Name: Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a construir câmaras de fluxo para microscopia de lapso de tempo usando parafilm e selagem térmica. Este método permite imagens de actina em microscópios verticais com estabilidade e reprodutibilidade.

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<ol><li> Construir uma câmara de fluxo, como mostrado no vídeo. Certifique-se que o selo parafilme é apertado e use lamínulas lavadas. </li><li> Incubar agente de ligação de actina na câmara para &#39;5-10. </li><li> Bloco não-específicos sítios de ligação na lamela de vidro com uma proteína de bloqueio. </li><li> Polimerizar actina no interior da câmara de fluxo em G-actina na polimerização buffer. </li><li> Washout actina unpolymerized fluindo em tampão em excesso. </li></ol>

monitoramento actina desmontagem com a time-lapse microscopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Ok, então o que gostaria de fazer hoje é mostrar como construir uma câmara de fluxo, uma câmara de fusão para imagens em um microscópio invertido. Em seguida, crio dois espaços usando filme. Para isso, pego o filme de parafina e o corto em tiras pequenas.Em seguida, vou fazer isso, o que basicamente formará os canais para as paredes, e eu os seco com um fluxo de ar inclinado. Coloco a lamínula sobre o para, e aqui está o produto final. Depois, aqueço em um bloco térmico para derreter o para e, essencialmente, criar um selamento.O que temos aqui é o vidro de cobertura, e acima desse vidro de cobertura há duas camadas de phim, como você vê bem aqui. E acima disso, novamente, há um lamínula de 22 por 22 milímetros. Este aqui, que pressionei contra o param para formar o selo.Ok, então o líquido entra em uma direção aqui e posso removê-lo com um papel filtro nesta direção. Vou mostrar como fazer isso em breve. O que gosto de fazer é colocá-lo em uma câmara umidificada, o que é muito simples.Utilize dois tipos de tiras elevadas e coloque um filtro de papel por baixo. E para mantê-lo instável, como eu faço, coloque a lamínula na câmara de fluxo. Agora, a maneira de introduzir uma solução na câmara é simplesmente posicionar a ponta da pipeta na entrada da câmara e depositar a solução.Agora, o que faço é incubar a câmara com a tampa fechada por 10 minutos. O que geralmente faço para aspirar o líquido do outro lado é usar um papel filtro cortado em tiras finas como esta. Pego uma dessas tiras finas e, simultaneamente, aplico a solução na entrada enquanto coloco o papel filtro na saída para aspirar a troca, a solução.Então você verá o líquido fluindo pela solução. E então espero cinco minutos para o fechamento intermediário. Agora, estou pronto para colocar a actina, que preciso polimerizar; realizo a polimerização dentro da câmara de fluxo, usando exatamente os mesmos procedimentos anteriores.Então, por isso, e agora que a ação está polimerizada, lavo todo o excesso de ação não polimerizada usando um grande volume de tampão apenas. Aqui, tenho cerca de cem microlitros, o que equivale a algumas volumes da câmara de reação de tampão. Sabe, quando o papel de filtro fica saturado, preciso mudar a direção. Está claro?E então estou pronto para realizar a imagem com isso. Então, câmara de perfusão com actina ligada a ela. Agora pego a lâmina, coloco-a sob o microscópio e, como estou obtendo imagens com uma objetiva de imersão em óleo, vou colocar um pouco de óleo de imersão na superfície superior da lamínula, toque leve, de forma a avaliar a solução ou proteína ou qualquer coisa na actina interna.O que faço é trocar a solução do meio enquanto realizo a aquisição de imagens com lapso de tempo. Assim.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Aprenda a construir câmaras de fluxo para microscopia de lapso de tempo usando parafilm e selagem térmica. Este método permite imagens de actina em microscópios verticais com estabilidade e reprodutibilidade.

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

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