Name: Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda a técnica de imunofluorescência multicolorida para avaliar proteínas associadas à rinite alérgica em modelo de rato. Este método permite identificar marcadores moleculares e explorar mecanismos terapêuticos em imunologia.

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Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).

O protocolo e os procedimentos experimentais receberam aprovação do Comitê Administrativo e de Pesquisa Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Ratos machos Sprague Dawley (SD), com oito semanas de idade, pesando entre 180 e 200 g, foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados sob um ciclo claro/escuro natural com temperatura (23 ± 2 °C) e umidade relativa (55% ± 10%) controladas. Doze ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo controle e grupo RA. Todos os ratos foram aclimatados a essas condições e receberam acesso gratuito a comida e água por uma semana antes do experimento.
1. Estabelecimento de um modelo de RA em ratos
<ol><li>Preparo da solução sensibilizante: suspender 30 mg de ovalbumina (OVA) e 3 g de Al(OH)3 em 100 mL de solução salina (ver Tabela de Materiais)14,15.</li>
	<li>Sensibilização básica: segure e segure o rato totalmente acordado com o abdômen voltado para cima. Desinfete o abdômen usando bolas de algodão embebidas em álcool a 75%. Utilizar uma seringa de 1,5 ml para injectar 1 ml da solução sensibilizante preparada no passo 1.1 na cavidade abdominal esquerda dos ratos do grupo RA. Repetir esta injeção uma vez a cada dois dias durante 14 dias (Figura 1A). NOTA: Certifique-se de que a cabeça do rato está posicionada mais abaixo da cauda para evitar danos aos intestinos grosso e delgado ao inserir a seringa. O local da injeção está localizado a 1,5 cm da linha média ventral. Os ratos do grupo controle devem receber injeções intraperitoneais de 1 mL de solução salina normal uma vez a cada dois dias por 14 dias.</li>
	<li>Provocação nasal: Administrar 50 μL de OVA a 5% por meio de gotas nasais utilizando pipeta de 100 μL (Figura 1B) no dia seguinte à sensibilização basal, repetindo este procedimento por 7 dias (Figura 1C). NOTA: Preparar a solução de OVA a 5% misturando 5 g de OVA com 100 ml de solução salina. Para o grupo controle, administrar gotas do mesmo volume de soro fisiológico.</li>
</ol>2. Escore comportamental de ratos
<ol><li>Dentro de 30 min após completar o teste nasal final, observar e registrar os ratos usando uma câmera digital para identificar sintomas como coçar o nariz, espirrar e coriza, com base nos critérios de pontuação descritos na Tabela 1 (Figura 1D). NOTA: A confirmação de que a modelagem de RA bem-sucedida é baseada na obtenção de uma pontuação total de ≥5 pontos14.</li>
</ol>3. Obtenção de amostras de mucosa nasal
<ol><li>Sacrificar ratos: sacrificar os ratos expondo-os a uma overdose de CO2. Depois, desinfetar os ratos com etanol a 75% (ver Tabela de Materiais). Utilizar bisturi para incisão nos dois cantos da boca para exposição do tecido muscular (Figura 2A). Em seguida, cortar as articulações do osso zigomático e da mandíbula em ambos os lados do crânio com tesoura de tecido (Figura 2B) e remover a mandíbula (Figura 2C).</li>
	<li>Exposição da cavidade nasal: separar a pele da maxila com hemostático (Figura 2D) para expor a cavidade nasal (Figura 2E). Cortar a conexão óssea entre a cavidade nasal e a maxila com tesoura de tecido (Figura 2F). Em seguida, cortar a conexão entre a cavidade nasal e os ossos orbitários de ambos os lados no forame infraorbital (Figura 2G) e remover a cavidade nasal (Figura 2H).</li>
	<li>Fixação: colocar a cavidade nasal extraída em paraformaldeído a 4% para fixação e armazená-la em temperatura ambiente por 24-72 h (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de que a quantidade de paraformaldeído fixador utilizada é suficiente para cobrir completamente as seções para a fixação adequada.</li>
</ol>4. Pré-processamento de amostras de mucosa nasal
<ol><li>Descalcificação: comece fixando os tecidos retirados a partir do passo 3.1. Lave-os três vezes com PBS por 20 min cada. Em seguida, lave-os três vezes com água destilada, cada vez por 20 min. Posteriormente, descalcifique os tecidos em uma solução de descalcificação com um volume de 20-30 vezes o dos tecidos à temperatura ambiente.<ol><li>A solução de descalcificação (ver Tabela de Materiais) deve manter um pH de 7,2-7,4. Finalmente, coloque o tecido descalcificado em uma caixa de desidratação. NOTA: A solução descalcificante precisa ser trocada semanalmente. O processo de descalcificação pode ser concluído quando o tecido amolece (aproximadamente 2 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Desidratação e depilação: transfira a caixa de desidratação para um desidratador (ver Tabela de Materiais). Comece com álcool 75% por 4 h, seguido por álcool 85% por 2 h, álcool 90% por 2 h e álcool 95% por 1 h.<ol><li>Em seguida, imergir o tecido em etanol anidro por 30 min, repetir o processo por mais 30 min, usar xileno por 5-10 min, repetir essa etapa por mais 5-10 min, imergir o tecido em cera por 1 h, repetir essa etapa por mais uma hora e, finalmente, imergir o tecido em cera por mais 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação: coloque o bloco de cera derretida na caixa de incorporação (consulte Tabela de Materiais) e guarde-o em um freezer de -20 °C. Assim que a cera se solidificar, retire-a e apague o bloco de cera.</li>
	<li>Fatiamento: insira o bloco de cera aparado em micrótomo de parafina (ver Tabela de Materiais) e corte-o em fatias com espessura de 3 μm. Coloque as fatias em banho-maria a 40 °C sobre um espalhador de lâminas. Achate o tecido, levante-o com uma lâmina de vidro e leve ao forno a 60 °C.<ol><li>Depois que a água tiver evaporado e a cera estiver devidamente ajustada, remova as lâminas e armazene-as a uma temperatura de 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloração H&E do tecido da mucosa nasal
<ol><li>Desparafinação e hidratação: coloque as fatias em xileno por 20 min, repita o processo por mais 20 min, etanol absoluto por 5 min, repita essa etapa por mais 5 min, álcool 75% por 5 min e, por fim, lave por 5 min.</li>
	<li>Coloração de hematoxilina: dispensar 100 μL de solução corante de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 3-5 min usando uma pipeta de 100 μL, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de etanol de ácido clorídrico a 0,5% por 10-30 s, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de água de amônia a 0,2% por 10-30 s e enxaguar por 30 s. NOTA: Após a coloração com hematoxilina, a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5% é necessária para remover o excesso de corante hematoxilina ligado ao núcleo e absorvido pelo citoplasma. Quando a coloração de eosina é realizada, os núcleos e o citoplasma serão claramente corados. As fatias aparecerão vermelhas ou rosas após a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5%, então enxágue imediatamente após a diferenciação para remover o ácido das fatias de tecido para interromper a diferenciação. Em seguida, use 0,2% de água de amônia para melhorar a coloração nuclear.</li>
	<li>Coloração de eosina: utilizar uma pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solução corante de eosina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e enxaguar por 30 s.</li>
	<li>Desidratação e selagem: imergir as fatias em etanol absoluto por 5 min, repetir o processo por mais 5 min, repetir novamente por 5 min, dimetil por 5 min e xileno por 5 min. Por fim, selar com resina neutra (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Colocação do corte corado no microscópio: posicione o corte corado no microscópio, ajuste o foco do microscópio até que a imagem fique claramente visível, ajuste o aumento para 40x e capture a imagem.</li>
</ol>6. Imunomarcação multicolor do tecido da mucosa nasal
<ol><li>Desparafinação e hidratação: siga o mesmo mencionado no passo 5.1.</li>
	<li>Tratamento tampão citrato-fosfato: colocar o tampão citrato-fosfato (pH 6,0) (ver Tabela de Materiais) em um recipiente seguro para micro-ondas. Aqueça até ferver, remova-o e, em seguida, adicione as lâminas ao recipiente. Leve ao micro-ondas em fogo médio por 8 min até ferver, desligue o fogo por 8 min e mude para fogo médio-baixo por 7 min.<ol><li>Após o resfriamento natural, transfira as fatias para PBS (pH 7,4), agite e lave-as três vezes com um agitador descolorante, cada vez por 5 min. NOTA: Certifique-se de que o tampão não evapora durante este processo e evite que as fatias sequem.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio da peroxidase endógena: secar as fatias, desenhar um círculo ao redor do tecido com uma caneta imunohistoquímica (para evitar que o anticorpo flua) e aplicar solução de peróxido de hidrogênio a 3% (peróxido de hidrogênio: água pura = 1:9).<ol><li>Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 15 minutos. Após o resfriamento natural, coloque as fatias em PBS (pH 7,4) e agite-as em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio: aplicar 5% de soro de cabra dentro do círculo e incubar por 30 min.</li>
	<li>Adição de anticorpos primários: remova suavemente a solução de bloqueio, adicione FOXP3 (diluição: 1:200, ver Tabela de Materiais) ao corte e coloque-o numa câmara húmida. Incubar a 4 °C durante a noite. NOTA: Adicione uma pequena quantidade de água à câmara úmida para evitar a evaporação de anticorpos.</li>
	<li>Adição de anticorpos secundários: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Seque suavemente as fatias e aplique o anticorpo secundário (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, ver Tabela de Materiais) dentro do círculo. Incubar à temperatura ambiente durante 50 minutos no escuro.</li>
	<li>Preparação da solução de diluição de tiramida: combinar 100 μL de 3% H 2 O2com 100 ml de 1x TBST (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adição de solução de trabalho TSA: Misturar 1 ml de diluente de tiramida com 2 μL de CY3-tiramida para preparar a solução de trabalho TSA. Aplicar 100 μL de solução de trabalho TSA em cada fatia e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 10 minutos. Em seguida, lave as fatias com PBS três vezes, 5 min cada vez. NOTA: Preparar e utilizar imediatamente a solução de trabalho TSA e armazená-la a 4 °C no escuro; É válido por até 24 h.</li>
	<li>Repita os passos 6.2-6.8: mudar para uma diluição de 1:200 de RORγt (corante fluorescente FITC) e, em seguida, para uma diluição de 1:200 de TICAM1 (corante TYP620) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Núcleos contracorados com DAPI: agitar suavemente as fatias para secá-las, aplicar solução corante DAPI e incubar à temperatura ambiente por 10 min no escuro.</li>
	<li>Têmpera autofluorescente: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Aplique o quencher de autofluorescência (ver Tabela de Materiais) nas fatias, aguarde 5 min e lave por 10 min.</li>
	<li>Bloqueio: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Agite suavemente as fatias para secá-las e selá-las com o quencher antifluorescência (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Microscopia: colocar o corte corado no microscópio, ajustar o foco do microscópio para visibilidade clara, ajustar o aumento para 20x e 40x e capturar a imagem. NOTA: DAPI tem um comprimento de onda de excitação UV de 330-380 nm e um comprimento de onda de emissão de 420 nm (luz azul). O FITC tem um comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um comprimento de onda de emissão de 515-555 nm (luz verde). CY3 tem um comprimento de onda de excitação de 510-560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm (luz vermelha). TYP-690 tem um comprimento de onda de excitação de 630 nm e um comprimento de onda de emissão de 690 nm (luz rosa).</li>
</ol>

Imunofluorescência Multicolorida do Tecido Nasal em Modelo de Rato com Rinite Alérgica

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<li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Recapitulate%22%5BJournal%5D)">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li>
<li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Otorhinolaryngology%2C+Head%2C+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li>
<li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Coal+Industry+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+blockade%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li>
<li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18. Além disso, vário...

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expressão de proteínas específicas em tecidos biológicos ou células. Na pesquisa de RA, o FI pode detectar simultaneamente múltiplos alvos, incluindo citocinas relacionadas à RA, células inflamatórias, receptores e muito mais, facilitando a exploração da patogênese da RA e dos efeitos de drogas 3,4,5,6.
O processo de coloração por imunofluorescência multicolor (mIF) se assemelha muito ao FI tradicional, com a adição de uma etapa de eluição de anticorpos durante cada rodada de coloração. Essa modificação permite a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores na mesma seção de tecido por meio de marcação única sequencial e várias rodadas de recoloração. O mIF é baseado na amplificação do sinal da tiramida (TSA), permitindo ciclos repetidos de coloração fluorescente de TSA e o uso de aquecimento por micro-ondas para remover anticorpos enquanto retém sinais fluorescentes 7,8. Em comparação com o FI convencional, o mIF oferece várias vantagens: (1) pode detectar antígenos fracamente expressos que são difíceis de identificar com o IF convencional 9,10; (2) proporciona coloração de alta qualidade com melhor relação sinal-ruído; (3) permite quantificar estruturas tecido-específicas e regiões de interesse11; (4) a multiplexação de múltiplas vias utiliza tecidos de forma eficiente e conserva recursos patológicos limitados12; (5) a análise multiparamétrica por meio do mIF oferece informações mais profundas sobre os tecidos, revelando informações biológicas ocultas13.
De modo geral, o mIF permite a observação de diferentes expressões e distribuições de antígenos dentro de uma mesma amostra, facilitando o estudo das proteínas-alvo. No futuro, pesquisadores que buscam entender a expressão e distribuição de múltiplas proteínas-alvo encontrarão essa técnica como uma escolha valiosa. Este estudo demonstra a aplicação do mIF na coloração de amostras de mucosa nasal de ratos com RA e avalia o estabelecimento de um modelo de RA em ratos.

<table><tbody><tr><td>Al (OH) &lt; sub&gt; 3&lt; / sub&gt;</td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A7130</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td><td>20210107</td><td></td></tr><tr><td>Amônia</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2021070101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022070501</td><td></td></tr><tr><td>Selante</td> <td>de têmpera anti-fluorescênciaSouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de tingimento automática</td><td>Thermo scientific</td><td>Varistain Gemini ES</td><td></td></tr><tr><td>Carrier slides</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>220518001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão citrato-fosfato </td><td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Solução de reparo de antígeno de ácido cítrico (PH 6.0)</td><td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td>220518001</tr><tr><td>Coverslip</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>CS01-2450</td><td></td></tr><tr><td>CY3-Tyramide</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1223-50UL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de descoloração</td><td>SCILOGEX</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>Solução de descalcificação EDTA</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td>CR2203047</tr><tr><td>Secador de jateamento com aquecimento elétrico </td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de marcação de caixa de embutir</td><td>Thermo scientific</td><td>  PrintMate AS</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Incorporação</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de desidratação rápida de tecidos</td><td>Thermo scientific</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>Selador de filme</td><td>Thermo scientific</td><td>Autostainer 360</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Tyramide</td><td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1222-50UL</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>ensolarado Tecnologia óptica Co.Ltd</td><td>CX40</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>bs-10211R</td><td></td></tr><tr><td>Tabela de congelamento</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JB-L5</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho IgG H &amp; L (HRP)</td> <td>Liankebio Co., Ltd</td><td>GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Biosharp</td><td>BL210A</td><td></td></tr><tr><td>H &amp; Kit de coloração E</td><td>Leagene</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps hemostático</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td><td>210608</td><td></td></tr><tr><td>Caneta imuno-histoquímica</td><td>Biosharp</td><td>BC004</td><td></td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Midea</td><td>M1-L213B</td><td></td></tr><tr><td>Goma neutra</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumina </td><td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td><td>A804010</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de palma</td><td>SCILOGEX</td><td>D1008E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0099-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de seção de patologia</td><td>3DHISTECH Kft</td><td>Pannoramic SCAN </td><td></td></tr><tr><td>Pipeta PBS buffer</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Dragon</td><td>KE0003087/KA0056573</td><td></td></tr><tr><td>Rorγ t</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF3196</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td><td>20170022</td><td></td></tr><tr><td>Agente de têmpera autofluorescente Sudan Black B</td><td>Bioengineering Co., Ltd</td><td>A602008-0025</td><td></td></tr><tr><td>Fatiador</td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de fatiar</td><td>Thermo scientific</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td><td>PC2-301</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Sprague Dawley</td><td>Academia de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan</td><td>SYX <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto; "> 2023-0100</td><td></td></tr><tr><td>TICAM-1</td><td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td><td>DF6289</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de tecido</td><td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td><td>J22120</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de assadeira de espalhamento de tecido</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>TYR-690 corantes fluorescentes</td><td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td><td>RC0086-34RM</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>Secador de lâmina de água</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>Aparador de cera</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>JXL-818</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td><td>2022051901</td><td></td></tr></tbody></table>

marcação por imunofluorescência em cortes de tecido da mucosa nasal de ratos com rinite alérgica via imunoensaio multicolorido

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.
Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.

Seis ratos SD foram induzidos com sucesso no modelo de RA através de injeção intraperitoneal de OVA e desafio nasal. A RA foi induzida em todos os ratos do grupo RA, correspondendo a 100% do grupo. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz. Todas as observações comportamentais obtiveram pontuação ≥5 pontos (Tabela 2).
Os resultados da coloração H&amp;E no21º dia de modelagem revelaram que, nos ratos controle, a...

Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Nossa principal pesquisa é baseada em um estudo de rinite alérgica. Nossa pesquisa pretende analisar quais proteínas estão associadas à rinite alérgica. A imunofluorescência multicolor é atualmente utilizada para o avanço das pesquisas em nosso meio.Em estudos futuros, enfocaremos os possíveis mecanismos da MTC no tratamento da rinite alérgica.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Nós descrevemos uma estratégia para monitorar a maturação e migração de células dendríticas pulmonares em resposta à ovalbumina na configuração de ovalbumina inflamação das vias aéreas induzida alérgica. Esta estratégia pode ser modificado para avaliar a migração de células dendríticas pulmonares nas configurações de infecção.

Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

Este vídeo demonstra a quantificação dos níveis de mediador imunológico no extrato fluido de revestimento da mucosa nasal humana neonatal. Um sistema de ensaio multiplex baseado em eletroquimioluminescência mede esses mediadores avaliando a intensidade da luz emitida quando eles são excitados.

Quantificação dos níveis de mediadores imunológicos no fluido de revestimento da mucosa humana

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Este protocolo detalha o procedimento para escavação de pontos de acupuntura e demonstra sua eficácia no tratamento da rinite alérgica.

Terapia de incorporação de categute de ponto de acupuntura na medicina tradicional chinesa para o tratamento da rinite alérgica

O presente protocolo descreve um novo método para evitar a contaminação do sangue no líquido de lavagem nasal murino (NLF). Como esse método garante a coleta de NLF sem contaminação do sangue, ele permite detecções mais precisas de componentes imunológicos e vários patógenos respiratórios.

Coleta de fluido de lavagem nasal murina sem contaminação do sangue

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Aprenda a técnica de imunofluorescência multicolorida para avaliar proteínas associadas à rinite alérgica em modelo de rato. Este método permite identificar marcadores moleculares e explorar mecanismos terapêuticos em imunologia.

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

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