Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Uma das terapias-alvo mais eficazes contra o câncer é baseada em anticorpos como o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe. A ação anticancerígena do trastuzumabe envolve citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, ADCC, por células natural killer ou NK. A compreensão dos mecanismos que regulam a sensibilidade das células cancerosas à terapia com anticorpos anti-receptor do fator de crescimento, com especial atenção ao ADCC, pode ser crucial para o desenvolvimento de novas modalidades de tratamento mais eficientes.

Modelos 3D, como esferoides de células cancerosas, mostraram-se superiores na previsão de respostas imunes de tumores a várias terapias anticâncer. Portanto, montamos um modelo esferoide ADCC usando a linhagem celular natural killer NK92, células de carcinoma de mama JIMT-1 que expressam GFP e trastuzumabe. Configuramos o sistema de ensaio ADCC induzindo as células anti-HER2-positivas do carcinoma de mama JIMT-1 a formar agrupamentos tridimensionais chamados esferoides.

A linhagem celular JIMT-1 utilizada nos experimentos expressa de forma estável a proteína verde fluorescente. Iniciamos o experimento preparando a placa de 96 poços para a formação de esferoides. Para criar um fundo em forma de U e repelente de células, cubra a placa de 96 poços com uma solução de agarose a 0,5% em PBS.

Incubar a placa à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 a 45 minutos. Enquanto isso, tripsinização e contagem de células JIMT-1 para semeadura celular. Lave as células com dois mililitros de PBS estéril.

Adicionar dois mililitros de tripsina-EDTA ao balão e voltar a colocá-lo numa incubadora de CO2 durante 10 minutos. Após a incubação, toque no balão para verificar se as células JIMT-1 se destacaram. Pare a digestão com dois mililitros de meio JIMT-1 e colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.

Conte as células com Azul de Tripano numa câmara de Burker e ajuste o número de células para 20.000 células por ml. Seme as células na placa de 96 poços pipetando a suspensão de células de 100 microlitros em cada poço para a formação de esferoides. Deixe as células se amontoarem durante o tempo de incubação de três dias a 37 graus em uma incubadora de CO2.

Verifique o tamanho e a forma dos esferoides regularmente com um microscópio invertido. No terceiro dia após a indução dos esferoides, revestir a placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços com uma solução de Pluronic F-127 em DMSO. O revestimento é crucial para evitar a fixação de esferoides JIMT-1 EGFP à superfície de vidro ou à placa.

Após um período de incubação de 45 minutos à temperatura ambiente, aspirar a solução de revestimento e lavar os poços duas vezes com meio DMEM F12 sem soro. Transfira os esferoides para a placa de peneiramento de alto conteúdo de 96 poços em triplicatas usando uma pipeta de um mililitro. Adicione sunitinibe aos poços na concentração de 40 micromolares em 10 microlitros por poço e pipete o meio JIMT-1 fresco para os poços de controle, a fim de aumentar o volume.

Incubar a placa por uma hora em uma incubadora de CO2 a 37 graus. Enquanto a incubação dos esferoides pré-tratados estiver em andamento, colete as células NK92 do frasco em um tubo de 15 mililitros. Conte as células com Azul de Tripano em uma câmara de Burker e ajuste o número de células para atingir uma relação efetor-alvo de 20 para 1.

Manchar as células NK com uma solução de 10 micromolares de CellTracker Blue e colocá-las em uma incubadora de CO2 por uma hora a 37 graus. Para lavar o excesso do corante, centrifugar as células NK duas vezes a 150 RCF por três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células em mídia JIMT-1 fresca.

Adicione as células NK coradas aos esferoides JIMT-1 EGFP alvo pipetando 55 microlitros por poço juntamente com o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe. Diluir o trastuzumab em meio JIMT-1 para atingir uma concentração de 10 microgramas por ml. Adicione os 110 microlitros de meio JIMT-1 fresco aos poços de controle e incube a placa por 24 horas em uma incubadora de CO2 a 37 graus.

Como resultado, o volume total de tratamento adicionado para o ADCC é de 110 microlitros, e a concentração final de sunitinibe é de 20 micromoles por litro. Para detectar e medir a morte celular apoptótica após os tratamentos, corar os esferoides com um conjugado Annexin V Alexa Fluor 647 por uma hora em meio JIMT-1. Após o término das etapas experimentais, transferir a placa para o dispositivo de análise de alto conteúdo.

A placa é fotografada 24 horas após a adição dos fatores NK às células-alvo. Para geração de imagens, estamos usando o analisador de alto conteúdo e um software de análise de imagem. Selecione o tipo de microplaca na lista de placas usando a opção Tipo de placa.

Use uma placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços. Selecione dois picos de foco automático como os ensaios realizados em placas com objetiva de 10x com abertura numérica de 0,3, usando as opções de foco automático e objetivo, respectivamente. Escolha o modo Confocal com a opção OptiMode e aplique Binning 2 ao uso da opção Binning.

Para esferoides de imagem, selecione os canais apropriados usando a opção Seleção de canal. Para detectar as células JIMT-1 transfundidas por EGFP, escolha EGFP com tempo de integração de 200 milissegundos, potência de laser de 50%, altura da pilha de dois micrômetros, excitação de 488 nanômetros e comprimentos de onda de emissão de 500 e 550 nanômetros. E para detectar células apoptóticas, use Alexa 647 com tempo de integração de 100 milissegundos, potência de laser de 50%, altura de pilha de 10 micrômetros, excitação de 640 nanômetros, comprimentos de onda de emissão de 650 e 760 nanômetros.

Para visualizar as células NK dentro dos esferoides, escolha o seguinte canal, DAPI com tempo de integração de 100 milissegundos, potência de laser de 50%, altura da pilha de dois micrômetros, excitação de 405 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 435 e 418 nanômetros. Na opção Seleção de layout, selecione pilhas Z, pois as células nos esferoides tendem a estar em diferentes planos focais do microscópio. 10 planos com distância de 10 micrômetros são suficientes para cobrir toda a região esferoide.

Defina os valores do primeiro plano e do último plano em 0 micrômetro e 90 micrômetros, respectivamente. Antes de iniciar a medição, imagens de amostra podem ser tiradas com a função Snapshot para verificar as configurações corretas. Defina o número de poços e campos para geração de imagens usando a opção Layout definido.

Identifique os esferoides pela fluorescência EGFP ou células JIMT-1 usando a opção Região de textura fina e filtre-os por tamanho. Remova objetos de borda usando o módulo Selecionar População. Uma vez que as células positivas para anexina aparecem nos esferoides periféricos, meça a intensidade da anexina no anel apoptótico.

No módulo Selecionar Região, defina a borda externa como menos 90. Valores expressos de intensidade de anexina como intensidade média. Como indicado pela coloração de Anexina V, a adição de células NK e trastuzumabe às células JIMT-1 causou morte celular nos esferoides tumorais.

Células apoptóticas positivas para anexina emergiram na zona periférica dos esferoides. Na ausência de trastuzumabe, entretanto, as células NK não desencadearam apoptose de células tumorais. Para distinguir entre os efeitos diretos ou mediados pelo ADCC do trastuzumabe, o trastuzumabe-Fab2 sem capacidade de ligação à região FC foi usado neste estudo como controle negativo.

Como o trastuzumabe-Fab2 foi ineficaz nesse modelo, é provável que a morte celular tumoral seja mediada pelo ADCC. Além disso, o pré-tratamento com sunitinibe reduziu a coloração de Anexina V nos esferoides, confirmando a resistência ao ADCC induzida pelo sunitinibe e revelando a prevenção de morte celular apoptótica em esferoides JIMT-1 co-incubados com células NK e trastuzumabe. Esses dados confirmaram o efeito citoprotetor do sunitinibe no modelo ADCC e requerem cautela quanto às potenciais combinações de imunoterapias baseadas em ADCC e sunitinibe.

Em resumo, nosso ensaio HCS pode ser adequado para a identificação de compostos que aumentam o ADCC.