Name: Detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprenda a detectar e quantificar mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa usando cromatografia em camada fina e método do orcinol. Este protocolo preciso e reprodutível não requer equipamentos caros.

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O laboratório do GSCh é apoiado em parte por IN201222 de bolsas do Programa de Apoio a Projetos de Investigação e Inovação Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

Este procedimento está esquematizado na Figura Suplementar 1. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Detecção de mRL e dRL em sobrenadantes de cultura de P. aeruginosa usando TLC
<ol><li>Comece com o caldo centrifugado da cepa de interesse de P. aeruginosa , cultivada em meio líquido por 24 h (para atingir a fase estacionária de crescimento onde o RL é produzido). Normalmente, essas culturas contêm 1 x 109 bactérias por mL.</li>
	<li>Ajustar o pH da cultura para 2 utilizando HCl concentrado.</li>
	<li>Colocar 5 ml do sobrenadante de cultura acidificado num tubo de polipropileno de 50 ml e adicionar 5 ml de uma mistura de clorofórmio:metanol 2:1.</li>
	<li>Agite o tubo por inversão três vezes, cada vez por 10 s, e deixe o tubo sem inversão por 2 min entre cada agitação.</li>
	<li>Deixar o tubo sem agitação durante cerca de 3 h até que as duas fases estejam separadas, ou centrifugar o tubo durante 10 min a 3.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Transferir a fase orgânica (camada inferior) para um tubo limpo e deixar o tubo numa coifa de extracção até à secura.</li>
	<li>Repita o processo a partir da etapa 1.3, colocando a fase orgânica do segundo clorofórmio: extração de metanol, no tubo que foi usado na primeira extração.</li>
	<li>Evapore a fase orgânica até restarem 1 mL ou 1,5 mL. Transfira esse volume para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e evapore o solvente até a secura durante a noite.</li>
	<li>Adicione 50 μL de metanol ao tubo seco para ressuspender RL.</li>
	<li>Realize cromatografia em camada fina em placas de sílica gel. NOTA: O tamanho da placa TLC deve ser cortado de acordo com o número de amostras que serão analisadas. Cada amostra deve ser aplicada a 1,5 cm, e o ponto de aplicação deve estar a 1 cm da borda da placa (desenhe uma linha horizontal com um lápis).</li>
	<li>Aplique 5 μL de cada amostra usando uma micropipeta de 10 μL.</li>
	<li>A fase líquida da TLC consiste em uma mistura 65:15:2 de clorofórmio: metanol: ácido acético. Para preparar 35 mL dessa mistura, misture 26 mL de clorofórmio, 6 mL de metanol e 0,8 mL de uma solução estoque de ácido acético a 20%. Misture esses solventes e coloque-os na câmara fechada de TLC por pelo menos 10 minutos antes de iniciar a cromatografia, para que a atmosfera fique saturada com os solventes voláteis.</li>
	<li>Coloque a placa TLC na câmara, evitando o contato com o ponto onde as amostras foram aplicadas.</li>
	<li>Feche a câmara e deixe o TLC até que o solvente atinja 1 cm antes da borda da placa. Neste ponto, retire a placa e deixe secar (um fluxo de ar pode ser aplicado para acelerar o processo).</li>
	<li>Preparar uma solução de α-naftol dissolvendo 5 g deste composto em 33 ml de etanol. Depois dissolvido, adicione 127,5 mL de etanol, 12,6 mL de água e 20,5 mL de H2SO4 frio.</li>
	<li>Para detectar a presença de mRL e dRL, pulverize a solução de α-naftol na placa da coifa de extração e coloque a placa pulverizada em uma estufa a 85 °C por vários minutos até que a marca rosada de RL seja aparente.</li>
	<li>Use uma imagem do TLC para calcular a proporção de mono e di-RL presente em cada amostra usando um software que detecta a densidade de cada ponto.</li>
</ol>2. Quantificação da quantidade total de RL medindo os equivalentes ramnose presentes no biossurfactante
<ol><li>Coloque 1,2 mL de uma cultura em fase estacionária (cultivada por 24 h) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue por 3 min a 3.000 x g a 4 ° C. Recolher o sobrenadante num tubo limpo.</li>
	<li>Transfira 333 μL para um tubo limpo (execute esta etapa em triplicata) e adicione 1 mL de éter.</li>
	<li>Misture vigorosamente em um vórtice por 30 s. Repita este procedimento com um tubo de cada vez.</li>
	<li>Centrifugue por 2 min a 3.000 x g a 4 °C. Recolher a fase orgânica (fase superior), transferi-la para um tubo limpo e deixá-la aberta na coifa até à secura.</li>
	<li>Repita a extração com éter conforme descrito na etapa 2.2. Repita as etapas 2.3 e 2.4.</li>
	<li>Depois de completamente seco, adicione 1 mL de água a cada tubo. Deixe os tubos por 12 h para permitir que o RL hidrate e, em seguida, agite vigorosamente no vórtice.</li>
	<li>Coloque um frasco limpo no gelo por 5 min (pois é uma reação exotérmica). Prepare uma solução de 60% H2SO4 (proteja o frasco da luz).</li>
	<li>Em um tubo limpo, prepare uma solução de orcinol a 1,6% em água destilada. Para preparar o reagente de orcinol, misture 4,4 mL da solução de 60% H2SO4 com 0,6 mL da solução de orcinol a 1,6%.</li>
	<li>Calcular o volume final do reagente de orcinol necessário. Adicionar 900 μL deste reagente a cada amostra e a cada concentração da curva de calibração, utilizando diferentes concentrações de ramnose (normalmente, utilizam-se 9 concentrações de ramnose na faixa de 1 μg/mL a 9 μg/mL), e uma com 100 μL de água, garantindo que todas sejam realizadas em triplicata.</li>
	<li>Adicionar 100 μl de cada amostra de RL a 900 μl do reagente de orcinol num tubo de vidro e misturar as duas soluções.</li>
	<li>Incubar durante 30 min em banho-maria pré-aquecido a 80 °C.</li>
	<li>Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ler a absorvância das amostras e a curva de calibração a 421 nm utilizando uma célula de quartzo.</li>
	<li>Calcular a concentração de ramnose em cada amostra interpolando a absorvância na curva de calibração e considerando o volume utilizado para a determinação.</li>
	<li>Para calcular a concentração de μM, divida a concentração obtida em μg/mL por 182,2 (o peso molecular da ramnose) e multiplique por 1000.</li>
</ol>

Análise comparativa da produção de ramnolipídios em cepas de Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lifestyle%3A+A+paradigm+for+adaptation%2C+survival%2C+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Infection+and+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence.</a> Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).</li>
<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+New+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li>
<li>Williams, P., Cámara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+and+environmental+adaptation+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+a+tale+of+regulatory+networks+and+multifunctional+signal+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).</li>
<li>Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+produced+by+Pseudomonas%3A+From+molecular+genetics+to+the+market%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology+%28MBT%29%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market.</a> Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).</li>
<li>Freschi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+pan-genome+provides+new+insights+on+its+population+structure%2C+horizontal+gene+transfer%2C+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).</li>
<li>Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origins+of+Pseudomonas+aeruginosa+phylogroups+by+diversity+and+evolutionary+analysis+of+important+pathogenic+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Diversity%22%5BJournal%5D)">Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes.</a> Diversity. 14 (5), 345(2022).</li>
<li>Déziel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+analysis+of+mixtures+of+rhamnolipids+produced+by+Paeudomonas+aeruginosa+strain+57RP+grown+on+mannitol+or+naphthalene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysic+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene.</a> Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).</li>
<li>Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids%3A+Diversity+of+structures%2C+microbial+origins%2C+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).</li>
<li>Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+rhamnolipids+in+bacteria+other+than+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).</li>
<li>Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFilbig%2C+M+%22Biosurfactants.+Foundations+and+Frontiers+in+Enzymology%22">Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology</a>. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).</li>
<li>Noll, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+for+sustainable+biosurfactant+production%3A+Techno-economic+and+environmental+assessment+of+a+rhamnolipid+production+process%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process.</a> Bioresource Technology. 25, 101767(2024).</li>
<li>García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PqsR-independent+quorum-sensing+response+of+Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+outlier-strain+reveals+new+insights+on+the+PqsE+effect+on+RhlR+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity.</a> Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).</li>
<li>Grosso-Becerra, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+is+a+non-virulent+strain+suitable+for+mono-rhamnolipids+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).</li>
<li>Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+rhamnolipids+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+by+redirection+of+the+carbon+flux+from+polyhydroxyalcanoate+synthesis+and+overexpression+of+the+rhlAB-R+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon.</a> Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).</li>
<li>Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZibek%2C+S+%22Biosurfactants+for+a+Biobased.+Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22">Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology</a>. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).</li>
<li>Twigg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biosurfactant+research%3A+time+to+improve+the+rigour+in+the+reporting+of+synthesis%2C+functional+characterization+and+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development.</a> Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).</li>
<li>Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+colony+thin+layer+chromatography+and+rapid+characterization+of+Serratia+marscescens+wetting+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents.</a> Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).</li>
<li>Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constituent+analyses+of+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+on+Carbohydrate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Constituent analyses of glycosaminoglycans.</a> Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).</li>
<li>Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rhamnolipids+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+after+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytic+and+Bioanalytic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction.</a> Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).</li>
<li>Rahim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+rhlC+gene+that+encodes+rhamnosyltransferase+2%2C+an+enzyme+responsible+for+di-rhamnolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis.</a> Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).</li>
<li>Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+rhamnolipid+production%3A+A+critical+re-evaluation+of+published+data+and+suggested+future+publication+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).</li>
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<li>Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+investigaction+into+the+origin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA14-old+but+not+lost%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).</li>
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<li>Zhang, Y., Miller, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+octadecane+dispersion+and+biodegradation+by+a+Pseudomonas+rhamnolipid+surfactant+%28biosurfactant%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant).</a> Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).</li>
<li>Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+for+the+identification+and+quantification+of+rhamnolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Pseudomonas+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids.</a> Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).</li>
<li>Lee, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+reveals+that+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+is+combinatorial%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial.</a> Genome Biology. 7 (10), 90(2006).</li>
<li>Kubicki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+assay+for+screening+and+quantification+of+biosurfactants+in+microbial+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

O método mais preciso para detectar e quantificar o RL é a HPLC acoplada à espectrometria de massa (MS)7,8,27; no entanto, requer equipamentos especializados e caros que podem não ser acessíveis a muitos pesquisadores. Os métodos aqui descritos podem ser realizados rotineiramente com materiais e equipamentos básicos de laboratório para detectar e estimar as concentrações de RL, mas apresentam algumas limitações, particularmente sua imprecisão na determinação de misturas de mRL e dRL. Além disso, a preparação da amostra utilizada para quantificação do RL deve ser cuidadosamente executada. As culturas utilizadas para detecção e quantificação de RL não devem estar na fase estacionária tardia, pois as células podem ser agregadas ou lisadas, resultando em suspensões celulares não homogêneas que podem causar variabilidade nos resultados obtidos. Além disso, detritos celulares podem interferir no método orcinol.
Resultados precisos podem ser obtidos quando o protocolo descrito é realizado com controles apropriados, como uma cepa de Pseudomonas aeruginosa incapaz de produzir RL (como o mutante PAO1 ΔrhlA 20 usado neste trabalho, Figura 2). Esses resultados são úteis para caracterizar diferentes isolados de P. aeruginosa 12,13, modificar geneticamente cepas para aumentar a produção de RL14 ou estudar a genética molecular da produção de RL por vários isolados de P. aeruginosa 12.
Assim, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para caracterizar cepas de Pseudomonas aeruginosa quanto à produção de fatores de virulência e avaliar seu potencial biotecnológico, especialmente nos estágios iniciais de investigação. É importante notar que esses métodos não pretendem substituir técnicas como HPLC/MS, mas sim técnicas acessíveis para caracterização inicial de cepas e manipulação genética de cepas de P. aeruginosa .
Além disso, se o foco da pesquisa for a produção de RL para fins biomédicos, é crucial reconhecer que a produção de RL é apenas um dos vários fatores produzidos por Pseudomonas aeruginosa. Além disso, o tipo de RL produzido ou a quantidade de sua produção não está estritamente correlacionado com a virulência de uma cepa específica, pois a virulência é influenciada por múltiplos fatores28.
Em relação à reprodutibilidade dos métodos aqui descritos, atenção especial deve ser dada na obtenção das fases orgânicas, tanto na detecção de RL por TLC (etapa 1.6) quanto na medição de RL usando o método do orcinol (etapa 2.4). Mesmo uma pequena quantidade da outra fase tomada durante a extração pode levar a uma variação considerável nos resultados obtidos. A extração de RL do sobrenadante da cultura é uma etapa crítica para alcançar resultados confiáveis e reprodutíveis com o método do orcinol. É crucial que, ao coletar a fase orgânica, a interfase e a fase líquida sejam excluídas. Se uma fase etérea não estiver completamente seca em 3 h, provavelmente contém água, necessitando de uma nova extração.
O uso do método do orcinol para quantificação de RL tem sido debatido, com argumentos contra sua acurácia e especificidade. Alegou-se que os RL são frequentemente superestimados e o método não é específico, pois o orcinol pode reagir com diferentes açúcares, não apenas com ramnose. Os dados atuais demonstram que, se os RL forem extraídos eficientemente do sobrenadante da cultura, essa técnica é específica, como mostrado pela falta de reação quando o mutante rhlA é usado como controle negativo. No entanto, para fornecer evidências adicionais da precisão do método na detecção, independentemente do procedimento de extração, detectamos um padrão dRL por UPLC-MS/MS conforme descrito anteriormente27 e comparamos os resultados obtidos com o método orcinol18 (Arquivo Suplementar 1, Figura 4A). Encontramos, conforme relatado18, uma correlação muito boa entre a concentração de RL medida usando este método, onde cada concentração de μM de dRL detectada corresponde a aproximadamente duas vezes a absorbância a 421 nm que a mesma concentração de μM de ramnose ( Figura 4B , C ). Este experimento de controle demonstra claramente a precisão deste método para quantificação de RL.
No entanto, devido ao desafio de medir a concentração de misturas de mRL e dRL com o método do orcinol, a maioria das publicações relata os resultados como equivalentes de ramnose em RL. Este valor pode não ter uma correlação direta com a concentração real de RL, conforme ilustrado nos exemplos aqui apresentados, mas, no entanto, serve como um meio útil de comparar as quantidades de RL em diferentes condições, especialmente quando se usa a mesma cepa de P. aeruginosa .
Um método alternativo para quantificação de mRL e dRL foi relatado, baseado na solubilização do corante hidrofóbico Victoria Pure Blue BO, comumente usado em canetas esferográficas29. Este método é rápido e barato. No entanto, este protocolo foi desenvolvido para quantificar a produção heteróloga de RL por P. putida e não é viável para uso com RL produzido por P. aeruginosa, pois a expressão da toxina azul piocianina interfere neste método.
Em resumo, os métodos aqui descritos oferecem uma alternativa viável para a detecção e quantificação de RL produzida por P. aeruginosa que não requerem equipamentos sofisticados e caros. Eles fornecem uma abordagem prática para os pesquisadores avaliarem a produção de RL em uma variedade de ambientes experimentais.

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria ambiental e um patógeno oportunista de grande preocupação devido à sua produção de características associadas à virulência e sua alta resistência a antibióticos 1,2. Um metabólito secundário característico produzido por essa bactéria é o biossurfactante RL, que é produzido de forma coordenada com várias características associadas à virulência, como a fenazina piocianina, um antibiótico com atividade redox, e a protease elastase3. As propriedades tensioativas e emulsificantes do RL têm sido exploradas em diferentes aplicações industriais e atualmente são comercializadas4.
A maioria das cepas de P. aeruginosa, pertencentes aos filogrupos 1 e 2, produz dois tipos de RL: mRL, que consiste em uma porção de ramnose ligada a um dímero de ácido graxo principalmente de 10 carbonos, e dRL, que contém uma porção de ramnose adicional ligada à primeira ramnose4 (ver Figura 1). No entanto, foi relatado que dois filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 e 5) produzem apenas mRL 5,6. Os dois tipos de RL contêm uma mistura de dímeros de ácidos graxos, que, como mencionado, são principalmente C10-C10, mas proporções menores de moléculas contendo dímeros C12-C10, C12-C12 e C10-C12:1 também são produzidas. A caracterização dos congêneres RL produzidos por diferentes cepas usando HPLC MS/MS tem sido relatada 7,8. Os métodos descritos neste trabalho só podem diferenciar entre mRL e dRL, mas não podem ser usados para a caracterização dos congêneres RL.
P. aeruginosa e algumas espécies de Burkholderia são produtoras naturais de RL9, mas a primeira bactéria é a produtora mais eficiente. No entanto, o RL usado comercialmente é atualmente produzido em derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expressam genes de P. aeruginosa para evitar o uso desse patógeno oportunista10,11. A detecção e quantificação de RL produzidas por P. aeruginosa são de grande importância para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de características relacionadas à virulência12, na caracterização de cepas pertencentes aos clados 3 ou 513 e para a construção de derivados de P. aeruginosa que produzem esses biossurfactantes em excesso e reduzem a virulência14. A produção de biossurfactantes por diferentes microrganismos tem sido detectada com base em algumas características gerais desses compostos, como o método de queda por colapso ou índice de emulsificação15, mas esses métodos não são precisos nem específicos16.
Aqui, descrevemos o protocolo para detectar mRL e dRL usando a extração líquida de RL total dos sobrenadantes de cultura de diferentes cepas do tipo P. aeruginosa e a separação de ambos os tipos de RL usando TLC. Neste método, o RL extraído do sobrenadante de cultura é separado por sua solubilidade diferencial nos solventes usados para TLC, causando migração diferencial na placa de sílica gel. Assim, os mRL têm uma migração mais rápida do que os dRL e podem ser detectados como pontos separados quando as placas são secas e coradas com α-naftol.
O método aqui descrito para detecção de mRL e dRL por TLC é baseado em um artigo17 publicado anteriormente, que é de fácil execução e não requer equipamentos caros. Este método tem sido útil para detectar RL em vários isolados de P. aeruginosa 13 usando controles apropriados, como um mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de produzir RL. No entanto, não é o método preferido para caracterizar novos biossurfactantes produzidos por bactérias diferentes de Pseudomonas aeruginosa devido à sua falta de especificidade.
Além disso, é apresentado um método para quantificar os equivalentes de ramnose do RL total extraído de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa . Esse método quantifica esses biossurfactantes com base na reação do orcinol com açúcares redutores, resultando em um produto que pode ser medido espectrofotometricamente a 421 nm, conforme descrito anteriormente18. Como a reação com orcinol não é específica da ramnose, é importante realizar esse método com RL extraído do sobrenadante da cultura que não contenha quantidades significativas de outras moléculas contendo açúcar, como lipopolissacarídeos (LPS). Uma mistura acidificada de clorofórmio / metanol é usada aqui para extração líquida de RL18, mas acetato de etila também pode ser usado, e a extração em fase sólida (SPE) produz resultados muito bons19. O método do orcinol aqui descrito não requer equipamentos sofisticados e pode fornecer resultados confiáveis se realizado com cuidado especial no preparo das amostras analisadas, conforme discutido. Para assegurar uma preparação adequada da amostra, é importante incluir um mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de produzir RL20 e realizar três réplicas biológicas e três réplicas técnicas para cada determinação.
Tem havido controvérsia significativa na literatura16,21 em relação à determinação do RL pelo método do orcinol, com alguns estudos sugerindo que a produção de RL é superestimada e que o ensaio carece de especificidade para ramnose, potencialmente detectando outros açúcares. No entanto, demonstramos aqui que os métodos descritos podem ser precisos e específicos sob as condições apropriadas. Além disso, para comparação com os procedimentos descritos neste artigo, utilizamos a detecção UPLC-MS/MS de um padrão dRL e demonstramos que resultados semelhantes são obtidos com o método orcinol. O protocolo detalhado para quantificar a RL usando este método está incluído no Arquivo Suplementar 1.
Esses protocolos são exemplificados usando as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3). Essas cepas foram escolhidas por serem bem caracterizadas e produzirem diferentes perfis de RL.

<table><tbody><tr><td>1-NAFTOL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>70442</td><td></td></tr><tr><td>ÁCIDO ACÉTICO</td><td>J.T. BAKER</td><td>9508-02</td><td></td></tr><tr><td>CENTRÍFUGA</td><td></td><td></td><td>Para tubos de centrifugação 1.5 mL e&nbsp; 50 mL</td></tr><tr><td>CLOROFÓRMIO</td><td>J.T. BAKER</td><td>9180-02</td><td></td></tr><tr><td>FORNO</td><td></td><td></td><td></td>DE SECAGEM</tr><tr><td>ÉTER</td><td>J.T. BAKER</td><td>9244-02</td><td></td></tr><tr><td>PIPETA DE VIDRO</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> CLS706510 <tr><td>ÁCIDO CLORÍDRICO</td><td>J.T. BAKER</td><td>5622-02</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-RAMNOSE MONOHIDRATADA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R-3875</td><td></td></tr><tr><td>METANOL</td><td>J.T. BAKER</td><td>9049-02</td><td></td></tr><tr><td>ORCINOL MONOHIDRATADO</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>O1875</td><td></td></tr><tr><td>Caldo</td><td></td><td></td> PPGAS <td>Tris HCL (0.12M), Cloreto de Potássio (0.02M) Cloreto de Amônio (0.02M),&nbsp; Peptona (1%), pH 7.4&nbsp; &nbsp; Autoclavado. Adicionar&nbsp; Glicose (5%) e Sulfato de Magnésio (0.0016M)</td></tr><tr><td>CÉLULA DE QUARTZO (CUBETA)TANQUE</td><td></td> DE DESENVOLVIMENTO <td>TLC RETANGULAR SIGMA-ALDRICH</td> Z276669 <td></td></tr><tr><td>FISHER</td><td>SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> K4161801020 <tr><td>RHAMNOLIPIDS&nbsp;</td><td>ESPECTROFOTÔMETRO</td><td></td> SIGMA-ALDRICH R-90 <td></td></tr><tr><td>PULVERIZADOR</td><td>VIS</td>ÁCIDO SULFÚRICO Z529710 J.T. BAKER 9681-02 TUBOS TES, 5mL CORNING 352002 TLC SILICA GEL 60 F254 MERCK 1.05554.0001 BANHO-MARIA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>> 80 &deg; O</td></tr></tbody></table>

detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por pseudomonas aeruginosa

Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa

A bactéria ambiental Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista com alta resistência a antibióticos que representa um risco à saúde. Essa bactéria produz altos níveis de biossurfactantes conhecidos como ramnolipídios (RL), que são moléculas com valor biotecnológico significativo, mas também estão associadas a características de virulência. A este respeito, a detecção e quantificação de RL podem ser úteis tanto para aplicações biotecnológicas quanto para projetos de pesquisa biomédica. Neste artigo, demonstramos passo a passo a técnica para detectar a produção das duas formas de RL produzidas por P. aeruginosa usando cromatografia em camada delgada (TLC): mono-ramnolipídios (mRL), moléculas constituídas por um dímero de ácidos graxos (principalmente C10-C10) ligado a uma porção ramnose, e di-ramnolipídios (dRL), moléculas constituídas por um dímero de ácido graxo semelhante ligado a duas frações ramnose. Além disso, apresentamos um método para medir a quantidade total de RL com base na hidrólise ácida desses biossurfactantes extraídos de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa e a subsequente detecção da concentração de ramnose que reage com o orcinol. A combinação de ambas as técnicas pode ser usada para estimar a concentração aproximada de mRL e dRL produzida por uma cepa específica, como exemplificado aqui com as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3).

Neste artigo, três cepas diferentes do tipo P. aeruginosa foram utilizadas para representar três filogrupos, cada um com diferentes níveis de produção de RL e proporções de mRL e dRL. Essas cepas incluem PAO1 (um isolado de ferida da Austrália, 195522), PA14 (um isolado de planta dos EUA, 197723) e PA7 (um isolado clínico da Argentina, 201024). Como controle negativo, foi empregado o mutante PAO1 rhlA, que é incapaz de produzir RL. Todas as linhagens foram cultivadas por 24 h em meio PPGAS, projetado especificamente para promover altos níveis de RL25, a 37 °C. As culturas PPGAS foram inoculadas em uma densidade óptica de 0,05 a 600 nm, utilizando-se meio LB26 durante a noite. Normalmente, as cepas de P. aeruginosa atingem uma densidade óptica de 2 medida a 600 nm em meio PPGAS após 24 h, o que corresponde aproximadamente a 1 x 109 bactérias por mL. Para coletar os sobrenadantes da cultura para detecção e quantificação de RL, as culturas foram centrifugadas a 3.000 x g a 4 °C por 15 min, e o pellet celular foi descartado. Os resultados obtidos usando esses dois métodos (Figura 2 e Figura 3) ilustram que tanto os tipos de RL produzidos por cada cepa quanto a quantidade de sua produção diferem entre as três cepas analisadas. Conforme ilustrado na Figura 2, PAO1 produz aproximadamente 30% mRL e 70% dRL, enquanto PA14 produz uma proporção igual de 50% mRL e 50% dRL, e PA7 produz exclusivamente mRL. Esse perfil de produção de RL é consistente com relatos anteriores12,14.
A Figura 3A ilustra a quantidade de equivalentes de ramnose presentes na RL produzida por cada um desses três tipos de cepas. A partir das quantidades de ramnose detectadas, é evidente que a cepa PA14 produz a maior quantidade de RL, enquanto a cepa PA7 produz a menor quantidade. No entanto, esses resultados sozinhos não podem ser usados para estimar a concentração de μM de RL produzida por cada cepa. Além disso, o método do orcinol sozinho não pode fornecer uma concentração aproximada de RL, pois depende da caracterização das proporções de mRL e dRL produzidas por cada cepa de interesse. Portanto, para obter uma estimativa da concentração de μM de RL, deve-se considerar a proporção de cada tipo de RL determinada na CPD, devendo ser incluída uma curva padrão com diferentes concentrações de ramnose (Figura 3B).
O método do orcinol pode ser utilizado para quantificar a concentração de RL quando apenas um tipo desse biossurfactante é produzido. Nesses casos, a concentração de μM da ramnose detectada corresponde diretamente à concentração de μM de mRL. Para dRL, uma vez que duas ramnoses são produzidas pela hidrólise de cada molécula de dRL, a concentração de μM de ramnose detectada em RL precisa ser dividida por 2 para obter sua concentração de μM (consulte a Figura 4).
No entanto, a maioria das cepas de P. aeruginosa produz os dois tipos de RL em proporções variadas (como mostrado na Figura 2), tornando possível determinar apenas uma concentração aproximada do RL total. Levando isso em consideração, estimamos a produção de RL por cada cepa da seguinte forma: Para a cepa PA7, uma vez que produz apenas mRL, a ramnose que faz parte do RL (44,6 μg/mL + 4,5 μg/mL) corresponde diretamente à concentração de μM (244,78), representando a concentração desse biossurfactante no sobrenadante da cultura, pois cada molécula de RL contém uma porção ramnose. No entanto, para a cepa PAO1, embora a concentração de ramnose detectada tenha sido de 111,55 μg/mL + 11,41 μg/mL, apenas 30% corresponde ao mRL. Portanto, 70% das moléculas de RL contêm duas ramnoses por molécula. Para estimar a concentração de RL, a concentração de ramnose μM (612,24) foi dividida por 5, considerando que 1/5 corresponde à concentração de μM de mRL (122,49) e 2/5 (244,89) a dRL. Assim, a concentração aproximada de μM de RL produzida por esta cepa é de 367,39.
Para a cepa PA14, a concentração de ramnose detectada foi de 194,39 μg/mL + 11,5 μg/mL, que foi convertida para a concentração de μM (1.066,9) e dividida por 3. O resultado representa a concentração de cada tipo de RL, considerando que cada tipo foi produzido a 50% e que o dRL contém 2 ramnoses por molécula. Assim, esta estirpe produz 355,63 μM de mRL e a mesma concentração de dRL, resultando numa concentração aproximada de μM de RL de 711,27, quase o dobro da estirpe PAO1 e quase três vezes a concentração produzida pela estirpe PA7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65934/65934fig01.jpg"> Figura 1: Composição química dos principais congêneres de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios. (A) Mono-ramnolipídios. (B) Di-ramnolipídios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/65934fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65934/65934fig02.jpg"> Figura 2: Detecção de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios por cromatografia em camada delgada. (A) Imagem de uma placa TLC mostrando os padrões RL e o RL produzido pelas cepas PAO1, PA14, PA7 e o mutante ΔrhlA derivado de PAO1. (B) Estimativa da proporção de cada tipo de RL (mRL e dRL) em cada uma das amostras testadas em (A), usando o software ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/65934fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65934/65934fig03.jpg"> Figura 3: Quantificação da concentração de RL usando o método do orcinol. (A) Concentração de ramnose (μg / mL) contida em RL extraída dos sobrenadantes de cultura das cepas PAO1 (barra preta), PA14 (barra cinza claro) e PA7 (barra cinza escuro). As barras denotam o desvio padrão. (B) A curva de calibração da ramnose para o experimento mostrado em (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/65934fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65934/65934fig04.jpg"> Figura 4: Validação do método orcinol comparado com UPLC-MS/MS para quantificação de dRL. (A) O padrão dRL foi quantificado usando UPLC-MS/MS. (B) O método orcinol comparado com a concentração de ramnose expressa em mM. (C) A mesma concentração de mM de dRL que a ramnose dá aproximadamente o dobro da absorbância a 421 nm, como esperado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/65934fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Representação esquemática do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/Diagram%20of%20the%20methods%20presented.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 1: Protocolo detalhado para quantificar dRL por UPLC-MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65934/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Pseudomonas aeruginosa produz os biossurfactantes ramnolipídicos. A cromatografia em camada delgada detecta e determina a proporção de mono e di-ramnolipídios produzidos por cada cepa. A quantificação de ramnolipídios totais envolve a avaliação dos equivalentes de ramnose presentes nesses biossurfactantes extraídos dos sobrenadantes de cultura usando o método do orcinol.

Detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa

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