Name: Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares de amostras de grande volume usando um dispositivo microfluídico com fraçãoamento assimétrico por fluxo. Este método permite fluxo contínuo e automação para aplicações biomédicas.

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Agradecemos a todos os doadores que participaram deste estudo, ao pessoal do Banco de Dados Genômicos da Letônia por fornecer as amostras. O Instituto de Física do Estado Sólido da Universidade da Letónia, enquanto Centro de Excelência, recebeu financiamento do Programa-Quadro Horizonte 2020 da União Europeia H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 ao abrigo do acordo de subvenção n.º 739508, projeto CAMART2. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto nº do Conselho Letão de Ciência. lzp-2019/1-0142 e Projeto nº: lzp-2022/1-0373.

Dispositivo microfluídico para isolamento contínuo de vesículas extracelulares da urina humana

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A.A., G.M. e R.R. são fundadores, membros do conselho e acionistas da Cellbox Labs, LLC

O dispositivo microfluídico apresentado oferece um método promissor para o isolamento e extração de EVs de fluidos biológicos, abordando algumas das limitações críticas dos métodos padrão-ouro existentes, como UC e SEC12. A UC e a SEC são conhecidas por serem trabalhosas, demoradas e sofrerem de baixo rendimento, tornando-as menos adequadas para aplicações de alto rendimento, onde grandes quantidades de EVs são necessárias21,22. Em contraste, o dispositivo microfluídico descrito pode processar continuamente um volume substancial de até 20 mL de fluido biológico com entrada mínima do usuário, tornando-o um potencial divisor de águas para ambientes industriais ou clínicos. Uma das principais vantagens deste dispositivo microfluídico é sua capacidade de padronizar o isolamento de EV e melhorar a reprodutibilidade em comparação com métodos tradicionais que envolvem etapas manuais. Ao reduzir a variabilidade da fabricação de dispositivos de isolamento de veículos elétricos por meio da fabricação em massa, o desempenho do dispositivo pode ser melhor controlado e consistente, o que é vital para aplicações como terapêuticas e diagnósticos baseados em veículos elétricos. Além disso, a compatibilidade do dispositivo com a fabricação de grande volume por meio de moldagem por injeção de reação de substratos adequados aumenta ainda mais seu potencial de escalabilidade e adoção mais ampla.
Para garantir a reprodutibilidade e o desempenho consistente, é necessário um protocolo extenso e bem definido, tanto para a produção do chip quanto para sua utilização em experimentos. O chip é projetado com a industrialização em mente. No entanto, durante a fabricação do dispositivo em ambiente de laboratório, deve-se prestar atenção para evitar a formação de bolhas, garantir uma colagem precisa e robusta e realizar testes minuciosos em velocidades de fluxo mais altas do que as esperadas em experimentos reais. Essa precaução é especialmente importante para dispositivos COC-OSTE, pois eles podem ser propensos a vazamentos devido à ligação malsucedida, especialmente em taxas de fluxo mais altas. Além disso, como o OSTE é um material fotossensível, a fabricação do dispositivo deve ser realizada em luz amarela para evitar exposição desnecessária aos raios UV. Como essa tecnologia ainda está em seus estágios iniciais, os pesquisadores devem experimentar diferentes velocidades de fluxo para identificar o ajuste ideal para sua aplicação específica, uma vez que protocolos padronizados para esse novo método ainda não foram estabelecidos, e a viscosidade do líquido pode claramente afetar a eficácia do isolamento de EV com base em nossos resultados. Seguindo essas diretrizes e abordando os desafios da padronização, o potencial deste dispositivo microfluídico para isolamento de veículos elétricos pode ser totalmente realizado em várias áreas de pesquisa e aplicações.
O método de isolamento de EV usando o dispositivo microfluídico permite extensa modificação e solução de problemas para otimizar o desempenho. Para melhorar a separação de partículas, os pesquisadores podem explorar canais mais longos, diferentes porosidades de membrana e densidades de poros, e dimensões alteradas. Se houver muitas partículas grandes na saída de partículas pequenas, testar uma velocidade de entrada de buffer mais alta pode ser benéfico, enquanto se houver muitas partículas pequenas na saída de partículas grandes, recomenda-se experimentar um canal mais longo ou uma membrana com poros maiores. Abordar a absorção de partículas pode envolver o ajuste das velocidades de fluxo, modificações na superfície e composição OSTE ou alterar o tempo de exposição aos raios UV. Para dispositivos com instabilidade e vazamento, diminuir as velocidades de fluxo e garantir a colagem adequada são etapas cruciais. Para minimizar os danos do EV, os pesquisadores podem reduzir as velocidades de fluxo, lavar com PBS mais completamente após a esterilização do dispositivo e considerar o uso de poros de membrana menores ou técnicas e materiais alternativos de design de moldes. Através desses ajustes, o dispositivo microfluídico pode ser ajustado, liberando seu potencial para diversas aplicações em pesquisa de EV e campos relacionados. Além disso, para otimizar o desempenho do dispositivo, a caracterização da amostra a montante, incluindo medições de densidade e viscosidade, pode ser incorporada para ajustar os parâmetros de fluxo. Além disso, deve ser dada especial ênfase à natureza da amostra, dada a não esterilidade estabelecida dos biofluidos23. Consequentemente, a esterilização de amostras antes de sua administração em aplicações clínicas deve ser devidamente considerada.
Apesar desses desafios, o dispositivo microfluídico possui imenso potencial em diversas áreas de pesquisa. Sua capacidade de isolar continuamente EVs de grandes volumes de amostras altamente heterogêneas abre as portas para automação, facilitando aplicações de alto rendimento e permitindo análises mais aprofundadas de EVs de diversas fontes. A integração desse módulo microfluídico em diferentes dispositivos, como cartuchos de biorreator de células ocas de fibra ou citômetros de fluxo de alta resolução, poderia tornar as aplicações de veículos elétricos mais amigáveis à indústria e impulsionar a inovação em campos como entrega de medicamentos, diagnósticos e cosméticos4. Em geral, este dispositivo microfluídico representa um avanço significativo no campo da pesquisa de EV, oferecendo um método eficiente e padronizado para isolamento de EV com aplicações promissoras em uma ampla gama de pesquisas e ambientes industriais.

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas ligadas à membrana derivadas de células que compreendem dois tipos principais: exossomos (30-200 nm) e microvesículas (200-1000 nm)1. Os exossomos formam-se através do brotamento interno da membrana endossômica dentro de um corpo multivesicular (BVM), liberando vesículas intraluminais (ILVs) para o espaço extracelular após fusão com a membrana plasmática1. Em contraste, as microvesículas são geradas pelo brotamento externo e fissão da membrana celular2. Os EVs desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, transportando proteínas, ácidos nucléicos, lipídios e metabólitos, refletindo o estado fisiológico da célula, incluindo crescimento, angiogênese, metástase, proliferação e resistência à terapia3. Como resultado, têm emergido como promissores biomarcadores e alvos terapêuticos para doenças, incluindo o câncer, destacando seu potencial em sistemas diagnósticos e de liberação defármacos4.
Para utilizar plenamente os EVs no diagnóstico e na terapêutica de doenças, o isolamento eficiente de vários biofluidos é crucial5. Métodos comuns incluem ultracentrifugação (UC), centrifugação por gradiente de densidade, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), filtração e imunoisolamento6. A RCU é uma técnica amplamente utilizada, mas pode produzir partículas de densidade semelhante que não são EVs e podem gerar agregados de EV7. A SEC ganhou popularidade devido à sua capacidade de fornecer amostras de maior pureza, excluindo partículas com base no tamanho em vez da densidade8. No entanto, a seleção cuidadosa do tamanho apropriado dos poros para a coluna SEC e a otimização das condições cromatográficas são essenciais para minimizar o co-isolamento de partículas indesejadas como quilomícrons e lipoproteínas de baixa densidade8. Apesar de sua eficácia, ambos os métodos são demorados e desafiadores de automatizar, especialmente para amostras de maior volume, como meio celular ou urina, limitando sua escalabilidade para aplicações industriais9.
Nos últimos anos, o fracionamento assimétrico do campo de fluxo (A4F) evoluiu como uma poderosa técnica de separação para a separação de partículas de tamanho e empuxo de micro e nanométricas10. O princípio operacional da A4F baseia-se em um canal microfluídico dotado de uma membrana porosa em sua base, gerando uma força exercida em direção à membrana denominada fluxocruzado 10. Quando combinado com o movimento browniano e o fluxo de Poiseuille inerentes ao sistema, o fluxo cruzado facilita a separação eficiente das partículas devido à variação da posição das partículas dentro da dinâmica do fluxo11. Apesar dos benefícios, esse método é limitado a volumes de amostra dentro da faixa de microlitros12 e requer uma etapa adicional de focalização, estendendo a duração do processo10.
Na última década, a microfluídica ganhou destaque como uma ferramenta para separação rápida, eficiente e clinicamente confiávelde EV 13. No entanto, a maioria dos métodos microfluídicos projetados para separação de EV são otimizados para amostras de EV de pequeno volume e alta concentração ou dependem de procedimentos de separação complexos14. Além disso, no campo da microfluídica, o polidimetilsiloxano (PDMS) é reconhecido como o material padrão-ouro devido à sua transparência óptica, biocompatibilidade e facilidade de uso15. No entanto, sua conhecida propensão a absorver pequenas moléculas lipofílicas, incluindo EVs, pode ser problemática para sua aplicação no campo dosEV13.
O copolímero de olefina cíclica (COC) é um material frequentemente utilizado em microfluídica devido à biocompatibilidade, pequena absorção de moléculas e alta resistência química15. No entanto, a fabricação de dispositivos de AOC frequentemente envolve processos complexos ou equipamentos especializados16. Alternativamente, a estequiometria tiol-eno (OSTE) é uma alternativa promissora ao PDMS devido à diminuição da absorção de pequenas moléculas, estabilidade química superior, facilidade de fabricação e processo de fabricação escalável17,18. No entanto, devido às conexões complexas com a tubulação, os dispositivos podem ser propensos a vazamentos19.
O objetivo deste estudo foi projetar e fabricar um dispositivo microfluídico combinando OSTE e COC e o princípio A4F bifurcado para separação de EV de amostras de grande volume, como urina ou meios celulares.

<table><tbody><tr><td>0,1 &micro; m carboxilato FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F8803</td><td>Concentração de estoque: 3,6 x 1013 contas/mL (dependente do LOTE)</td></tr><tr><td>0,5 mL tubos de microcentrífuga</td><td>Starstedt</td><td>72.704</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de cone Luer de 1 mL de uso único sem agulha</td><td>RAYS</td><td>TUB1ML</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro; m poliestireno FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>#F13083</td><td>Concentração de estoque: 1 x 1010 contas/mL (dependente do LOTE)</td></tr><tr><td>10 mL Pipetas sorológicas</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL (100k) Amicon Ultra filtros centrífugos</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Protein LoBind seringas</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>20 mL</td><td>BD PlastikPak</td><td></td><td></td>10569215</tr><tr><td>250 &micro; Tubulação de poliéter éter cetona de identificação com m Darwin</td><td>Microfluídica</td><td>CIL-1581</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa MWCO unidades de filtro centrífugo</td><td>Merck Millipore,</td> <td>seringa médica de UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>5 mL sem agulha</td><td>Anhui Hongyu Wuzhou Medical</td><td>159646</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>rotor de ultracentrífuga de ângulo fixo de 70 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>800 &micro; Tubo de politetrafluoretileno</td><td>de identificação com m Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KTU-15</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços, fundo f, ligação médica</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655001</td><td>placa ELISA</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sem soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>SigmaAldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>COC Plataforma</td> <td>de lâminas de microscopia TopasPlataforma de microscopia Microfluídica</td><td>10000002</td><td></td></tr><tr><td>COC Topas 2 x 16 Mini Luer&nbsp;</td>Controlador de pressão <td>Microfluídico Chipshop</td><td></td> 10000387 <td></td></tr><tr><td>Elveflow OB1 Elvesys</td><td>Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conectores Luer</td><td>Darwin Microfluídica</td><td>&nbsp; CS-10000095</td><td></td></tr><tr><td>Alinhador de máscara Suss MA/BA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer Thinky ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td>analisador de nanopartículas&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio óptico Nikon Eclipse LV150N</td><td>Nikon Metrology NV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSTE 322 Crystal Clear</td><td>Mercene Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS TABLETS.Ca/Mg grátis. Biorreagentes Fisher. 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>PC membrana (diâmetro de poro de 50 nm, densidade de 11,8%)</td> <td>it4ip SA, Louvain-La Neuve, Bélgica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, estéril</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher GIGAbatch 360 M</td><td>PVA TePla America, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qEVoriginal/coluna de 35 nm</td><td>Izon</td><td>SP5</td><td>SEC coluna</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone QSIL 216</td><td>PP & S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina Resistente</td><td>Preto Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40 Ti rotor de ultracentrífuga oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>DK Infusetek</td><td>ISPLab002</td><td></td></tr><tr><td>T175 frasco de suspensão</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.502</td><td></td></tr><tr><td>TIM4-Fc proteína</td><td>Adipogen LifeSciences</td><td>AG-40B-0180B-3010</td><td></td></tr><tr><td>TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)</td><td>SigmaAldrich</td><td>T0440-100ML</td><td>Substrato de peroxidase de rábano</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>SigmaAldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima L100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade de limpeza ultrassônica P 60 H</td><td>Elma Schmidbauer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td> <td>de microplacas universalCopo de coleta de urina Bio-Tek instruments</td><td>71777-1</td><td></td></tr><tr><td>, 150mL, estéril</td> Filtro de seringa <td>APTACA</td><td>2120_SG</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 25</td><td>SigmaAldrich</td><td>68092002</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Sistema de</td><td>espalhamento dinâmico de luz (DLS) da Panalytical</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Zortrax Inkspire</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento em etapa Única de vesículas extracelulares de amostras de grande volume com dispositivo microfluídico a4f bifurcado

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

As vesículas extracelulares (EVs) têm imenso potencial para várias aplicações biomédicas, incluindo diagnóstico, entrega de medicamentos e medicina regenerativa. No entanto, as metodologias atuais de isolamento de EVs apresentam desafios significativos, como complexidade, consumo de tempo e necessidade de equipamentos volumosos, o que dificulta sua tradução clínica. Para resolver essas limitações, nosso objetivo foi desenvolver um sistema microfluídico inovador baseado em copolímero de olefina cíclica-off-estequiometria tiol-eno (COC-OSTE) para o isolamento eficiente de EVs de amostras de grande volume de forma contínua. Ao utilizar a separação baseada em tamanho e flutuabilidade, a tecnologia usada neste estudo alcançou uma distribuição de tamanho significativamente mais estreita em comparação com as abordagens existentes de amostras de urina e meios celulares, permitindo o direcionamento de frações específicas de tamanho de EV em aplicações futuras. Nosso projeto inovador de dispositivo microfluídico COC-OSTE, utilizando a tecnologia de fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico bifurcado, oferece uma abordagem de isolamento EV direta e contínua para amostras de grande volume. Além disso, o potencial de fabricação em massa deste dispositivo microfluídico oferece escalabilidade e consistência, tornando viável integrar o isolamento de EV em diagnósticos clínicos de rotina e processos industriais, onde alta consistência e rendimento são requisitos essenciais.

Fabricamos um dispositivo microfluídico usando um molde duplo negativo impresso em 3D (Figura 1) via litografia suave (Figura 2A) para separação EV de alto rendimento com base no princípio A4F bifurcado (Figura 2B,C). A configuração requer uma bomba e uma estação de passagem de fluxo, como pode ser visto na Figura 3, para o isolamento dos EVs de forma automatizada. Primeiramente, para avaliar a prova de conceito dos dispositivos, foi preparada uma mistura de esferas de poliestireno com diâmetros de 100 nm e 1000 nm para representar vesículas e restos de células finas, respectivamente10. Foram conduzidos experimentos com vazões variáveis para a mistura de cordões, com e sem fluxo bifurcante, para investigar o efeito da velocidade linear na eficiência de separação. Em todos os experimentos, a recuperação de pequenas esferas permaneceu consistente e acima de 90%10, mostrando o potencial do dispositivo para recuperar EVs.
Em seguida, avaliamos e comparamos o potencial do dispositivo COC-OSTE em isolar EVs de grandes volumes (&gt;1 mL) de biofluidos complexos com pré-processamento mínimo. Assim, urina de 10 doadores saudáveis (Figura 4) e meios celulares de duas linhagens diferentes de células prostáticas (Figura 5) foram usados como molde para isolar simultaneamente EVs seguindo três procedimentos diferentes: ultracentrifugação (UC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e o dispositivo OSTE-COC baseado em microfluídica A4F. Após o isolamento, o número total de partículas e sua distribuição de tamanho foram avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Em média, o dispositivo OSTE-COC apresentou melhor recuperação total de partículas de biofluidos em comparação com a RCU, mas a significância estatística só foi alcançada quando se combinaram os números de partículas de ambos os portos (Figura 4A). Para comparar o desempenho do dispositivo com outros sistemas, deve-se levar em consideração a tomada R &amp;L em conjunto. Como mostrado na Figura 4, o desempenho da saída L &amp; R na recuperação de EVs supera a UC e a SEC. Separadamente, a porta L foi projetada para capturar a pequena fração de EV, enquanto a porta R foi projetada para coletar a fração maior de EV com outras moléculas de tamanho semelhante. Curiosamente, a recuperação usando o R-PORT do dispositivo OSTE-COC foi ligeiramente maior do que SEC e UC isoladamente (Figura 4A). A expressão de CD63 mostrou padrão semelhante (Figura 4C). Esse achado indica que o dispositivo OSTE-COC foi mais efetivo na recuperação total da VE. Distribuição de tamanho equivalente foi encontrada entre as diferentes metodologias, com exceção da UC, que mostra uma maior distribuição granulométrica (Figura 4B).
Resultados comparáveis foram observados em culturas de meios celulares. Em ambos os cenários, a recuperação total de partículas de ambas as portas do dispositivo exibiu desempenho superior em comparação com as metodologias SEC ou UC (conforme ilustrado na Figura 5A,B). Notadamente, os EVs derivados de células PC3 demonstraram uma distribuição de tamanho distinta, com maior homogeneidade na distribuição L-PORT quando contrastados com outros grupos experimentais (Figura 5C,D). Além disso, a análise da expressão de CD63 confirmou as maiores taxas de recuperação de EV obtidas com o uso do dispositivo COC-OSTE (conforme ilustrado na Figura 5E,F). Um resumo comparando as características de isolamento das diferentes metodologias examinadas neste estudo pode ser encontrado na Tabela 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig01.jpg"> Figura 1: Dimensões do molde duplo negativo em forma de serpentina 3DP e visão isométrica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig02.jpg"> Figura 2: Dispositivo microfluídico COC-OSTE. (A) Esquema das diferentes etapas principais de fabricação do dispositivo OSTE-COC. (B) Princípio de funcionamento do dispositivo. (C) Imagem do dispositivo acabado. Barra de escala: 15 mm. Esse valor foi modificado com permissão de Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig03.jpg"> Figura 3: Configuração experimental do dispositivo. A bomba de seringa está à esquerda, o dispositivo OSTE-COC está no meio e a estação de recuperação está à direita. Esse valor foi modificado com permissão de Priedols et al.10 e Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig04.jpg"> Figura 4: Distribuição do tamanho do EV urinário e recuperação de partículas de 10 doadores usando ultracentrifugação (UC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e o dispositivo COC-OSTE. (A) Quantidade de partículas recuperadas de cada método de isolamento por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Dados representados como média +/- desvio padrão. Significância estatística denotada por * (p&lt;0,05). (B) Boxplots mostram a distribuição média do tamanho das partículas entre todas as amostras de urina avaliadas por NTA, com whiskers indicando os valores mínimo e máximo. Os valores de p foram derivados das comparações com a RCU, com **** indicando alta significância estatística (p&lt;0,0001). (C) A mediana e o intervalo da quantidade média de CD63, avaliados pelo ensaio imunoenzimático duplo-sanduíche (dsELISA), para cada método de isolamento, foram calculados em todas as amostras. L-port: Porta esquerda; R-port: Porta direita. Esse valor foi modificado com permissão de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66019/66019fig05.jpg"> Figura 5: Caracterização dos EVs isolados de células PC3 e LNCaP utilizando diferentes métodos. (A) Quantidade de partículas recuperadas do meio PC3 usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) representada por média+/- desvio padrão. (B) Quantidade de partículas recuperadas do meio celular LNCaP usando NTA representada como média +/- desvio padrão. (C) A distribuição granulométrica mediana dos EVs das culturas de PC3, juntamente com a amplitude, foi determinada por NTA. (D) Distribuição de tamanho mediana de EVs isolados de culturas LNCaP com intervalo. (E) Mediana e amplitude da expressão de CD63 para cada método de isolamento para EV derivado de linhagem celular PC3, usando ensaio imunoenzimático duplo-sanduíche (dsELISA). (F) Mediana e amplitude da expressão de EV CD63 derivada do LNCaP por dsELISA para cada método de isolamento. UC: Ultracentrifugação; SEC: Cromatografia de exclusão de tamanho; L-port: Porta esquerda; R-port: Porta direita. Esse valor foi modificado com permissão de Bajo-Santos et al.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66019/66019fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>UC</td>
			<td>SEGUNDO</td>
			<td>COC-OSTE</td>
		</tr><tr><td>Tempo de processamento/amostra</td>
			<td>++/+++</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Throughput</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Custo/amostra</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Pureza</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
		</tr><tr><td>Automatização</td>
			<td>++</td>
			<td>+</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Rendimento EV</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
		</tr><tr><td>Seleção de tamanho</td>
			<td>+</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1. Comparação das características de isolamento dos EVs com os três métodos: UC, SEC e o dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugação; SEC: Cromatografia de exclusão de tamanho. COC-OSTE: copolímero olefínico cíclico-fora-estequiometria tiol-eno. +: baixa; ++: médio; +++: alta. * Dispositivo dependente.

As vesículas extracelulares são imensamente promissoras para aplicações biomédicas, mas os métodos de isolamento atuais são demorados e impraticáveis para uso clínico. Neste estudo, apresentamos um dispositivo microfluídico que permite o isolamento direto de vesículas extracelulares de grandes volumes de biofluidos de forma contínua com passos mínimos.

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Vemos o potencial das vesículas extracelulares, mas também reconhecemos a dificuldade em seu isolamento, especialmente a partir de grandes amostras de biofluidos, como meios de biorreator. Nesta pesquisa testamos se podemos usar o fracionamento assimétrico de campo de fluxo para isolar vesículas extracelulares. A partir de agora, isolar vesículas extracelulares diretamente de biofluidos em um fluxo contínuo para integração em biorreatores é impossível.Em vez disso, os biofluidos devem ser primeiramente coletados e processados, adicionando variabilidade e trabalho. Nosso dispositivo projetado para isolamento de vesículas extracelulares de biofluidos de grande volume permite a integração com biorreatores para fluxo contínuo e automação. Descobrimos que a viscosidade do líquido pode afetar o isolamento de vesículas extracelulares usando fracionamento assimétrico de fluxo de campo.Estamos explorando se a adaptação de fluxos de biofluidos e tampão à viscosidade pode melhorar o isolamento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Fonte: Watson, D. C., et al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia de exclusão de tamanho com esferas de resina porosa para isolar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) de um filtrado de cultura bacteriana. EVs maiores eluem cedo, contornando os poros da resina, enquanto proteínas menores entram nos poros e eluem mais tarde.

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