Induzindo plasticidade de longo prazo da excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios do núcleo geniculado lateral dorsal
20 de setembro de 2024
Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a plasticidade de longo prazo da excitabilidade intrínseca neuronal em neurônios de retransmissão do núcleo geniculado lateral dorsal mantido em fatias cerebrais ex vivo.
Nossa pesquisa se concentra no papel dos canais iônicos na plasticidade funcional em distúrbios cerebrais. Em particular, estudamos aqui se os neurônios do tálamo visual podem sofrer plasticidade de excitabilidade neuronal intrínseca. Estabelecemos pela primeira vez que os neurônios do núcleo geniculado lateral expressam a plasticidade da excitabilidade neural intrínseca após a privação monocular ou após a estimulação de entradas regionais.
Fornecemos uma maneira simples de induzir plasticidade duradoura da excitabilidade neuronal em neurônios talâmicos visuais do rato in vitro. Para isso, usamos registros eletrofísicos patch-clamp e ferramentas farmacológicas no tecido cerebral ex vivo. Nossos resultados levantam a possibilidade de explorar a plasticidade intrínseca de outros núcleos visuais subcorticais do cérebro.
Para começar, prepare as ferramentas de dissecação e duas plataformas de gelo. Coloque gelo no tanque externo e encha a câmara de corte do vibratomo com uma solução de corte gelada. Coloque a cabeça do rato eutanasiado na primeira plataforma gelada e, usando uma tesoura pequena, corte o couro cabeludo no sentido caudal, seguido do crânio bilateralmente.
Com pinças e espátulas rombas, abra o crânio, extraia rapidamente o cérebro do crânio e coloque-o na segunda plataforma de gelo. Faça uma incisão no plano frontal para remover o córtex anterior e os bulbos olfatórios, seguido de um segundo corte no nível do colículo inferior para remover o córtex posterior e o cerebelo. Fixe o bloco cerebral na placa do vibratomo com o lado rostral para cima.
Regue regularmente o cérebro durante o procedimento até que esteja totalmente submerso na câmara de corte. Usando o vibratome, corte fatias de 350 micrômetros contendo o núcleo geniculado lateral dorsal. Em seguida, com um lápis, remova suavemente o córtex e o hipocampo do mesencéfalo.
Para começar, obtenha a fatia de cérebro de rato contendo o núcleo geniculado lateral dorsal, ou dLGN, e monte-a em uma câmara submersa em um microscópio vertical. Coloque o fio de platina em forma de U na fatia. Usando microscopia de vídeo infravermelho de contraste de interferência diferencial, identifique um neurônio saudável no dLGN para gravação de patch-clamp.
Usando o micromanipulador, posicione a pipeta de remendo no neurônio selecionado com pressão positiva constante. Coloque o amplificador no modo VC e injete um passo de tensão de 10 milivolts. Defina a tensão para menos 65 milivolts.
Em seguida, coloque o amplificador no modo CC, equilibre a ponte para compensar a resistência de acesso e mantenha o neurônio em menos 65 milivolts. Para aquisição de dados, defina um período de controle de cerca de 10 minutos com um pulso positivo de corrente a uma frequência de 0,1 hertz e monitore a excitabilidade neuronal. Em seguida, observe a resistência de entrada do neurônio com um breve pulso negativo de corrente.
Após o período de controle, elimine trens de 15 picos evocados por 15 passos curtos de dois a cinco milissegundos de corrente despolarizante, entregues a 40 hertz por 10 minutos. Escolha a amplitude do pulso de corrente para obter um único potencial de ação a cada vez. Finalmente, teste a excitabilidade neuronal após o protocolo de indução.
Os neurônios dLGN foram registrados em configuração de células inteiras, e LTP-IE foi induzido por potencial de ação disparando a 40 hertz por 10 minutos na presença de glutamato ionotrópico e antagonistas do receptor GABA. Um aumento de três vezes no número de potenciais de ação foi observado 20 a 30 minutos após a indução de LTP-IE sem qualquer alteração na resistência de entrada.
Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo para induzir plasticidade de longa duração na excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios de relevo do núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) utilizando fatias cerebrais ex vivo. A questão principal investiga se os neurônios do dLGN podem exibir alterações na excitabilidade intrínseca após estimulação ou privação. Os resultados sugerem um aumento significativo na excitabilidade neuronal após a indução.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Plasticidade neuronal
Contexto
- Compreender a plasticidade intrínseca é essencial para obter insights sobre a função cerebral e distúrbios associados.
- Neurônios de relevo no tálamo visual podem desempenhar um papel no processamento sensorial e na plasticidade.
- Estudos anteriores demonstraram que a excitabilidade neuronal pode ser modificada por fatores ambientais.
- O dLGN é fundamental para a transmissão de informações visuais, tornando-o um foco pertinente para o estudo da plasticidade.
Objetivo do Estudo
- Explorar a plasticidade da excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios talâmicos visuais.
- Estabelecer um método confiável para induzir e medir essa plasticidade.
- Permitir estudos adicionais sobre núcleos visuais subcorticais relacionados.
Métodos Utilizados
- Utilizou fatias cerebrais ex vivo de rato, visando especificamente o dLGN.
- Implementou a eletrofisiologia de patch-clamp para avaliar as propriedades neuronais.
- A indução de plasticidade de longa duração empregou potenciais de ação de alta frequência.
- Os passos críticos incluíram a preparação do tecido e as gravações eletrofisiológicas sob condições controladas.
Resultados Principais
- Demonstrou um aumento triplo nos potenciais de ação após o protocolo de indução.
- Nenhuma alteração na resistência de entrada foi observada, indicando uma alteração específica na excitabilidade.
- Os achados apoiam a hipótese de que os neurônios do dLGN são capazes de plasticidade intrínseca.
- As modificações eletrofisiológicas sugerem possíveis vias para investigações futuras.
Conclusões
- Este estudo valida um método para induzir e medir alterações na excitabilidade intrínseca de neurônios do dLGN.
- Os achados contribuem com insights significativos sobre os mecanismos neuronais de plasticidade, com implicações para o entendimento do processamento visual e possíveis alvos terapêuticos.
- Pesquisas futuras podem estender esses métodos a outras regiões subcorticais para explorar a plasticidade.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A plasticidade da excitabilidade neuronal intrínseca no núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) representa um ponto crítico para compreender o processamento sensorial e a circuitaria neural adaptativa. A indução e quantificação confiáveis da potenciação de longa duração da excitabilidade intrínseca (LTP-IE) em neurônios de relevo do dLGN permitem a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para a descoberta precoce de fármacos para o SNC. Essa capacidade reforça a confiança preditiva em portfólios de neurociência translacional voltados para a modulação das vias visuais e talâmicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função dos canais iônicos neuronais e dos mecanismos de plasticidade em neurônios de relevo talâmicos.
- Apoia a desmistificação biológica ao isolar alterações na excitabilidade intrínseca independentes da entrada sináptica.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias do SNC implicadas na adaptação sensorial e na plasticidade.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado ex vivo para quantificar alterações na excitabilidade neuronal utilizando eletrofisiologia com patch-clamp.
- Estabelece protocolos reprodutíveis para indução de LTP-IE, apoiando a padronização de ensaios e a comparabilidade entre laboratórios.
- Permite a medição quantitativa da atividade de potenciais de ação como ponto final de triagem para moduladores da plasticidade intrínseca.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no processamento sensorial e disfunção tálamica.
- Permite a continuidade do descobrimento mecanicista à validação pré-clínica de alvos do SNC que afetam a excitabilidade neuronal.
- Oferece uma plataforma para avaliar biomarcadores translacionais de plasticidade intrínseca nas vias visuais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo posiciona os estudos sobre a plasticidade da excitabilidade intrínseca na interseção entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica do SNC, conectando a validação mecanicista de alvos com o desenvolvimento de modelos translacionais.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre mecanismos de canais iônicos e plasticidade neuronal em células de relevo talâmicas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de excitabilidade adequadas para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece frequência do potencial de ação e resistência de entrada como saídas robustas e comparáveis para avaliação de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados de plasticidade intrínseca a modelos sensoriais e talâmicos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de ensaio ex vivo reutilizável para investigação de alvos e vias do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos no sistema nervoso central e na redução de riscos mecanicistas.
- Valor Operacional: Padroniza a indução e a mensuração da plasticidade da excitabilidade neuronal para fluxos de trabalho de P&D escaláveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou interromper programas do SNC direcionados a vias talâmicas e sensoriais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos de descoberta e pré-clínicos do SNC.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia com patch-clamp e preparo de fatias cerebrais ex vivo.
- Exige acesso a infraestrutura avançada de microscopia e registro eletrofisiológico.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de indução e na análise de dados.
- A adaptação a outras regiões cerebrais ou espécies pode exigir otimização do protocolo.
- A interpretação é limitada a condições ex vivo e pode não capturar plenamente a complexidade in vivo.
Perguntas Frequentes sobre Biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
