Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos
November 17th, 2023
O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.
Nosso grupo está interessado no sistema quimio-sensorial de mosquitos. Esperamos que, ao atingir um mosquito com paladar e olfato, possamos impedir que ele nos encontre e nos morda. A hibridização fluorescente in situ por reação em cadeia de hibridização é um desenvolvimento recente.
Essa tecnologia é altamente sensível, robusta e capaz de multiplexar vários alvos gênicos de forma que possamos visualizar a expressão e localização desses genes simultaneamente dentro de seu ambiente nativo. A transcriptômica especial é um método de ponta utilizado no campo da biologia espacial. Essa tecnologia é capaz de multiplexar milhares de genes, e é possível visualizar a expressão desses genes simultaneamente.
Nosso protocolo nos permite visualizar diretamente quais neurônios na antena expressam qualquer um dos cerca de 50 possíveis receptores ionotrópicos. Isso nos fornece um roteiro fundamental para orientar nossa compreensão de como esses receptores de fator clássicos podem mediar comportamentos. Os neurônios olfativos dentro dos órgãos olfativos de um inseto, como a antena, são tipicamente enterrados dentro de uma casca quitinosa protetora.
Isso torna a visualização da expressão do receptor olfatório nesses neurônios muito desafiadora. Nosso protocolo usa uma combinação de tratamentos com quitinase e protocolos de fluorescência e transparência de última geração para superar esses desafios.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para reação de cadeia de hibridização RNA hibridização in situ por fluorescência completa (HCR RNA WM-FISH), visando elucidar a expressão espacial e celular dos genes de receptores quimiossensoriais em antenas e palpos maxilares de mosquitos. Ao utilizar técnicas fluorescentes avançadas, o estudo lança luz sobre os sistemas quimiossensoriais e suas potenciais implicações para o comportamento do mosquito e interação com seu ambiente.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Entomologia
Fundamento
- O sistema quimiossensorial dos mosquitos é crucial para o comportamento.
- Técnicas de reação de cadeia de hibridização permitem a visualização multiplex da expressão gênica.
- Visualizar receptores olfativos é desafiador devido a restrições anatômicas.
- Tratamentos com quitinase auxiliam na superação de barreiras para visualização de tecidos.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para visualizar múltiplos genes de receptores quimiossensoriais simultaneamente.
- Fornecer insights sobre os padrões de localização e expressão desses receptores.
- Facilitar uma melhor compreensão dos comportamentos sensoriais em mosquitos.
Métodos Utilizados
- O protocolo emprega técnicas de hibridização de cadeia de reação RNA WM-FISH.
- Utiliza o mosquito Anopheles como modelo biológico.
- Nenhum fluxo de trabalho multiômico específico foi mencionado.
- Passos-chave incluem fixação de tecido, desidratação e hibridização, com tempos de incubação precisos em temperaturas variadas.
- A imagem segue a montagem das preparações para visualização.
Principais Resultados
- Padrões de expressão de vários receptores ionotrópicos nas antenas do mosquito foram elucidados.
- Diferenças notáveis na abundância de receptores foram observadas, com IR64a sendo significativamente mais expresso.
- Colocalização de várias famílias de receptores indicou interações complexas dentro dos tecidos quimiossensoriais.
- Os achados contribuem para a compreensão de como esses receptores mediam comportamentos sensoriais.
Conclusões
- Este estudo permite uma compreensão mais profunda dos sistemas quimiossensoriais dos mosquitos através de técnicas avançadas de visualização.
- Os métodos desenvolvidos podem facilitar pesquisas adicionais sobre o papel dos receptores sensoriais no comportamento dos mosquitos.
- Os insights obtidos podem informar estratégias para controlar as interações dos mosquitos com humanos.
