Name: Análise Qualitativa e Quantitativa da Produção de Siróforos de Pseudomonas aeruginosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Aprenda a quantificar siróforos, pioverdina e piochelino em Pseudomonas aeruginosa usando análise espectrofotométrica. Este protocolo simplificado permite estudar fatores de virulência bacteriana em laboratórios de menor porte.

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Os autores agradecem o financiamento do DBT - Programa de Ensino em Biotecnologia, do DBT - Programa BUILDER e do FIST. MR agradece a bolsa recebida da SHODH. HP agradece bolsa recebida da CSIR.

Todos os isolados bacterianos de P. aeruginosa foram obtidos de laboratórios de microbiologia médica de Vadodara e Jaipur, Índia. Todos os isolados clínicos selecionados foram manuseados em Gabinete de Biossegurança (BSL2) e o máximo cuidado foi tomado ao manusear isolados bacterianos durante os experimentos. Os detalhes comerciais de todos os reagentes/soluções são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Preparação do corante Cromo Azurol Sulfonato (CAS) e meio ágar
<ol><li>Preparar corante CAS (100 mL) com a seguinte composição:<ol><li>Dissolver 60 mg de CAS em 50 ml de água destilada (Solução 1).</li>
		<li>Dissolver 2,7 mg de FeCl3·6H2O em 10 ml de HCl 10 mM (Solução 2).</li>
		<li>Dissolver 73 mg de brometo de cetrimônio (HDTMA) em 40 mL de água destilada (Solução 3).</li>
		<li>Misture cuidadosamente a Solução 1, a Solução 2 e a Solução 3. Guarde-o em uma garrafa de vidro.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o ágar CAS seguindo os passos abaixo:<ol><li>Adicionar 100 ml de solução salina MM9 a 750 ml de água destilada.</li>
		<li>Dissolver 32,24 g de ácido livre de piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES).</li>
		<li>Adicione 15 g de ágar ágar. Autoclave e deixe esfriar.</li>
		<li>Adicionar 30 ml de solução estéril de Casamino ácido e 10 ml de solução estéril de glicose a 20% à mistura.</li>
		<li>Adicione 100 mL de corante CAS, misture e despeje em condições assépticas. NOTA: A preparação do meio MM9, da solução de Casamino e da 8-hidroxiquinolina é fornecida no ficheiro suplementar 1. O buffer PIPES é sensível ao pH. Ele não se dissolverá até que o pH 5,6 seja alcançado. Certifique-se de que o pH seja constantemente monitorado, pois quando o PIPES começar a se dissolver na água, ele diminuirá ainda mais o pH. Extrair Casamino ácido com o mesmo volume de 3% 8-hidroxiquinolina dissolvida em clorofórmio. Deixar a solução imiscível a 4 °C durante cerca de 20 minutos e recolher cuidadosamente a fase superior da solução sem perturbar a fase inferior.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análise qualitativa da produção de sideróforos
<ol><li>Definir o OD600 nm para 0,2 para culturas cultivadas em 24 h de P. aeruginosa.</li>
	<li>Usando uma alça de arame estéril, listre a cultura bacteriana em uma placa de ágar CAS.</li>
	<li>Incubar a 30 °C durante 24 h. NOTA: Meio de água peptonada ou soro fisiológico 0,8% pode ser usado para diluir a cultura bacteriana. Se nenhum crescimento bacteriano for observado em 24 h, incubar as placas de CAS por 48 a 72 h.</li>
</ol>3. Estimativa quantitativa do total de sideróforos
<ol><li>Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio aquoso de peptona após ajuste de OD600 nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 48 h.</li>
	<li>Após 48 h, centrifugar a cultura bacteriana a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a centrifugação, adicionar 100 μL de sobrenadante livre de células a uma placa de microtitulação de 96 poços e adicionar 100 μL de corante CAS a ela.</li>
	<li>Cubra a placa com papel alumínio e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
	<li>Após a incubação, realizar leituras espectrofotométricas a 630 nm.</li>
	<li>Calcular os resultados obtidos para a quantificação do total de sideróforos como Unidade Percentual de Siróforo (PSU). NOTA: A PSU pode ser calculada como: [(Ar - As)/Ar] x 100 onde, Ar = absorbância da referência a 630 nm, As = absorbância do sobrenadante livre de células da amostra. Para referência, o corante CAS deve ser adicionado a meios de água peptonados não inoculados. Encha todos os utensílios de vidro, tais como tubos de ensaio, frascos, etc., com HCl 6 M durante 2 h e lave-os duas vezes com água destilada para remover qualquer vestígio de ferro sobre eles.</li>
</ol>4. Estimativa quantitativa da pioverdina
<ol><li>Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio aquoso de peptona após ajuste de OD600 nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 48 h.</li>
	<li>Após 48 h, medir o OD600 nm do crescimento bacteriano antes de prosseguir.</li>
	<li>Centrifugar a cultura bacteriana a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a centrifugação, adicionar 100 μL de sobrenadante livre de células a uma placa de microtitulação de 96 poços e adicionar 100 μL de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a ela.</li>
	<li>Faça leituras espectrofotométricas a OD405 nm.</li>
</ol>5. Extração de pioquelina e espectrofotometria
<ol><li>Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio King's B (Arquivo Suplementar 1) após ajuste de OD600 nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 24 h.</li>
	<li>Após 24 h, tomar 100 mL de cultura e centrifugar a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após centrifugação, adicionar 5 mL de ácido cítrico 1 M ao sobrenadante. Extrair duas vezes com 50 mL de acetato de etila.</li>
	<li>Filtrar a fase orgânica com sulfato de magnésio através de um filtro de seringa. Conservar a fase orgânica filtrada a -20 °C.</li>
	<li>Fazer leituras espectrofotométricas a 320 nm. NOTA: Como a pioquelina é um composto altamente instável à temperatura ambiente, execute o processo de extração no gelo. Use uma seringa estéril de 50 mL para separação do filtro. Coloque o algodão na ponta da seringa e adicione 1 g de sulfato de magnésio. Fixe um filtro de seringa estéril na ponta da seringa e colete o filtrado em um tubo estéril.</li>
</ol>

Avaliação da produção de sideróforos a partir de isolados de Pseudomonas aeruginosa

<ol><li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li>
<li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li>
<li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores%3A+Pyoverdine%2C+pyochelin+and+pseudopaline%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711(2022).</li>
<li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li>
<li>Dingemans, P., Cornelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li>
<li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudomonas+quinolone+signal+%28pqs%29%3A+Not+just+for+quorum+sensing+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li>
<li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermicrobial+interaction%3A+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li>
<li>Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+From+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li>
<li>Geum-Jae-Jeong,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li>
<li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).</li>
<li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isochorismate+synthase+%28pcha%29%2C+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%26+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li>
<li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+microplate+method+%28biolog+mt2%29+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance%2Fsensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li>
<li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+pyoverdines%2C+pseudomonas+primary+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li>
<li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li>
<li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa%3A+Physicochemical+characterization+of+the+iron%28iii%29%2C+copper+%28ii%29+and+zinc+%28ii%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li>
<li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li>
<li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li>
<li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+sensitive+LC%2FMS%2FMS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).</li>
<li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li>
<li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li>
<li>Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+and+syntheses+of+siderophores%2C+microbial+iron+chelators%2C+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe3+ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe3+ do complexo CAS-Fe3+, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em halo alaranjado claro ao redor do crescimento bacteriano14,15. Embora as bactérias possam ser diretamente estriadas nas placas de ágar CAS, os resultados gerais podem ser afetados. Estancar um alto número de células bacterianas pode criar um grande halo laranja em torno do crescimento bacteriano, enquanto o uso de menos células bacterianas pode resultar em uma zona clara estreita. Para resolver isso, nós estriamos um número uniforme de células bacterianas ajustando o OD600. Bactérias fastidiosas podem apresentar resultados em 24 h, enquanto bactérias de crescimento lento podem levar mais de 72 horas para demonstrar a produção de sideróforos.
Para a determinação quantitativa de sideróforos totais, inicialmente foi empregada a espectroscopia clássica, que necessita de um volume significativo de sobrenadante para a detecção de sideróforos, tornando-a impraticável. A quantificação dos sideróforos totais é agora realizada usando uma placa de 96 poços com um ensaio CAS modificado. Essa abordagem resultou em redução no uso de reagentes, sobrenadante bacteriano, tempo e aumento da acurácia em relação aos métodos espectroscópicostradicionais16. Outros estudos também relataram o uso de placas de microtitulação como método mais eficiente e de economia de tempo17. A quantificação de sideróforos totais usando uma placa de microtitulação provou ser uma abordagem eficiente. Neste estudo, culturas bacterianas de 48 h cultivadas em meio livre de ferro foram selecionadas para exame. Um estudo comparativo também foi realizado para avaliar a produção de sideróforos em diferentes meios de cultura, como Caldo Luria, Caldo Luria (extraído com 3% de 8-hidroxiquinolina), meio King B (extraído com 3% de 8-hidroxiquinolina) e meio aquoso de peptona (extraído com 8-hidroxiquinolina a 3%). Observou-se que o meio aquoso peptonado exibiu a maior quantidade de produção de sideróforo e, portanto, foi selecionado para experimentos posteriores. Um gráfico mostrando a produção de sideróforos em diferentes meios de crescimento está incluído na Figura Suplementar 1.
A pioverdina pode ser detectada e quantificada usando leituras espectrofluorimétricas, mas apenas a pioverdina é conhecida por exibir fluorescência. A pioverdina em complexo com íons Fe3+ não apresenta fluorescência18,19. Para detecção e quantificação da pioverdina, culturas bacterianas de 48 h foram selecionadas para o estudo. P. aeruginosa é conhecida por produzir pioquelina sob condições iniciais de privação de ferro e muda para a produção de pioverdina após exposição a condições severas de estresse por ferro. Foi demonstrado que a pioverdina pode quelar outros cátions metálicos, como alumínio, gálio, manganês e cromo, mas apenas o ferro é transportado com sucesso para a membrana celular19.
Assim como os sideróforos totais e a pioverdina, a pioquelina não pode ser quantificada diretamente do sobrenadante livre de células e deve ser extraída com diclorometano20. O diclorometano é imiscível com o sobrenadante livre de células e forma uma camada separada no fundo. Neste estudo, vários meios nutritivos foram testados, incluindo caldo Luria, água peptonada e meios de Casaminoácidos, mas uma quantidade significativa de pioquelina foi obtida a partir do meio King B . Embora Hoegy e col. tenham utilizado a via CAA em seu protocolo, nós a modificamos com a média King B de King, uma vez que a média CAA não suportava o crescimento bacteriano21. O método foi modificado pela extração de meios nutritivos com 8-hidroxiquinolina para remover quaisquer resíduos de ferro do meio, criando um meio deficiente em ferro. Adicionalmente, o tempo de incubação afetou significativamente a produção de pioquelina. demonstraram que P. aeruginosa muda da produção de pioquelina para pioverdina em condições severas limitantes de ferro12. Neste estudo, a extração e detecção de pioquelina foram realizadas a partir de culturas bacterianas de 24 h, uma vez que a pioquelina não foi detectada em culturas de 48 h. O volume do sobrenadante também afeta a detecção de pioquelina e, assim, 100 mL de sobrenadante livre de células foram usados para extração. Além disso, a produção de pioquelina foi significativamente maior nos isolados MR1, TL7 e J3, possivelmente devido a cepas bacterianas que são incapazes de produzir pioverdina, apesar de terem quelantes potentes de ferro22.
introduziram uma abordagem nova e sensível para a quantificação de pioquelina, validando-a usando LC/MS/MS. Entretanto, esse método só foi aplicado em isolados de P. aeruginosa do escarro de pacientes com fibrose cística. O LC/MS/MS, por ser uma instalação dispendiosa, pode não ser acessível para a maioria dos laboratórios23. desenvolveram um biossensor bioluminescente baseado em células inteiras, que permite a quantificação rápida, sensível e em etapa única da pioquetina. Entretanto, este método não pode fornecer quantificação para sideróforos totais e pioverdina24.
Sistemas sideróforos de captação de ferro poderiam ter uma aplicação antimicrobiana na liberação de fármacos para bactérias multirresistentes, uma vez que desempenham um papel crucial na sobrevivência e virulência bacteriana. Essa abordagem pode oferecer uma nova forma de combater bactérias multirresistentes25. Fármacos que não conseguem penetrar na membrana celular bacteriana podem estar ligados a um sideróforo, e o complexo Fe-sideróforo resultante pode ser transportado para dentro da membrana bacteriana26.

Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA1. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos2. Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante é ativamente transportado de volta para a célula3.
P. aeruginosa é conhecida por produzir dois sideróforos, pioverdina e piochelina. Sabe-se que a pioverdina tem maior afinidade quelante de ferro (1:1), enquanto a pioquelina é conhecida por ter menor afinidade quelante de ferro (2:1)4. A pioquelina também é chamada de sideróforo secundário por apresentar menor afinidade quelante ao ferro5. A produção e regulação de sideróforos são ativamente controladas por sistemas Quorum Sensing (QS) em P. aeruginosa6.
Além da têmpera do ferro, os sideróforos também estão envolvidos na regulação dos fatores de virulência e desempenham um papel ativo na formação do biofilme7. Os sideróforos desempenham funções cruciais adicionais, incluindo envolvimento na sinalização celular, defesa contra o estresse oxidativo e facilitação de interações entre comunidades microbianas8. Os sideróforos são tipicamente categorizados com base nos grupos funcionais específicos através dos quais eles quelatam ferro. Os três ligantes bidentados primários nesta classificação são catecolato, hidroxamato e α-hidroxicarboxilato3. Pioverdinas são características de espécies fluorescentes de Pseudomonas, como P. aeruginosa e P. fluorescens5. Eles consistem de um cromóforo fluorescente verde misto acoplado a um oligopeptídeo contendo 6-12 aminoácidos. Várias sintetases peptídicas não ribossomais (NRPs) estão envolvidas em sua síntese9. Quatro genes envolvidos na produção e regulação da pioverdina são pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD10. A pioverdina também é responsável pela infecção e virulência em mamíferos11. Observa-se que a P. aeruginosa produz pioquelina em condições moderadas limitantes de ferro, enquanto a pioverdina é produzida durante ambientes limitantes severos de ferro12. Dois operons envolvidos na produção de pioquelina são pchDCBA e pchEFGHI13. Nota-se que, na presença de piocianina, a pioquelina (catecolato) induz dano oxidativo e inflamação e gera radicais hidroxila, que são prejudiciais aos tecidos do hospedeiro11.
O ensaio Chrome Azurol Sulfonate (CAS) é amplamente adotado devido à sua abrangência, alta sensibilidade e maior conveniência em comparação com ensaios microbiológicos, que, embora sensíveis, podem ser excessivamente específicos14. O ensaio CAS pode ser realizado em superfícies de ágar ou em solução. Ele depende da mudança de cor que ocorre quando o íon férrico faz a transição de seu intenso complexo azul para laranja. O ensaio colorimétrico CAS quantifica a depleção de ferro de um complexo ternário Fe-CAS-surfactante. Este complexo particular, consistindo de metal, corante orgânico e surfactante, tem uma cor azul e exibe um pico de absorção em 630 nm.
Este trabalho apresenta um método para a detecção qualitativa da produção de sideróforos, onde se pode detectar a produção de sideróforos em uma placa de ágar. Um método para a estimativa quantitativa da produção total de sideróforos em uma placa de microtitulação e a detecção e análise quantitativa de dois sideróforos, pioverdina e piochelina, de P. aeruginosa, também é fornecido.

<table><tbody><tr><td>Ágar ágar, tipo I</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>8-hidroxiquinolina</td><td>Loba Chemie</td><td>4151</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acid</td><td>SRL Chemicals</td><td>68806</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)</td> <td>HIMEDIA</td><td>RM4867-100G</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>1070242521</td><td></td></tr><tr><td>sulfonato de azurol de cromo</td><td>HIMEDIA</td><td>RM336-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Merck</td><td>100241</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose monohidratada</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Merck</td><td>107020</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto férrico hexahidratado</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM6353</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro</td><td>Borosil</td><td>5100021</td><td></td></tr> tubos <tr><td>de ensaio de vidro</td><td>Borosil</td><td>9820U05</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SDFCL</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>King's medium B base</td><td>HIMEDIA</td><td>M1544-500G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sais médios mínimos</td><td>HIMEDIA</td><td>G013-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio&nbsp;</td><td>Qualigens</td><td>10034</td><td></td></tr><tr><td>MultiskanGO Espectrofotômetro UV</td><td>Thermo Scientific</td><td>51119200</td><td></td></tr><tr><td>Peptona Tipo I, Bacteriológico</td><td>HIMEDIA</td><td>RM667-500G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES ácido livre</td><td>MP Biomedicals</td><td>190257</td><td></td></tr><tr><td>Potássio di-hidrogenofosfato</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptona</td><td>HIMEDIA</td><td>RM005-500G</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Shimadzu</td><td>2072310058</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Laborzentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3-18K</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Qualigens</td><td>15915</td><td></td></tr></tbody></table>

análise qualitativa e quantitativa da produção de siróforos de pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.
O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe3+-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.

Antes da quantificação dos sideróforos dos isolados clínicos, foi realizada uma triagem qualitativa para a produção de sideróforos para garantir a produção de sideróforos. A detecção qualitativa de sideróforos de isolados clínicos foi observada por bactérias em placas de ágar CAS. Três isolados clínicos, MR1, TL7, J3, juntamente com PAO1 (a cepa de referência), foram selecionados para o estudo. Todos os três isolados clínicos e PAO1 apresentaram resultados positivos para a produção de sideróforos, onde um halo laranja claro ao redor do crescimento bacteriano na superfície do ágar azul indicou produção positiva de sideróforo (Figura 1). A formação de halo no ágar CAS (Figura 1) forneceu uma estimativa aproximada da produção de sideróforos pelos isolados clínicos. Assim, foi realizada a estimativa quantitativa da produção de sideróforos utilizando o reagente CAS e o meio líquido.
A quantificação total do sideróforo foi realizada diretamente do sobrenadante livre de células. Após a incubação, uma mudança de cor foi observada onde a cor amarela indicou a remoção do corante CAS do complexo Fe. Neste caso, utilizou-se como controle o corante CAS com meio de cultura não inoculado, o qual foi levado para o cálculo dos sideróforos. Não houve diferença significativa na produção total de sideróforos nos isolados MR1 e TL7, enquanto houve produção total significativa de sideróforos em J3 em relação à PAO1 (Figura 2).
Em seguida, a quantificação da pioverdina foi realizada diretamente a partir de sobrenadantes livres de células. Pioverdinas são liberadas em ambientes celulares, então o sobrenadante livre de células foi usado para quantificação de pioverdina. Também foi realizada varredura na faixa UV por espectrofotômetro, onde o pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina (Figura 3A). As leituras espectrofotométricas foram realizadas em 405 nm, e os resultados foram interpretados como OD405/OD600 nm. Todos os isolados apresentaram produção de pioverdina, onde os isolados MR1 e J3 apresentaram pioverdina significativamente menor em relação à PAO1, enquanto nenhuma diferença significativa foi observada para TL7 (Figura 3B).
A pioquelina não pode ser quantificada diretamente a partir do sobrenadante livre de células. Não foi possível extrair pioquelina de 1 mL de sobrenadante livre de células, por isso foi extraído de 100 mL de sobrenadante livre de células. Foi acidificado com ácido cítrico 1 M. Como a pioquelina é um composto altamente instável, o processo de extração foi realizado em gelo. A detecção de pioquelina foi realizada por meio de uma varredura na faixa de UV de 300 a 600 nm, onde o pico em OD320 nm confirmou a presença de pioquelina (Figura 4A). A quantificação de pioquelina foi realizada por meio de leituras espectrofotométricas em OD320 nm. Os cálculos foram feitos dividindo-se OD320/OD600. Os isolados MR1, TL7 e J3 apresentaram produção significativamente maior de pioquelina em relação ao isolado referência PAO1 (Figura 4B).
A produção comparativa de sideróforos em vários meios de cultura bacterianos foi realizada para verificar a quantidade de sideróforos totais produzidos em vários meios de crescimento. Quatro diferentes meios foram selecionados, onde o caldo Luria, o meio King B e a água peptonada foram extraídos com 3% de 8-hidroxiquinolina e o caldo Luria não extraído foi selecionado para o estudo. Não houve diferença significativa entre a produção de sideróforo em caldo Luria extraído, meio King B e meio água peptona, enquanto uma diferença significativa foi observada para produção de sideróforo em caldo Luria não extraído.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2.jpg"> Figura 1: Produção de sideróforos em ágar CAS. O crescimento de P. aeruginosa em placas de ágar CAS de culturas cultivadas com 24 horas foi observado em placas de ágar CAS e incubado a 30 °C por 24 h. A presença de sideróforo é indicada por um halo alaranjado ao redor da colônia bacteriana (PAO1, MR1, TL7 e J3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2.jpg"> Figura 2: Produção total de sideróforos. A produção total de sideróforos foi avaliada para PAO1 e três isolados clínicos (MR1, TL7 e J3). 100 μL de sobrenadante livre de células (de PAO1, MR1, TL7 e J3 cultivados por 24 h em caldo de água peptonada) foi adicionado a uma placa de microtitulação de 96 poços, depois 100 μL de corante CAS adicionados a ela. O teste ANOVA one-way foi realizado para significância estatística. As barras de erro representam ± desvio padrão (DP) entre três réplicas biológicas. *corresponde a p &lt; 0,05; ns corresponde a p &gt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2.jpg"> Figura 3: Produção de pioverdina. Produção de pioverdina da cepa PAO1 de P. aeruginosa e isolados clínicos (MR1, TL7 e J3) avaliados após 24 h de crescimento em meio aquoso peptônico. As culturas bacterianas foram centrifugadas e 100 μL de sobrenadante livre de células foram adicionados a uma placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, 100 μL de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) foram adicionados a ele. A detecção de pioverdina foi feita por espectrofotometria UV com variação de 350 nm a 600 nm. Análise espectrométrica a 380 nm da produção de pioverdina (A). Quantificação da produção de pioverdina (B). As barras de erro indicam o erro padrão sobre a média dos experimentos em triplicata. As barras de erro representam ± SD entre três réplicas biológicas. corresponde a p &lt; 0,0001, **corresponde a p &lt; 0,01 e ns corresponde a p &gt; 0,05 com base no teste One-way ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2.jpg"> Figura 4: Produção de pioquelina. Produção de pioquelina de PAO1 (usado como referência) e isolados clínicos (MR1, TL7 e J3) usando extração com acetato de etila e sulfato de magnésio. Análise espectrofotométrica com intervalo de 230 nm a 400 nm (A). Quantificação de pioquelina (B). Três experimentos independentes foram realizados para cada isolado. As barras de erro representam ± SD entre três réplicas biológicas. corresponde a p &lt; 0,001 com base no teste One-way ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/65980fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Produção comparativa de sideróforos em vários meios de crescimento bacteriano. Produção total de sideróforos em quatro diferentes meios de crescimento, onde os meios King B de King, meio de água de peptona e caldo Luria foram extraídos com 3% de 8-hidroxiquinolina para remover qualquer traço de ferro, e o caldo Luria (não extraído) foi selecionado. A extração por 8-hidroxiquinolina a 3% foi realizada adicionando-se um volume igual de 8-hidroxiquinolina a 3% ao meio. As barras de erro representam ± SD entre três réplicas biológicas. **corresponde a p &lt; 0,001 e ns corresponde a p &gt; 0,5 com base no teste One-way ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Receitas de mídia utilizadas para o presente estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65980/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para visualizar o arquivo.</a>

Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.

Análise Qualitativa e Quantitativa da Produção de Siróforos de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Os sideróforos formam complexos com ferro e o transportam para dentro da célula durante condições limitantes de ferro. Os sideróforos são potentes fatores de virulência que ajudam no estabelecimento de infecção grave no hospedeiro e são conhecidos por desempenhar um papel na regulação do quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa. Nosso trabalho tem como objetivo estimar quantitativamente a produção de sideróforos em Pseudomonas.Os sideróforos são moléculas extracelulares, de modo que sideróforos totais, juntamente com pioverdina e pioquelina são quantificados usando sobrenadante livre de células. Como a pioquelina não é detectada em pequeno volume, a extração é realizada a partir de um grande volume de sobrenadante livre de células. Recentemente, LCMS e biossensores foram desenvolvidos para quantificação de pioquelina.O LCMS é uma configuração dispendiosa para pequenos laboratórios, enquanto os biossensores são capazes de quantificar apenas piochelina. Este protocolo simples e ilustrado utiliza reagentes mínimos de laboratório e instrumentação, e permite estimar o sideróforo a partir do sobrenadante livre de células usando menos tempo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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