como tempo 0. A representação de pseudo cor usa o pico desse transiente de Ca2+ como o valor máximo e a média +1 DP como o valor mínimo. (B) Mudanças de séries temporais na intensidade de fluorescência para cada ROI no exemplo. As cores das linhas correspondem a diferentes áreas corticais: o vermelho representa M2; magenta representa a área somatossensorial (Somato); azul representa a área visual (Visual); e verde representa a região retro esplênica. A tira colorida salmão mostra o tempo de injeção. (C) Um único pico dentro do contorno tracejado é isolado e exibido em uma visão ampliada. Abreviaturas: DP = desvio padrão; ROI = região de interesse; RSC = região retro esplênica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65902/65902fig03.jpg"> 
Figura 3: Resposta de Ca2+ ampla do córtex durante/após a injeção de glicose ou água. (A) Um exemplo representativo de administração de glicose exibido em intervalos de 0,2 s. As mudanças na intensidade da fluorescência são representadas com uma sobreposição de pseudo-cor. A janela de tempo circundada pela linha tracejada em B mostra o primeiro transiente de Ca2+ que aparece após a injeção, com seu pico definido como tempo 0. A representação de pseudo-cor é baseada no pico do primeiro transiente de Ca2+ após a injeção como o valor máximo e a média +1 DP como o valor mínimo. (B) Mudanças de séries temporais de intensidade de fluorescência para cada ROI no exemplo. As cores das linhas correspondem a diferentes áreas corticais: vermelho representa M2, magenta representa a área somatossensorial (Somato), azul representa a área visual (Visual) e verde representa a região retroesplenial. (C) Um único pico dentro do contorno tracejado é isolado e exibido em uma visão ampliada. Analisar onda de cálcio alvo é a primeira onda que apareceu dentro de 4-8 s após a injeção. (D) Um exemplo representativo de injeção de água como dados de controle de glicose. (E) Mudanças de séries temporais na intensidade de fluorescência para cada ROI no exemplo. As cores das linhas são como em B. (F) Um único pico dentro do contorno tracejado é isolado e exibido em uma visão ampliada. Analisar onda de cálcio alvo é a primeira onda que apareceu dentro de 4-8 s após a injeção. (G) Comparação da atividade espontânea de M2 (antes) e resposta após a injeção (injetada). A intensidade média de fluorescência muda ao longo de 50 s antes da injeção, e a resposta de pico na região M2 entre 4 s e 8 s após a injeção foi calculada, usando o córtex auditivo como referência. (H) Comparação dos níveis de ativação em cada região cortical quando água ou glicose foram administradas. A razão entre o valor pós-injeção e antes da injeção, conforme determinado em G, foi calculada para cada região. N.S. representa não significativo (p &gt; 0,05). ** &lt;0,01. As barras de erro são definidas como o erro padrão da média. Abreviaturas: DP = desvio padrão; ROI = região de interesse; RSC = região retro esplênica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65902/65902fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose

Communication between the gastrointestinal tract and the brain after nutrient absorption plays an essential role in food preference, metabolism, and ...

real-time-analysis-gut-brain-neural-communication-cortex-wide-calcium

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imagem do sistema nervoso entérico. J. Vis. Exp..  (2015)Este vídeo demonstra cálcio imagens para visualizar e analisar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações do plexo mioentérico do cólon de camundongos.

Imagem de cálcio das atividades do neurônio entérico e da glia em um plexo mioentérico colônico de camundongo

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Apresentamos a preparação de fatias agudas de tecido pancreático e seu uso em microscopia de escaneamento a laser confocal para estudar a dinâmica do cálcio simultaneamente em um grande número de células vivas, durante longos períodos de tempo, e com alta resolução espástica.

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

neuroHuMiX é um modelo avançado de gut-on-a-chip para estudar as interações de células bacterianas, epiteliais e neuronais sob condições de co-cultura proximal e representativa. Este modelo permite desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à comunicação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso.

Um modelo Gut-on-a-Chip para estudar o eixo microbioma intestinal-sistema nervoso

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

Aprenda a analisar a comunicação neural intestino-cérebro em camundongos usando injeção intragástrica de glicose e imagem de dinâmica de cálcio cortical. Este método minimiza trauma cirúrgico.

Análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose (Vídeo) | JoVE Journal

Análise em tempo real da comunicação neural intestino-cérebro: dinâmica do cálcio em todo o córtex em resposta à estimulação intestinal da glicose

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