Name: Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda a produzir vesículas derivadas do endossomo em larga escala usando homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética. Este método aumenta o rendimento e reduz custos para aplicações biomédicas.

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Os autores reconhecem o uso de instrumentos no Shared Instrumentation Core Facility do Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Academia Chinesa de Ciências. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC; 82172598), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang, China (LZ22H310001), o Projeto de Treinamento de Talentos em Saúde 551 da Comissão de Saúde da Província de Zhejiang, China, o Projeto de Pesquisa de Desenvolvimento Agrícola e Social do Departamento Municipal de Ciência e Tecnologia de Hangzhou (2022ZDSJ0474) e a Bolsa de Pesquisa Interdisciplinar de Qiantang.

Observação : um esquema do método é mostrado na Figura 1.
1. Preparação e isolamento de EM
<ol><li>Internalização celular de MNPs<ol><li>Cultura celular<ol><li>Suspender 1 × 10 6 células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato (BMSC), células 293T oucélulas de câncer epitelial de ovário de camundongo (ID8) em meio DMEM completo com soro fetal bovino (FBS) a 10% e solução de penicilina-estreptomicina (P/S) a 5% em 2 mL por placa de seis poços (ver Tabela de Materiais).</li>
			<li>Cultivar as células durante a noite a 37 °C e 5% CO2. NOTA: O número de células após a adesão foi de cerca de 1 × 106.</li>
		</ol></li>
		<li>Endocitose de MNPs<ol><li>Reduzir o volume médio de cada placa de seis poços para 1 mL. Co-cultivar as células com nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) modificadas com polilisina a 10 nm (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 100 μg/1 × 106 células e incubar a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2 durante 12 h para permitir que as células endocitose totalmente as IONPs.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e homogeneização de endossomos<ol><li>Tratamento hipotônico celular<ol><li>Digerir as células que internalizaram totalmente as IONPs com 0,5 mL/bem de tripsina por 3 min e finalizar a digestão adicionando 1 mL/meio bem completo.</li>
			<li>Centrifugar a 1000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em solução salina tampão fosfato (PBS) e centrífuga, repetidamente duas vezes para lavar o meio residual e as IONPs não absorvidas.</li>
			<li>Finalmente, ressuspenda o pellet em 8 mL em solução hipotônica pré-preparada (cloreto de potássio 71,4 mM, citrato de sódio 1,3 mM, pH 7,2-7,4) por 15 min (ver Tabela de Materiais).</li>
		</ol></li>
		<li>Liberação de organelas por homogeneização em baixa velocidade<ol><li>Transfira a suspensão celular em solução hipotônica para um tubo de ensaio de vidro e libere as organelas usando um homogeneizador de vidro (ver Tabela de Materiais) por 20 choques a 1000 rpm.</li>
		</ol></li>
		<li>Separação magnética para obtenção de endossomos<ol><li>Transfira 1 mL da solução celular homogeneizada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coloque em um separador magnético por 1 h para separar completamente os endossomos carregados com IONP de outras organelas (como núcleo e mitocôndrias) e detritos celulares.</li>
			<li>Coletar os pellets marrons na superfície de contato dos tubos de microcentrífuga próximos ao quadro magnético (ver Tabela de Materiais), ou seja, os endossomos carregados com IONP. Descarte o líquido nos tubos de microcentrífuga e adicione 3 mL de PBS para ressuspender os endossomos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização de alta velocidade<ol><li>Transferir a solução contendo os endossomos para um tubo centrífugo de 15 mL com volume líquido entre 3-10 mL.</li>
		<li>Estenda a sonda de 10 mm do homogeneizador de alta velocidade (ver Tabela de Materiais) até o fundo do tubo da centrífuga sem tocar na parte inferior. Ajuste o botão Velocidade sob a tela, defina a velocidade para 140 x g e ajuste o botão Tempo para definir o tempo de 5 minutos e pressione o botão OK .</li>
		<li>Pressione o botão Iniciar para realizar a homogeneização depois de colocar uma caixa de gelo sob a amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Classificação magnética para EMs<ol><li>Transferir a solução contendo nanovesículas obtidas da homogeneização em alta velocidade para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocá-la em um separador magnético por 1 h.</li>
		<li>Recolha o líquido que contém os EMs necessários. Tenha cuidado para não tocar na superfície dos tubos próximos à estrutura magnética, que adsorveu IONPs livres e EMs carregados com IONP.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Caracterização da MP (Figura 2 e Figura 3)
<ol><li>Análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS)<ol><li>Injetar 1 mL de amostra de MEs (20 μg/mL) ao longo da parede na cubeta e colocá-la no slot de amostra do instrumento DLS (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Abra o software DLS, selecione Teste de tamanho de partícula e inicie o teste.</li>
		<li>Meça a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteína BCA (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)<ol><li>Diluir os MEs com PBS para uma solução a 1 × 107-1 ×10 8 partículas/mL e injetá-los na câmara do instrumento NTA (ver Tabela de Materiais) usando uma seringa de 1 mL a uma taxa de fluxo de 500-1000 μL/min.</li>
		<li>Abra os 488 canais laser e certifique-se de que o número de EMs na interface do software esteja entre 100-300 e em movimento browniano.</li>
		<li>De acordo com o protocolo do fabricante, selecione o POP apropriado (EV-488) para garantir que a sensibilidade do instrumento seja adequada para a detecção de EM.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia eletrônica de transmissão (MET)<ol><li>Fixar os MEs (1 mg/mL) com igual volume de glutaraldeído a 5% por 30 min e quantificar a concentração de MEs como 1 mg/mL pelo kit de ensaio proteico BCA.</li>
		<li>Coloque uma gota de 10 μL de EMs no lado de carbono da malha de cobre e remova o excesso de líquido do lado com papel de filtro após 10 min. Adicione 10 μL de PBS e borre imediatamente com papel de filtro. Repita duas vezes para remover o excesso de glutaraldeído.</li>
		<li>Soltar 5 μL do contraste acetato de uranila e corar negativamente por 1 minuto e, em seguida, remover o excesso de contraste. Lavar três vezes com água deionizada e secar à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Grave a imagem por um MET a uma tensão de aceleração de 100 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha ocidental<ol><li>Adicionar 100 μL de tampão de lise celular e 5 μL de um cocktail de inibidores de protease de 50x às amostras (ver Tabela de Materiais). Misture delicadamente com uma pistola de pipeta e coloque no gelo por 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a solução a 1000 x g durante 10 min a 4 °C, quantificar a concentração proteica do sobrenadante com um kit de ensaio de proteína BCA e recolher.</li>
		<li>Misturar o sobrenadante de 100 μL com 25 μL de tampão de carga proteico de 5x e aquecer a 95 °C durante 10 minutos.</li>
		<li>Preparar géis de acordo com as instruções dos géis pré-formados. Carregar 15 μg de proteína por poço e executar por eletroforese em gel a 80 V. Espere a amostra correr para o gel de separação, mude para 100 V e, em seguida, transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose a 100 V, 60 min sob banho de gelo.</li>
		<li>Detectar os marcadores não específicos de EV (Calnexina) e biomarcadores de EV (Anexina e CD63) por western blotting (ver Tabela de Materiais). NOTA: Os anticorpos são diluídos de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Detecção in vitro da função EM
<ol><li>Rotulagem de EMs<ol><li>Misturar 1 μL de PKH26 com 250 μL de diluente C (1:250) para fazer 2x solução corante (4 × 10-6 M) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Misturar 250 μL de MEs (1 mg/mL) com 250 μL de solução corante 2x e soprar rapidamente com uma pistola de pipetagem.</li>
		<li>Incubar em RT por 2-5 min enquanto inverte suavemente o tubo da centrífuga.</li>
		<li>Adicione um volume igual de soro ou 1% de proteína de soro bovino e incube por 1 min para terminar a digestão.</li>
		<li>Remova o excesso de PKH26 por ultrafiltração com tubos de ultrafiltração de 1000 KD a 3000 x g por 30 minutos e repita três vezes adicionando PBS. Ressuspender o líquido restante para 500 μL com PBS e filtrar através de um filtro de 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de captação de células<ol><li>Inoculação celular: Sementes 1 × 106 células em placas confocais de 35 mm com 1 mL de DMEM contendo 10% de SFB e 5% de P/S, e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.</li>
		<li>Filtre os MEs com filtros de seringa estéreis de 0,22 μm para remover possíveis contaminações.</li>
		<li>Tratar as células com MEs marcados com PKH26 (10a 9 partículas/mL) por 8 h.</li>
		<li>Lavar três vezes com PBS, adicionar DAPI (10 ng/mL) e incubar por 10 min em TR.</li>
		<li>Adquira as imagens de fluorescência em microscopia confocal de varredura a laser usando os canais de laser de 405 nm e 561 nm (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>

Produção magnética otimizada de alto rendimento de nanovesículas derivadas de endossomas

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), eaau6977(2020).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAL-1+controls+multivesicular+body+biogenesis+and+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion.</a> J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).</li>
<li>Farooqi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+biogenesis%2C+bioactivities+and+functions+as+new+delivery+systems+of+natural+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds.</a> Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Castilletti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+induction+of+IFN-alpha+and+-gamma+by+SARS-CoV+also+in+the+absence+of+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication.</a> Virology. 341 (1), 163-169 (2005).</li>
<li>Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines+in+an+evolving+oncology+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape.</a> Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+mimetics+derived+from+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+ablate+neuroblastoma+tumor+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo.</a> Biomater Adv. 142, 213161(2022).</li>
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<li>Le, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+mild+isolation+of+intact+lysosomes+using+magnetic-plasmonic+hybrid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles.</a> ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).</li>
<li>Jeong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovesicles+engineered+from+ES+cells+for+enhanced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation.</a> Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).</li>
<li>Kooijmans, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+GPI-anchored+anti-EGFR+nanobodies+on+extracellular+vesicles+promotes+tumour+cell+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting.</a> J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).</li>
</ol>

D.W. e P.G. são co-inventores de um pedido de patente depositado pelo Instituto de Medicina Básica e Câncer (IBMC), Academia Chinesa de Ciências. O outro autor declara não haver conflitos de interesse.

Como substituto da terapia livre de células e de um sistema de liberação de fármacos em nanoescala, os EVs ainda não atenderam às suas expectativas clínicas, e um dos principais obstáculos é a falta de métodos escaláveis e reprodutíveis de produção e purificação6. Portanto, vários tipos de MEs têm sido desenvolvidos como análogos de EV com complexidade biológica semelhante14. Até o momento, o exemplo de EM mais comumente usado são as nanovesículas derivadas da membrana plasmática celular. A preparação dessas nanovesículas é relativamente fácil e direta, extrudando diretamente células parentais inteiras17. No entanto, as nanovesículas derivadas da membrana plasmática celular não podem recapitular os EVs nativos devido a duas desvantagens: primeiro, a origem biológica dessas nanovesículas é da membrana plasmática celular, que contém diferentes composições lipídicas e proteicas em comparação com os EVs nativos; Em segundo lugar, as contaminações, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios de organelas não-EV e debris celulares, causando inevitável heterogeneidade EM. Neste método, incubamos células com IONPs e coletamos endossomos carregados com IONP através de separação magnética, em seguida, geramos nanovesículas monodispersas via homogeneização de alta velocidade, eventualmente obtendo EMs livres de IONP por uma segunda rodada de separação magnética. Além disso, otimizamos as condições de preparação de ME explorando o impacto de diferentes parâmetros, como velocidade e tempo de homogeneização, no tamanho e rendimento de EM. Este protocolo tira proveito de um fenômeno biológico interessante: MNPs (por exemplo, IONPs de 10 nm) podem ser eficientemente internalizadas por quase todas as células via endocitose e acumuladas exclusivamente em endossomos, não em outras organelas. Este processo biológico único permitiu o isolamento de endossomos carregados com MNP sem contaminações não-EV via separação magnética. Em troca, nanovesículas preparadas por esses endossomos celulares purificados poderiam recapitular mais fielmente a complexidade biológica dos EVs nativos.
Além disso, o padrão-ouro do método de isolamento EV é a ultracentrifugação, que custa meios de cultura celular maciços e um longo tempo de processamento de mais de 5 h e produz apenas 1 × 107-1 × 108 partículas de 1 x 10 6 células6. Os métodos tradicionais de extrusão de células parentais inteiras incluem múltiplas etapas envolvendo extrusão de membrana de ultra-alta pressão e ultracentrifugação, que têm um rendimento relativamente maior, mas requerem equipamentos caros17. No entanto, o rendimento de produção de EM, a eficiência, o custo e a mão de obra são substancialmente melhorados utilizando nosso protocolo. O homogeneizador de alta velocidade é um equipamento comum e de baixo custo para um curto tempo de processamento de 5 min neste protocolo, e este método pode produzir até 100 vezes mais MEs de 1 × 106 células em comparação com EVs nativos. Entretanto, esse método apresenta algumas limitações, como a perda de proteínas endossômicas durante a homogeneização em alta velocidade, e tem sido demonstrado que MNPs endocitosadas por células podem ser transferidas para lisossomos, o que seria uma contaminação potencial18.
Em perspectiva, os MEs podem ser projetados para exercer funções biológicas importantes como seus homólogos nativos, o que pode servir como um novo e promissor tipo de terapêutica biológica. Substâncias bioativas (por exemplo, proteínas e ácidos nucléicos) podem ser integradas em MEs por meio da seleção de células parentais específicas (por exemplo, células-tronco19) ou modificação genética (por exemplo, proteínas de fusão20). Por exemplo, nanovesículas derivadas de células por extrusão de células-tronco embrionárias vivas têm um efeito positivo no processo de recuperação ou cicatrizaçãode feridas 19. A modificação genética é uma abordagem alternativa para gerar MEs com funções biológicas específicas. Por exemplo, quando as células foram transfectadas com vetores de nanocorpos anti-receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) fundidos a peptídeos de sinal de âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI), os nanocorpos de EGFR podem ser ancorados na superfície de EVs para atingir células tumorais que expressam EGFR20. Os MEs têm tido um bom desempenho como substituto da terapia livre de células e de um sistema de liberação de fármacos em nanoescala em múltiplos estudos pré-clínicos14, mas há uma falta de uma compreensão mecanicista abrangente da terapia baseada em EM ou EV com preocupações sobre a heterogeneidade e reprodutibilidade de EVs e MEs em investigações clínicas. Em conjunto, as funções biológicas dos MEs e suas implicações clínicas justificam novas investigações.

Vesículas extracelulares (EVs) são pequenas vesículas secretadas por quase todas as células com uma faixa de tamanho de 30-150 nm, contendo substâncias bioativas abundantes. Dependendo da célula de origem, os EVs apresentam alta heterogeneidade, possuindo múltiplos componentes específicos das células-mãe1. Os EVs são liberados em fluidos corporais e transportados para locais distantes, onde são absorvidos pelas células-alvo para a ação2, que podem ser utilizados para fornecer uma ampla gama de moléculas bioativas e fármacos para reparo tecidual, diagnóstico e tratamento tumoral e modulação imunológica 3,4. No entanto, outras nanopartículas biológicas (por exemplo, lipoproteínas) e nanovesículas (por exemplo, EVs derivados de vias não endossomais) com propriedades biofísicas semelhantes em fluidos corporais inevitavelmente afetam o isolamento e a purificação de EV. Até o momento, a ultracentrifugação continua sendo o padrão ouro para o isolamento de EV, e outros métodos de isolamento, incluindo centrifugação por gradiente de densidade de sacarose, ultrafiltração, precipitação de polietilenoglicol, cromatografia e isolamento de esferas imunomagnéticas, foram desenvolvidos5. O gargalo atual que limita a tradução clínica e a comercialização da terapêutica de EV é a grave falta de técnicas de isolamento que permitam o isolamento altamente escalável e reprodutível dos EVs 6,7,8. As técnicas tradicionais de isolamento de EV (por exemplo, ultracentrifugação e cromatografia de exclusão de tamanho) sofrem de baixo rendimento (1 x 107-1 x 108/1 x 106 células), longo ciclo de produção (24-48 h), baixa reprodutibilidade da qualidade do produto e requerem equipamentos de produção caros e intensivos em energia que não podem atender à demanda clínica atual de EVs6.
Os exossomos miméticos (EMs), substitutos sintéticos de EVs nativos, têm atraído atenção importante devido à sua estrutura, função e escalabilidade altamente semelhantes na produção. A principal fonte de MEs provém da extrusão direta de células parentais inteiras com secção contínua 9,10, demonstrando potentes funções biológicas como EVs nativas11,12. Por exemplo, os MEs derivados de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hUCMSCs) exercem efeitos de cicatrização semelhantes aos EVs nativos e são mais ricos em composição proteica13. Embora os MEs derivados de células inteiras tenham a complexidade biológica dos EVs, sua principal desvantagem é a heterogeneidade dos produtos, porque eles são inevitavelmente contaminados por várias organelas celulares e detritos celulares. A análise da localização de proteínas revelou ainda que os MEs derivados da extrusão de células inteiras contêm muitas proteínas não-EVs específicas da mitocôndria e do retículo endoplasmático13. Além disso, a maioria dos métodos de fabricação de MEs ainda requer ultracentrifugação, um processo altamente demorado e que consome energia14. Considerando o fato de que os exossomos são exclusivamente derivados de endossomos celulares, levantamos a hipótese de que nanovesículas derivadas de endossomos biomodificados podem recapitular melhor a homologia biológica entre exossomos e MEs em comparação com os MEs derivados da membrana celular bem estabelecidos produzidos pelo método de extrusão de célulasinteiras 14. No entanto, a fabricação de nanovesículas derivadas do endossomo é difícil devido à falta de abordagens viáveis.
Estudos clínicos têm sido realizados utilizando EVs como substituto da terapia livre de células e um sistema de liberação de fármacos em nanoescala para o tratamento de várias doenças. Por exemplo, EVs derivados de células-tronco mesenquimais da medula óssea foram usados para tratar pneumonia grave causada por COVID-19 e alcançaram resultados promissores. Recentemente, EVs geneticamente modificados carregando proteínas CD24 também demonstraram benefícios terapêuticos potentes para o tratamento de pacientes com COVID-1915,16. No entanto, a necessidade clínica da terapia EV ainda não pode ser atendida com os métodos tradicionais de isolamento, devido ao baixo rendimento e custo. Este estudo relata a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo através de uma abordagem de homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética. Ele aproveita a via de endocitose de MNPs para isolar endossomos carregados com MNP via separação magnética, seguida de homogeneização de alta velocidade para formular endossomos em nanovesículas monodispersas. Como os tipos de endossomos coletados por este protocolo são diversos, mais pesquisas ainda são necessárias para estabelecer boas práticas de fabricação (BPF) na indústria. Esta nova abordagem de preparação de EM é mais eficiente em termos de tempo (5 min de homogeneização de alta velocidade) para obter nanovesículas homólogas a EVs nativos. Produz exponencialmente mais vesículas a partir das mesmas quantidades de células do que a ultracentrifugação, que pode ser geralmente aplicada a vários tipos celulares.

<table><tbody><tr>Anticorpo <td>ABclonal</td><td>A11235</td> da <td>anexina</td><td></td></tr><tr><td>Jogo de ensaio ocidental</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>do</td>BCA</tr> do blotting do anticorpo de <tr><td>Calnexin</td><td>GeneTex</td><td>HL1598</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD63 Anticorpo</td><td>ABclonal</td><td>A19023</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Tampão da lise da pilha para ocidental e ocidental</td><td>de Beyotime</td><td>P0013</td><td>do IP Centrífuga de blotting</td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td>Centrífuga de células</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Cultura</td> de <td>células</td>Thermo <td></td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência de varredura a laser confocal</td><td>NIKON</td><td>A1 HD25</td><td>Foto a imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>DMEM básico (1x)</td><td>GIBCO</td><td>C11995500BT</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Espalhamento dinâmico de luz (DLS)</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN3600</td><td>Análise de diâmetro</td></tr><tr><td>Homogeneizador elétrico de vidro</td><td>SCIENTZ (Ningbo, China)</td> <td>DY89-II</td><td>Homogeneização de baixa velocidade</td></tr><tr>Sistema<td>FBS empobrecido com exossomos</td><td>Bioscience</td><td>EXO-FBS-50A-1</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Homogeneizador de alta velocidade</td><td>SCIENTZ (Ningbo, China)</td> <td>XHF-DY</td><td>Homogeneização de alta velocidade</td></tr><tr><td>Grelha magnética</td><td>Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China)</td><td>NA</td><td>Separação magnética</td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit para rotulagem geral de membranas celulares</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>O kit contém ligante de células PKH26 em etanol e</td></tr><tr><td>nanopartículas de óxido de ferro modificadas com polilisina C diluente C (IONPs)</td><td>Zhongke Leiming Technology (Pequim, China)</td><td>Mag1100-10</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Potássio cloreto</td><td>Aladdin</td><td>7447-40-7</td><td>Tratamento hipotônico celular</td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Beyotime</td><td>P1030</td><td>Inibidor de proteinase</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Aladdin</td><td>7447-40-7</td><td>Tratamento hipotônico celular</td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>Imagem de morfologia</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Centrífuga</td></tr> de <tr><td>exossomos ZetaView analisadores de rastreamento de nanopartículas</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX120</td><td>Análise de rastreamento de nanopartículas</td></tr></tbody></table>

um método de homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética para produção em larga escala de vesículas derivadas do endossomo

A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles

As vesículas extracelulares (EVs) têm atraído atenção significativa em pesquisas fisiológicas e patológicas, diagnóstico e tratamento de doenças; no entanto, sua tradução clínica tem sido limitada pela falta de abordagens de fabricação em escala. Portanto, este protocolo fornece um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para a produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) derivados dos endossomos, que têm rendimento cerca de 100 vezes maior do que o método convencional de ultracentrifugação. Neste método, nanopartículas magnéticas (MNPs) foram internalizadas pelas células parentais via endocitose e foram posteriormente acumuladas dentro de seus endossomos. Em seguida, endossomos carregados com MNPs foram coletados e purificados por tratamento hipotônico e separação magnética. Um homogeneizador de alta velocidade foi utilizado para quebrar endossomos carregados com MNP em nanovesículas monodispersas. As vesículas derivadas do endossomo resultantes apresentam a mesma origem biológica e estrutura, caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas, microscópio eletrônico de transmissão e western blotting. Sua morfologia e composição proteica são semelhantes às EVs nativas, indicando que as MEs podem potencialmente servir como substitutas de baixo custo e alto rendimento de EVs nativas para traduções clínicas.

O fluxo de trabalho da preparação de EM por homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética é mostrado na Figura 1. As células internalizam IONPs modificadas com polilisina a 10 nm, que são especificamente acumuladas nos endossomos via endocitose (Figura 3A). Após serem tratados com tampão hipotônico e homogeneizados, os endossomos carregados com IONP são liberados das células e posteriormente coletados por separação magnética. Os endossomos isolados são posteriormente reconstituídos em nanovesículas monodispersas, também conhecidas como MEs, por homogeneização em alta velocidade. Exploramos vários parâmetros-chave (por exemplo, velocidade e tempo de homogeneização) para identificar condições otimizadas de preparação de EM (Figura 2). Finalmente, uma velocidade de homogeneização de 140 x g por 5 min foi escolhida como condição otimizada considerando o tamanho de partícula e o rendimento dos MEs produzidos. IONPs livres e EMs carregados com IONP são eventualmente removidos da solução do produto final por uma segunda rodada de separação magnética para obter EMs livres de IONP. O método produz nanovesículas altamente uniformes e monodispersas a partir de endossomos de células parentais, compartilhando a mesma origem biológica que os EVs nativos.
Para comparar os EVs obtidos por ultracentrifugação com os MEs gerados por esse método, BMSC e 293T foram preparados para EVs e MEs. O diâmetro e a morfologia dos MEs foram analisados por NTA e MET. A morfologia das BMSC-MEs tem a característica de uma estrutura vesícula típica em forma de tigela e é delimitada por uma bicamada lipídica (Figura 3A). Conforme analisado por NTA, tanto BMSC-EMs quanto 293T-EMs têm diâmetro hidrodinâmico semelhante aos EVs nativos (BMSC-EVs e 293T-EVs) (Figura 3B). Os rendimentos de BMSC-MEs de homogeneização em alta velocidade foram de 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 ×106 células, e o rendimento de EVs nativos preparados por ultracentrifugação foi de apenas 7,2 × 10 7-1,12 × 10 8/1 × 106células. Da mesma forma, os rendimentos de 293T-EMs de homogeneização em alta velocidade foram de 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 células, o que atinge até aproximadamente 100 vezes mais do que os de 293T-EVs nativos preparados pelo método convencional de ultracentrífuga (≈5,5 × 10 6/1 × 10 6células) (Figura 4A).
Além disso, os resultados de western blotting mostraram que BMSC-MEs contêm os mesmos biomarcadores proteicos que EVs (CD63 e Anexina). Tanto os MEs quanto os EVs são negativos para a expressão de Calnexina, sugerindo que os MEs produzidos por este método quase não apresentaram contaminação da membrana plasmática (Figura 3C). Não há diferença significativa na concentração de proteínas entre EM e EV, BMSC-EMs e BMSC-EVs exibiram concentrações de proteínas totais semelhantes, 11,15 μg/1 × 10 9 partículas e 14,71 μg/1 × 109 partículas através do kit de ensaio de proteína BCA. Além disso, 293T-EMs e 293T-EVs exibiram concentrações de proteínas totais de aproximadamente 31,8 μg/1 × 10 9 partículas e 9,95 μg/1 × 109 partículas, respectivamente (Figura 4B). Esses resultados indicam que os MEs têm uma composição proteica semelhante aos EVs nativos. Para detectar se os MEs podem ser endocitosados, os MEs e EVs marcados com PKH26 foram co-incubados com BMSC e ID8 em uma concentração de 1 × 109 partículas/mL por 8 h, e as células foram observadas sob microscopia de fluorescência confocal para confirmar que os MEs poderiam ser prontamente absorvidos pelas células para ação, bem como EVs (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático do método de homogeneização de alta velocidade assistida por magnetismo. Passo 1: As células internalizam as IONPs nos endossomos através da endocitose. Passo 2: Coletar organelas, incluindo endossomos carregados com IONP, após tratamento hipotônico e homogeneização. Passo 3: Purificar endossomos carregados com IONP por separação magnética. Passo 4: Os endossomos são homogeneizados e reconstituídos em nanovesículas monodispersas. Passo 5: Remova IONPs livres e EMs carregados com IONP por separação magnética para coletar EMs livres de IONP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig02v2.jpg"> Figura 2: Otimização das condições de preparação de EM . (A) O diâmetro e o PDI das BMSC-MEs em resposta às mudanças na velocidade de homogeneização quando o tempo é fixado em 5 min foram analisados por DLS. (B) O diâmetro e o PDI das BMSC-MEs em resposta a mudanças no tempo de homogeneização quando a velocidade de homogeneização é fixada em 140 x g foram analisados por DLS. (C) O diâmetro e o PDI das BMSC-MEs em diferentes momentos de armazenamento foram analisados por DLS. (D) O diâmetro e a concentração de BMSC-MEs em resposta a mudanças na velocidade de homogeneização quando o tempo é fixado em 5 min foram analisados por NTA. (E) O diâmetro e a concentração das BMSC-MEs em resposta à mudança no tempo de homogeneização quando a velocidade de homogeneização é fixada em 140 x g foram analisados por NTA. (F) O diâmetro e o rendimento das BMSC-MEs em resposta à co-incubação de células BMSC com IONPs de diferentes concentrações foram analisados por NTA. p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização dos MEs . (A) Caracterização TEM da morfologia das células parentais com IONPs, endossomos e MEs endocitosados. As barras de escala representam 500 nm. (B) Os diâmetros hidrodinâmicos de BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM e 293T-EV são caracterizados por NTA. (C) Resultados da análise de Western blot de lisados celulares de BMSC-EMs, BMSC-EVs e BMSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig04.jpg"> Figura 4: O rendimento dos MEs é maior do que dos EVs. (A) O rendimento dos MEs e EVs preparados a partir de BMSC e 293T foi analisado por NTA. (B) Rendimento proteico de MEs e EVs preparados a partir de BMSC e 293T. **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66021/66021fig05.jpg"> Figura 5: Imagens representativas de microscopia fluorescente de EVs e MEs marcados com PKH26 internalizados por BMSC e ID8. As barras de escala representam 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66021/66021fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).

Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo

Extracellular vesicles (EVs) have attracted significant attention in physiological and pathological research, disease diagnosis, and treatment; however, ...

Neste estudo, tentamos abordar uma necessidade crítica não atendida na pesquisa de exossomos, que está desenvolvendo um método de produção em larga escala e reprodutível para miméticos exossomos. Devido à noção de evasões nativas, os miméticos exossomos, EMS, têm sido produzidos como substitutos por métodos como exclusão real e filtração baseada em ultracentrifugação. Certamente a maioria dos miméticos exossômicos são provenientes da exclusão direta de células inteiras, que demonstram funções biológicas mínimas, mas são inevitavelmente contaminadas por restos celulares e organelas.As vesículas extracelulares têm atraído atenção significativa na pesquisa biomédica, especialmente no tratamento de doenças. No entanto, as técnicas tradicionais de isolamento de EV, como filtração ultrassensível, exclusão interna, glifo catamental partem de baixa produtividade, baixa produtibilidade da qualidade do arado e exigem equipamentos de produção caros e intensivos que não podem atender à demanda clínica por EVs. Nosso estudo forneceu um método simples e sem custo para a produção de exossomos miméticos.Aproveitamos a descoberta biológica única de que as nanopartículas magnéticas só podem ser doadas dentro dos endossomos celulares, não de outras organelas. Assim, podemos formular os endossomos em nanosescose uniforme. Este método efetivamente melhorar EME e reduz o custo.

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Biologia

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para isolar exossomos de biofluidos alvo usando microesferas magnéticas. O procedimento permite a captura rápida de exossomos, que podem ser usados para análise a jusante.

Extração de exossomos baseada em esferas magnéticas: uma técnica para isolar exossomos específicos de biofluidos

Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.

Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a produzir vesículas derivadas do endossomo em larga escala usando homogeneização de alta velocidade assistida por separação magnética. Este método aumenta o rendimento e reduz custos para aplicações biomédicas.

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Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo

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