Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia
8 de novembro de 2006
Ok, então o que gostaria de fazer hoje é mostrar como construir uma câmara de fluxo, uma câmara de fusão para imagens em um microscópio invertido. Em seguida, crio dois espaços usando filme. Para isso, pego o filme de parafina e o corto em tiras pequenas.
Em seguida, vou fazer isso, o que basicamente formará os canais para as paredes, e eu os seco com um fluxo de ar inclinado. Coloco a lamínula sobre o para, e aqui está o produto final. Depois, aqueço em um bloco térmico para derreter o para e, essencialmente, criar um selamento.
O que temos aqui é o vidro de cobertura, e acima desse vidro de cobertura há duas camadas de phim, como você vê bem aqui. E acima disso, novamente, há um lamínula de 22 por 22 milímetros. Este aqui, que pressionei contra o param para formar o selo.
Ok, então o líquido entra em uma direção aqui e posso removê-lo com um papel filtro nesta direção. Vou mostrar como fazer isso em breve. O que gosto de fazer é colocá-lo em uma câmara umidificada, o que é muito simples.
Utilize dois tipos de tiras elevadas e coloque um filtro de papel por baixo. E para mantê-lo instável, como eu faço, coloque a lamínula na câmara de fluxo. Agora, a maneira de introduzir uma solução na câmara é simplesmente posicionar a ponta da pipeta na entrada da câmara e depositar a solução.
Agora, o que faço é incubar a câmara com a tampa fechada por 10 minutos. O que geralmente faço para aspirar o líquido do outro lado é usar um papel filtro cortado em tiras finas como esta. Pego uma dessas tiras finas e, simultaneamente, aplico a solução na entrada enquanto coloco o papel filtro na saída para aspirar a troca, a solução.
Então você verá o líquido fluindo pela solução. E então espero cinco minutos para o fechamento intermediário. Agora, estou pronto para colocar a actina, que preciso polimerizar; realizo a polimerização dentro da câmara de fluxo, usando exatamente os mesmos procedimentos anteriores.
Então, por isso, e agora que a ação está polimerizada, lavo todo o excesso de ação não polimerizada usando um grande volume de tampão apenas. Aqui, tenho cerca de cem microlitros, o que equivale a algumas volumes da câmara de reação de tampão. Sabe, quando o papel de filtro fica saturado, preciso mudar a direção. Está claro?
E então estou pronto para realizar a imagem com isso. Então, câmara de perfusão com actina ligada a ela. Agora pego a lâmina, coloco-a sob o microscópio e, como estou obtendo imagens com uma objetiva de imersão em óleo, vou colocar um pouco de óleo de imersão na superfície superior da lamínula, toque leve, de forma a avaliar a solução ou proteína ou qualquer coisa na actina interna.
O que faço é trocar a solução do meio enquanto realizo a aquisição de imagens com lapso de tempo. Assim.
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Visão Geral
Este artigo demonstra a construção de uma câmara de fluxo e uma câmara de fusão para imageamento em um microscópio ereto. O processo envolve a criação de canais usando parafina e o selamento com calor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
Antecedentes
- As câmaras de fluxo são essenciais para várias técnicas de imagem.
- A construção de uma câmara de fusão permite capacidades aprimoradas de imagem.
- O Parafilm é comumente usado em ambientes laboratoriais para criar selamentos.
- Compreender o processo de construção é fundamental para pesquisadores da área.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um guia passo a passo para a construção de uma câmara de fluxo.
- Ilustrar o uso de parafilm na criação de câmaras de imagem.
- Ampliar o acesso a técnicas de imagem para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Cortar o parafilm em tiras para formar canais.
- Secar as tiras com ar inclinado.
- Colocar uma lamínula sobre o parafilm.
- Aquecer o conjunto em um bloco térmico para criar um selo.
Resultados Principais
- Uma câmara de fluxo funcional foi construída com sucesso.
- O processo de vedação foi eficaz na criação de um ambiente estável para a aquisição de imagens.
- O método demonstrado é reprodutível para uso em laboratório.
- Os pesquisadores podem utilizar esta técnica para diversas aplicações de imagem.
Conclusões
- A construção de câmaras de fluxo e fusão é simples.
- Este método pode facilitar estudos avançados de imagem.
- O acesso a tais técnicas pode aprimorar os resultados da pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o preparo reprodutível de microambientes controlados para imagem de células vivas, apoiando estudos mecanicistas da dinâmica do citoesqueleto. Ao padronizar a montagem da câmara de fluxo, reduz a variabilidade em ensaios baseados em perfusão, melhorando a consistência dos dados entre equipes de pesquisa. O método facilita a análise quantitativa da cinética de desmontagem da actina, um processo fundamental na motilidade celular e na transdução de sinais, relevante para a validação de alvos em oncologia e imunologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da dinâmica de despolimerização da actina para investigar reguladores da remodelação do citoesqueleto.
- Valor Operacional: Fornece uma plataforma padronizada para testar os efeitos de compostos na renovação da actina em células vivas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Apoia o desenvolvimento de leituras baseadas em fluorescência para as taxas de desmontagem da actina como ponto final de ensaio funcional.
- Valor Operacional: Permite a troca de solução durante a aquisição de imagens com lapso de tempo para avaliar relações dose-resposta sob perfusão.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a dinâmica do actino com fenótipos celulares relevantes para metástase, invasão e formação da sinapse imunológica.
- Valor Operacional: Permite a avaliação pré-clínica de inibidores da via utilizando biomarcadores de imagem quantificáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a triagem de interação com o alvo até a validação funcional em sistemas celulares relevantes para a doença.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores do citoesqueleto por meio da visualização em tempo real do fluxo de actina.
- Triagem: Fornece medidas quantitativas e reprodutíveis do desmonte da actina sob condições controladas de perfusão.
- Análises: Gera dados de intensidade de fluorescência com resolução temporal, permitindo a modelagem cinética da renovação da actina.
- Pesquisa Translacional: Conecta mecanismos moleculares a fenótipos celulares em modelos pré-clínicos de migração celular.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de perfusão reutilizável e adaptável a múltiplos alvos citoesqueléticos e tipos celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicista de alvos envolvidos na regulação da actina por meio de leituras funcionais diretas.
- Valor Operacional: O preparo padronizado das câmaras melhora a reprodutibilidade do ensaio entre diferentes locais e operadores.
- Valor Estratégico: Permite decisões precoces de avanço ou interrupção ao associar a modulação do alvo a desfechos funcionais no citoesqueleto.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos sobre fenótipos de motilidade e invasão celular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de células vivas e controle de fluxo em microfluidica.
- Depende do acesso a microscópios invertidos com controle ambiental e capacidade de perfusão.
- Necessita padronização da espessura do parafilm e dos parâmetros de vedação para garantir consistência entre as câmaras.
- A adaptação a diferentes tipos celulares pode exigir otimização das condições de revestimento da superfície e de polimerização da actina.
- As limitações práticas incluem os possíveis efeitos do estresse de cisalhamento sobre as células durante a perfusão prolongada, conforme observado no protocolo.
