Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia
8 de novembro de 2006
Ok, então o que eu gostaria de fazer hoje é mostrar a vocês como construir uma câmara de fluxo, uma câmara de fusão para imagens em um microscópio vertical. O que então eu faço é criar dois espaços usando filme. Então o que eu faço é pegar o filme para, cortá-lo em pequenas tiras.
Em seguida, isso basicamente formará os canais para as paredes, e eu os seco com ar inclinado. Coloquei a lamínula em cima do parágrafo, e aqui está o final. Então eu aqueço em um bloco de calor para derreter o parâmetro e basicamente criar um selo.
Então, o que é isso é o vidro de cobertura aqui, e então em cima do vidro de cobertura há duas camadas de phim, como você vê aqui. E então, além disso, novamente, há uma lamínula de 22 por dois metros de dois metros. Este aqui, que eu pressionei contra o param para derrubar o selo.
Ok, então o líquido entra em uma direção aqui e eu posso sugá-lo com um papel de filtro aqui nessa direção. E eu vou te mostrar como fazer isso daqui a pouco. Então, o que eu gosto de fazer é colocá-lo em uma câmara umidificada, o que é muito simples.
Pegue dois tipos de tiras elevadas e tenha um filtro de papel embaixo. E para mantê-lo barulhento enquanto eu, coloco a tampa, a lamínula na câmara de fluxo. Agora, a maneira como você introduz uma solução na câmara é que você apenas coloca a ponta da pipeta na entrada da câmara e você simplesmente divide.
Agora o que eu faço é incubar a câmara com a tampa fechada por 10 minutos. O que eu costumo fazer para sugar o líquido do outro lado é usá-lo, pegar um papel de filtro e cortá-lo em tiras finas assim. E eu pego uma dessas tiras finas e simultaneamente aplico a solução na entrada enquanto coloco o papel de filtro na saída para sugar a troca, a solução.
Então você verá o líquido fluindo através da solução. E então eu espero por cinco minutos para o meio do fechamento. Agora, o que estou pronto para fazer é realmente colocar a actina e a actina, eu realmente tenho que polimerizar, eu polimerizo dentro da câmara de fluxo e são os mesmos procedimentos anteriores.
Então, porque assim, e agora que a ação é polimerizada, eu lavo toda a ação não polimerizada em excesso usando um grande volume de apenas tampão. Então aqui eu tenho cerca de cem microlitros e são alguns volumes de câmara de reação de buffer. Apenas, você sabe, quando o papel de filtro fica saturado, eu tenho que mudar a direção. Okey?
E então estou pronto para fazer imagens com isso. Então, câmara de perfusão com actina ligada a ela. Agora eu pego a lâmina, coloco sob o microscópio e, como estou fazendo imagens com uma objetiva de óleo, vou colocar um pouco de óleo de imersão na superfície superior da tampa, toque de grama, para avaliar a solução ou proteína ou qualquer coisa ao agir dentro.
Então, o que eu faço é realmente trocar o lado da solução enquanto estou fazendo a imagem de lapso de tempo. Como tal.
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Visão Geral
Este artigo demonstra a construção de uma câmara de fluxo e uma câmara de fusão para imagens em um microscópio vertical. O processo envolve a criação de canais usando parafilm e selando-os com calor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
Fundamentos
- Câmeras de fluxo são essenciais para várias técnicas de imagem.
- A construção de uma câmara de fusão permite capacidades de imagem aprimoradas.
- Parafilm é comumente usado em ambientes laboratoriais para criar selos.
- Entender o processo de construção é crucial para pesquisadores na área.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um guia passo a passo para a construção de uma câmara de fluxo.
- Ilustrar o uso de parafilm na criação de câmaras de imagem.
- Melhorar a acessibilidade das técnicas de imagem para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Cortar parafilm em tiras para formar canais.
- Secar as tiras com ar inclinado.
- Colocar uma lâmina de cobertura sobre o parafilm.
- Aquecer o conjunto em um bloco de calor para criar uma vedação.
Principais Resultados
- Uma câmara de fluxo funcional foi construída com sucesso.
- O processo de vedação foi eficaz na criação de um ambiente estável para imagens.
- O método demonstrado é reproduzível para uso laboratorial.
- Os pesquisadores podem utilizar esta técnica para várias aplicações de imagem.
Conclusões
- A construção de câmaras de fluxo e fusão é direta.
- Este método pode facilitar estudos avançados de imagem.
- A acessibilidade a tais técnicas pode melhorar os resultados da pesquisa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible preparation of controlled microenvironments for live-cell imaging, supporting mechanistic studies of cytoskeletal dynamics. By standardizing flow chamber assembly, it reduces variability in perfusion-based assays, improving data consistency across discovery teams. The method facilitates quantitative analysis of actin disassembly kinetics, a key process in cell motility and signal transduction relevant to target validation in oncology and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of actin depolymerization dynamics to interrogate regulators of cytoskeletal remodeling.
- Operational Value: Provides a standardized platform for testing compound effects on actin turnover in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of fluorescence-based readouts for actin disassembly rates as a functional assay endpoint.
- Operational Value: Allows solution exchange during time-lapse imaging to assess dose-response relationships under perfusion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links actin dynamics to cellular phenotypes relevant to metastasis, invasion, and immune synapse formation.
- Operational Value: Enables preclinical assessment of pathway inhibitors using quantifiable imaging biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to functional validation in disease-relevant cellular systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytoskeletal regulators through real-time visualization of actin flux.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible measurements of actin disassembly under controlled perfusion conditions.
- Analytics: Generates time-resolved fluorescence intensity data enabling kinetic modeling of actin turnover.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular phenotypes in preclinical models of cell migration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion platform adaptable to multiple cytoskeletal targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in actin regulation through direct functional readouts.
- Operational Value: Standardized chamber preparation improves assay reproducibility across sites and operators.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by linking target modulation to functional cytoskeletal outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on cell motility and invasion phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and microfluidic flow control.
- Depends on access to upright microscopes with environmental control and perfusion capabilities.
- Necessitates standardization of parafilm thickness and sealing parameters for chamber-to-chamber consistency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of surface coating and actin polymerization conditions.
- Practical limitations include potential shear stress effects on cells during prolonged perfusion, as noted in the protocol.
