Name: Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 6 s
Description: Aprenda a criar um modelo de olho seco em ratos usando injeção subcutânea de escopolamina para suprimir a secreção da glândula lacrimal. Este método permite estudar diferentes graus de disfunção lacrimal.

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Este estudo foi apoiado pela Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) e Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).

Todos os experimentos com animais realizados seguindo este protocolo são realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Preparo dos animais
<ol><li>Preparar 12 ratas Wistar saudáveis com FPS de 6 semanas de idade, pesando 160 g ± 20 g.</li>
	<li>Use uma lâmpada de fenda e oftalmoscópio para examinar as condições oculares de todos os ratos, garantindo que não haja doenças do segmento anterior ou da retina.</li>
	<li>Crie todos os ratos por 1 semana com fontes suficientes de comida e água.</li>
	<li>Todos os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos normais, concentração da droga escopolamina 2,5 mg/mL, concentração da droga escopolamina 5 mg/mL e concentração da droga escopolamina 7,5 mg/mL, com três animais em cada grupo.</li>
</ol>2. Preparação da solução
<ol><li>Preparar o brometo de escopolamina dissolvendo em solução de cloreto de sódio a 0,9% para fazer uma solução com concentrações de 7,5 mg/mL, 5 mg/mL e 2,5 mg/mL.</li>
	<li>Preparar uma solução de cloreto de sódio a 0,9% sem brometo de escopolamina para ser utilizada como injeção para o grupo de controlo de ratos.</li>
</ol>3. Preparação de equipamentos e materiais
<ol><li>Prepare um microscópio de pequenos animais.</li>
	<li>Preparar materiais para o experimento, incluindo seringa descartável de 1 mL com agulha (26 G); fitas oftálmicas de fluoresceína sódica; Tira teste lacrimal de Schirmer; etanol absoluto; paraformaldeído a 4%; xileno; bálsamo neutro; hematoxilina, eosina; e kit de coloração com ácido periódico de Schiff.</li>
</ol>4. Injeção subcutânea
NOTA: Este procedimento requer assistência de uma segunda pessoa para ajudar a proteger os ratos.
<ol><li>Segure o corpo do rato firme e pegue e estique suas patas traseiras esquerdas (ou direitas). OBS: Um auxiliar pode ajudar na segurar o animal.</li>
	<li>Limpe o local de injeção com álcool.</li>
	<li>Inserir 1 mL de seringa descartável com agulha (26 G) na base da dobra cutânea entre o polegar e o dedo.</li>
	<li>Aspirar a seringa puxando para trás o êmbolo da seringa. Qualquer sangue na seringa indica colocação inadequada da agulha; Retire e reposicione a agulha.</li>
	<li>Administrar solução de cloreto de sódio a 0,9% com ou sem brometo de escopolamina num movimento constante e fluido.</li>
	<li>Injetar todos os ratos de acordo com diferentes concentrações, com 0,5 mL injetado cada vez e quatro vezes ao dia (às 9:00, 12:00, 15:00 e 18:00) por um período consecutivo de 19 dias, alternando entre os membros esquerdo e direito. Observação : os grupos são nomeados da seguinte maneira: Grupo sem brometo de escopolamina: 0 grupo (controle) Grupo com brometo de escopolamina 2,5 mg/mL: grupo 2,5 Grupo com brometo de escopolamina 5 mg/mL: grupo 5 Grupo com brometo de escopolamina 7,5 mg/mL: grupo 7,5</li>
	<li>Retornar o animal à sua gaiola e monitorar a respiração e o comportamento por 5-10 min.</li>
</ol>5. Teste de secreção lacrimal (teste lacrimal de Schirmer, STT)
<ol><li>Crie uma tira de papel de filtro modificada para ratos11. Corte metade da tira de papel de filtro usada para humanos ao longo da linha central (1 mm × 15 mm) e corte a cabeça da tira para torná-la lisa. NOTA: Antes de realizar o teste de secreção lacrimal, restrinja manualmente o corpo do rato para evitar o movimento e garantir a exposição dos olhos do rato.</li>
	<li>Coloque a tira de papel filtro no 1/3 externo do saco conjuntival da pálpebra inferior do rato.</li>
	<li>Cronometre o teste por 5 min. Controle o fechamento dos olhos do rato durante todo o procedimento.</li>
	<li>Após a medição, use uma pinça para prender a tira de papel de filtro em um tubo de microcentrífuga e registre o volume de rasgo fazendo uma marca na parede do tubo.</li>
	<li>Medir a secreção lacrimal no dia 0, dia 1, dia 3, dia 5, dia 7, dia 11, dia 15 e dia 19.</li>
</ol>6. Coloração de fluoresceína da córnea
<ol><li>Lançar 0,5 μL de solução de fluoresceína sódica a 0,5% no saco conjuntival inferior de cada rato.</li>
	<li>Observe a córnea sob luz azul por 3 min após a instilação de fluoresceína.</li>
	<li>Registre a coloração de fluorescência da córnea de cada rato e observe se há um defeito corneano.</li>
	<li>Realizar coloração de fluoresceína corneana no dia 0, dia 1, dia 3, dia 5, dia 7, dia 11, dia 15 e dia 19.</li>
</ol>7. Observação histológica do tecido conjuntival
<ol><li>Após completar o desenvolvimento do modelo, anestesiar profundamente os ratos com uma injeção intraperitoneal de 0,4 mL/100 g de hidrato aquoso de cloral a 10% para aliviar a tensão dos animais. Em seguida, eutanasiar os ratos por deslocamento cervical.</li>
	<li>Tomar a conjuntiva bulbar das mesmas regiões de cada rato, com um tamanho de aproximadamente 2 mm x 2 mm.</li>
	<li>Fixar os tecidos imediatamente em paraformaldeído a 4% por 24 h e embutir em parafina13.</li>
	<li>Cortar cortes de 5 μm de espessura e corar com hematoxilina e eosina (HE)14 e ácido periódico de Schiff (PAS) (seguir as instruções do fabricante).</li>
</ol>8. Observação histológica do tecido da córnea e glândula lacrimal
<ol><li>Após completar o desenvolvimento do modelo, eutanasiar o rato conforme descrito na etapa 7.1.</li>
	<li>Pegue a córnea do lado direito de cada rato e fixe-a imediatamente em solução de paraformaldeído a 4%.</li>
	<li>Cortar a epiderme cefálica e o tecido subcutâneo ao longo da linha que liga a orelha e o canto externo do olho, expandir a incisão para ambos os lados e isolar ainda mais a glândula orbital extra amarelada.</li>
	<li>Remova completamente o pelo do rato e separe a glândula extraorbital com solução de cloreto de sódio a 0,9%.</li>
	<li>Colocar as glândulas extraorbitais isoladas em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h e embutir em parafina.</li>
	<li>Cortar cortes contínuos de ~5 μm de espessura e corá-los com HE para espécimes de tecido da córnea e da glândula extraorbital.</li>
</ol>9. Análise estatística
<ol><li>Utilizar software apropriado para análise estatística dos dados.<ol><li>Realizar análise de variância (ANOVA) one-way para análise dos dados e o teste de diferença mínima significativa (LSD) para comparação entre os grupos. Estabeleceu-se o nível de significância estatística em α = 0,05, com P < 0,05 indicando significância estatística. OBS: O software SPSS 20 foi utilizado para análise estatística dos dados experimentais.</li>
	</ol></li>
</ol>

Disfunção da glândula lacrimal induzida por escopolamina em ratos

<ol><li>Papas, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+prevalence+of+dry+eye+disease%3A+A+Bayesian+view%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Physiol+Opt%22%5BJournal%5D)">The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).</li>
<li>Sy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+opinion+in+the+management+of+aqueous+deficient+dry+eye+disease+%28DED%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED).</a> BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).</li>
<li>Seo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1alpha+%28hypoxia+inducible+factor-1alpha%29+prevents+dry+eye-induced+acinar+cell+death+in+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland.</a> Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).</li>
<li>Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models%2C+induction+protocols%2C+and+measured+parameters+in+dry+eye+disease%3A+Focusing+on+practical+implications+for+experimental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research.</a> Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).</li>
<li>Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+influence+on+the+secretory+immune+system+of+the+eye%3A+androgen+regulation+of+secretory+component+levels+in+rat+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears.</a> J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).</li>
<li>Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+tear+volume+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of tear volume in the rat.</a> Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).</li>
<li>Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+production+after+unilateral+removal+of+the+main+lacrimal+gland+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys.</a> Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).</li>
<li>Barabino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+controlled-environment+chamber%3A+a+new+mouse+model+of+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).</li>
<li>Viau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+ocular+surface+and+lacrimal+gland+changes+in+a+new+scopolamine-induced+dry+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).</li>
<li>Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ocular+surface+changes+in+a+rabbit+dry+eye+model+using+a+modified+impression+cytology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique.</a> Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).</li>
<li>Daull, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+new+topical+cationic+emulsion+of+cyclosporine+A+on+dry+eye+clinical+signs+in+an+experimental+mouse+model+of+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye.</a> Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).</li>
<li>Dursun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of keratoconjunctivitis sicca.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dry+eye+mouse+model+produced+by+exorbital+and+intraorbital+lacrimal+gland+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision.</a> Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).</li>
<li>Ramos, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonproliferative+and+Proliferative+Lesions+of+the+Rat+and+Mouse+Special+Sense+Organs%28Ocular+%5Beye+and+glands%5D%2C+Olfactory+and+Otic%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic).</a> J Toxicol Pathol. 31, (2018).</li>
<li>Stapleton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFOS+DEWS+II+Epidemiology+report%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">TFOS DEWS II Epidemiology report.</a> Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).</li>
<li>Foulks, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+guidelines+for+management+of+dry+eye+associated+with+Sjogren+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease.</a> Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).</li>
<li>Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+dry+eye+disease%3A+Useful%2C+varied+and+evolving+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review).</a> Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).</li>
<li>Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sjogren%27s+syndrome%3A+immunological+response+underlying+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%22%5BJournal%5D)">Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride).</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li>
</ol>

Os autores não apresentam potenciais conflitos de interesse relacionados aos fármacos e materiais utilizados neste procedimento.

O olho seco aquoso-deficiente (EDDA) é um importante tipo de olho seco, correspondendo a cerca de 1/3 da população total de olhoseco17, e a principal causa de EDDA é o dano patológico e a inflamação da glândula lacrimal13. Para esse tipo de olho seco, os métodos de tratamento clínico mais comuns são as lágrimas artificiais para aliviar os sintomas ou a aplicação tópica de esteroides ou ciclosporina18, enquanto há poucas opções de tratamento para danos à glândula lacrimal. Portanto, é muito importante explorar o impacto da reconstrução da função da glândula lacrimal no olho seco e estabelecer um modelo animal de disfunção da glândula lacrimal. Utilizamos um método de aplicação repetida de medicação para suprimir a secreção da glândula lacrimal em ratos e criamos um modelo animal de disfunção lacrimal crônica de disfunção da glândula lacrim.
Escolhemos ratos para construir esse modelo de olho seco, que apresenta mais vantagens em relação a outros modelos animais19. Por exemplo, coelhos têm um tamanho corporal maior e requerem mais doses de medicação ou injeções mais frequentes para alcançar o efeito desejado. Além disso, os coelhos são um pouco mais caros, o que significa mais custos para o experimento. Camundongos também são comumente usados em pesquisas oftalmológicas, mas geralmente são usados para construir modelos de síndrome de Sjögren20. Esses modelos se concentram em comparar inflamação de órgãos e infiltração de linfócitos para explorar os mecanismos imunopatológicos. Os camundongos têm tamanhos corporais pequenos, anatomia complexa da glândula lacrimal e baixa secreção lacrimal, tornando difícil refletir com precisão a produção lacrimal. O modelo animal de rato é um modelo de olho seco mais adequado, pois permite injeções convenientes de drogas, tem condições de alimentação relativamente simples, é adequado para estudos clínicos e experimentais e também apresenta vantagens em termos de custo. É um bom modelo animal para ADDE.
Aplicamos o bloqueador do receptor colinérgico escopolamina para inibir os receptores colinérgicos no organismo do rato, reduzindo a secreção da glândula lacrimal e alterando a estrutura patológica das células da glândula lacrimal, o que fundamentalmente simula o estado das glândulas lacrimais em pacientes com olho seco. Comparada a outros métodos, esta abordagem simula melhor a condição lesada das glândulas lacrimais em estado natural. Outros métodos, como o uso do colírio de cloreto de benzalcônio21 ou a alteração de condições externas, como a redução da umidade e o aumento da evaporação da superfície ocular 4,8, apenas perturbam o ambiente da superfície ocular e não alteram o estado funcional da glândula lacrimal. Portanto, eles não são adequados para condições de olho seco crônico de longo prazo.
Na medição do volume de secreção das lágrimas em ratos, melhoramos as tiras de teste lacrimal de Schirmer. Primeiro, cortamos a tira de teste lacrimal usada por humanos ao longo da linha central. Em seguida, cortamos a parte superior em forma de arco redondo e a dobramos suavemente de volta na parte superior para facilitar a inserção no saco conjuntival inferior do rato. Deve-se notar que os ratos são ativos e difíceis de medir as lágrimas por 5 min. Após a inserção da tira de teste lacrimal de Schirmer no saco conjuntival inferior do rato, fechamos manualmente os olhos do rato para aumentar seu conforto e evitar dificuldades durante a longa mensuração das lágrimas, o que pode afetar os resultados da medida.
Ao extrair a glândula lacrimal, é necessário primeiro localizá-la. O ponto de localização da glândula lacrimal é o ponto médio entre a frente da orelha e o canto interno. Em seguida, corte o tecido cutâneo sob a pelagem, minimizando a entrada de pelos fragmentados e reduzindo o processo de manuseio na etapa posterior. Durante o processo de extração, também é importante limpar a pele fragmentada em tempo hábil. Especialmente ao separar a glândula lacrimal, use solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou soro fisiológico para enxaguar repetidamente e evitar a mistura com outros tecidos que possam afetar os resultados da secção.
A vantagem do modelo animal de olho seco desenvolvido é que o protocolo correlacionou diferentes concentrações do fármaco com diferentes graus de lesão da glândula lacrimal. Isso fornece uma base experimental para o estudo do tratamento da disfunção da glândula lacrimal. Refinamos algumas das etapas operacionais no processo de modelagem para fornecer materiais de referência mais detalhados para um pesquisador. Além disso, adicionamos indicadores de análise para o modelo animal de olho seco, incorporando indicadores morfológicos da córnea, conjuntiva e glândula lacrimal, contando células conjuntivais e pontuando o grau de lesão da glândula lacrimal. Avaliamos a função da glândula lacrimal a partir de inflamação, edema e atrofia. Escolhemos os métodos de análise mais abrangentes, econômicos e precisos para refletir o grau de disfunção do olho seco e da glândula lacrimal.
No entanto, nosso método também tem algumas limitações. Devido ao longo processo de construção de modelos animais, os experimentadores precisam injetar repetidamente. Embora existam atualmente alguns métodos para substituir as injeções manuais, como bombas de medicamentos ou adesivos transdérmicos, ainda existem algumas complicações no seu uso. Como aplicar melhores métodos para reduzir a frequência da medicação, evitar a ocorrência de complicações e garantir a precisão da dosagem é o nosso próximo objetivo. Em conclusão, melhoramos um modelo animal de olho seco causado pela injeção de escopolamina, fornecendo uma base experimental para pesquisas sobre disfunção da glândula lacrimal em ADDE.

Em 2021, aproximadamente 12% das pessoas são significativamente afetadas pelo olho seco1, tornando-se uma das doenças oculares crônicas mais comuns. O olho seco pode ser dividido em dois tipos: olho seco aquoso-deficiente (ADDE) e olho seco evaporativo (EDE)2, dependendo dos diferentes fatores que afetam a doença. O ADDE é subdividido em síndrome de Sjögren (SS) e não-SS, mas a maioria dos pacientes com olho seco são pacientes não SS na clínica3. Os sintomas crônicos de olho seco afetam seriamente a qualidade visual dos pacientes. Atualmente, o tratamento convencional da DED envolve a aplicação de lágrimas artificiais para lubrificar a superfície ocular e fisioterapia das pálpebras. No entanto, a síndrome do olho seco pode não oferecer uma cura completa em muitos casos. Portanto, estudar a patogênese da doença do olho seco é crucial para o desenvolvimento de novas terapias e drogas. Modelos animais da síndrome do olho seco fornecem uma base para pesquisas futuras.
Existem muitas maneiras de construir modelos animais da síndrome do olho seco4, incluindo a alteração dos níveis de secreção lacrimal alterando os níveis hormonais. Por exemplo, a remoção dos testículos de ratos pode reduzir a secreção androgênica, aumentar a secreção lacrimal e diminuir a concentração de componente secretor livre (CS) e IgA nas lágrimas 5,6. Outro método é indicar reações autoimunes na glândula lacrimal, removendo os nervos da superfície ocular que controlam a glândula. Além disso, a redução direta da secreção lacrimal pode ser obtida com a remoção cirúrgica da glândula lacrimal7. A mudança das condições ambientais também pode acelerar a evaporação da lágrima. Por exemplo, a cultura de animais em condições de baixa umidade e ventilação seca pode estabelecer um modelo de olho seco evaporativo excessivo8, que pode ser combinado com outros métodos para aumentar a severidade do olho seco. Os principais fármacos utilizados para induzir modelos experimentais de olho seco são a atropina e aescopolamina9. Como inibidores parassimpáticos, ambos podem induzir bloqueio farmacológico dos receptores colinérgicos (muscarínicos) na glândula lacrimal e inibir a secreção lacrimal. Em comparação com os olhos secos causados pela injeção do músculo atropina10, a escopolamina tem um efeito inibitório mais forte sobre as glândulas de secreção, uma duração mais longa da ação da droga e efeitos mais fracos sobre os músculos cardíacos, intestino delgado e lisos brônquicos. É uma das drogas mais maduras para modelos animais de olho seco.
Diferentes métodos podem ser utilizados para induzir o olho seco com escopolamina, como injeção subcutânea, bomba de fármaco ou aplicação de adesivos 4,11,12. A fim de reduzir a frequência de administração de drogas a animais experimentais, muitos pesquisadores aplicam adesivos transdérmicos na cauda de camundongos ou usam bombas de drogas. No entanto, ambos os métodos têm limitações. Por exemplo, a absorção de adesivos transdérmicos precisa levar em conta a absorção individual de camundongos, o que pode levar a uma dosagem inconsistente da droga. Embora as bombas de fármacos possam controlar com precisão a dosagem de cada administração, nem sempre são compatíveis com o fármaco que está sendo administrado ou com a concentração que está sendo utilizada. Eles também precisam ser colocados cirurgicamente – o que é mais invasivo para o animal, exigindo um evento anestésico, e há potencial para complicações pós-cirúrgicas, como deiscências. A injeção subcutânea, embora mais pesada, pode garantir a dosagem precisa para cada administração e manter a consistência na administração do medicamento entre diferentes ratos. Ao mesmo tempo, tem um custo mais baixo e é adequado para a realização de um grande número de experimentos com animais.
Este estudo aplica repetidas injeções subcutâneas de escopolamina para estabelecer um modelo de olho seco em ratos. Analisamos indicadores de olho seco como defeitos corneanos, níveis de secreção lacrimal e morfologia patológica da córnea, conjuntiva e glândula lacrimal. Ao combinar concentração de drogas, manifestações patológicas e sintomas de olho seco, elaboramos o modelo de rato de olho seco em detalhes, fornecendo dados experimentais mais precisos para o estudo do tratamento do olho seco e mecanismos patológicos. Também descrevemos o processo de modelagem em detalhes para futuros pesquisadores.

<table><tbody><tr><td>Solução de cloreto de sódio a 0,9%</td><td>SJZ No.4 Pharmaceutical</td><td>H13023201</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeído</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd</td><td>G1113</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10009218</tr><tr><td>Tiras oftálmicas de sódio fluoresceína</td><td>Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd</td><td>YN-YG-I</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina e eosina</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>D006</td><td></td></tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>Pequim Solarbio Science & Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>G8590</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Pequim Solarbio Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd.</td><td>YA0012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de ácido periódico-Schiff</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0142S</td> Schirmer tiras <td></td></tr><tr><td>de teste de rasgo</td><td>Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd</td><td>YN-LZ-I</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromide de escopolamina</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>S860151</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de pequenos animais</td><td>Head Biotechnology Co,. Ltd</td><td>ZM191</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10023418</tr></tbody></table>

modelo de olho seco de rato com disfunção da glândula lacrimal induzida por escopolamina

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

O olho seco aquoso-deficiente (ADDE) é um tipo de doença do olho seco que pode resultar na redução da quantidade e qualidade da secreção lacrimal. A produção anormal prolongada de lágrimas pode levar a um distúrbio no ambiente da superfície ocular, incluindo danos na córnea e inflamação. Em casos graves, o ADDE pode causar perda de visão ou até cegueira. Atualmente, o tratamento do olho seco é limitado a colírios ou fisioterapia, que só podem aliviar os sintomas de desconforto ocular e não podem fundamentalmente curar a síndrome do olho seco. Para restaurar a função da glândula lacrimal no olho seco, criamos um modelo animal de disfunção da glândula lacrimal em ratos induzida por escopolamina. Através da avaliação abrangente da glândula lacrimal, córneas, conjuntivas e outros fatores, pretendemos fornecer uma compreensão completa das alterações patológicas do ADDE. Comparado com o modelo atual de olho seco em camundongos, este modelo animal de ADDE inclui uma avaliação funcional da glândula lacrimal, fornecendo uma melhor plataforma para estudar a disfunção da glândula lacrimal no ADDE.

Teste Schirmer I, SIT I O volume lacrimal dos ratos foi medido nos dias 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 após o início do experimento. Os resultados experimentais mostraram que a secreção lacrimal do grupo escopolamina (grupo 2,5, grupo 5, grupo 7,5), em comparação com o grupo controle (grupo 0), estava significativamente diminuída, e a diferença foi estatisticamente significativa (P &lt; 0,01). Não houve significância estatística entre os grupos 2,5, 5 e 7,5 (P &gt; 0,05). Não houve diferença significativa entre os diferentes grupos quanto ao número de dias (P &gt; 0,05) (Figura 1, Tabela 1).
Coloração de fluoresceína da córnea A coloração de fluoresceína corneana foi realizada nos dias 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 do experimento. Os resultados mostraram que não houve coloração de fluoresceína corneana em nenhum grupo, indicando que não foram formados defeitos epiteliais corneanos evidentes durante o experimento de 20 dias com diferentes concentrações de escopolaminas (Figura 2).
Análise patológica do epitélio corneano Após o experimento, os tecidos corneanos de cada rato foram coletados para coloração HE para observar a morfologia do epitélio corneano e medir a espessura da camada epitelial corneana. O epitélio corneano do grupo controle era composto por 4-6 camadas de células epiteliais ordenadamente arranjadas, dentre as quais a camada basal consistia de uma única camada de células epiteliais colunares dispostas ordenada e próximamente. O epitélio corneano dos grupos escopolamina 2,5, 5 e 7 foi significativamente mais fino que o grupo controle, com morfologia celular achatada e atrófica e estrutura celular desordenada. No grupo 7.5, havia frouxa conexão intercelular e estrutura vacuolar na camada basal (indicada pela seta vermelha na Figura 3). Comparado com o epitélio corneano dos grupos escopolamina, o epitélio corneano do grupo controle normal apresentou diferença estatística na espessura da camada epitelial corneana (Figura 4).
Análise patológica da glândula lacrimal A principal glândula para secreção lacrimal em ratos é a glândula lacrimal extrorbital15. Ao observar os cortes das glândulas lacrimais, foram observadas alterações na morfologia das células epiteliais da glândula lacrimal com o aumento da concentração de escopolamina, acompanhado de inflamação e edema tecidual. No grupo controle não foram observadas tais alterações. Os resultados anatomopatológicos sugerem que alterações inflamatórias da glândula lacrimal, edema celular e atrofia das células epiteliais glandulares podem ser utilizados como indicadores de dano funcional da glândula lacrimal16 (Tabela 2). Esses indicadores podem ser utilizados para medir a gravidade do olho seco em relação à quantidade de secreção lacrimal (Figura 5).
Análise dos resultados da coloração conjuntival A estrutura da conjuntiva no grupo controle é completa, composta principalmente pela camada superficial e pela lâmina própria. A camada superficial é de células epiteliais colunares laminadas, lisas e completas, com microvilosidades na superfície celular. Células caliciformes dispersas estavam presentes entre as células epiteliais, com grande volume celular e grânulos mucosos no citoplasma celular. A camada superficial do epitélio conjuntival nos três grupos de drogas escopolaminas era significativamente mais fina, o número de microvilosidades e células caliciformes estava reduzido, a estrutura do arranjo celular era incompleta, acompanhada de edema, e uma pequena quantidade de células inflamatórias, como observado na coloração HE (Figura 6).
Pela coloração da conjuntiva com PAS, calculou-se o número médio de células caliciformes por campo microscópico de 40x em três amostras independentes de cada camundongo, expresso como média ± DP (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig01.jpg"> Figura 1: Estatística do valor do teste de Schirmer em cada grupo (mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig02.jpg"> Figura 2: Coloração fluoresceína sódica da córnea de ratos. No experimento de 20 dias com fluoresceína sódica, não foram observados achados positivos nas córneas de todos os ratos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig03.jpg"> Figura 3: Coloração do epitélio corneano e medida da espessura. No grupo 7.5, havia conexão intercelular frouxa e estrutura vacuolar na camada basal (indicada pela seta vermelha) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig04.jpg"> Figura 4: Estatísticas da espessura do epitélio corneano em cada grupo. Comparado com o epitélio corneano dos grupos escopolamina, o epitélio corneano do grupo controle normal apresentou diferenças estatísticas na espessura da camada epitelial corneana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig05.jpg"> Figura 5: Resultados da coloração HE da glândula lacrimal extrorbital de ratos. (A) Grupo 0: No campo visual, as glândulas lacrimais apresentavam estrutura lobular e eram compostas por ductos e glândulas tubulares, sem anormalidades evidentes na morfologia dos ductos, enquanto as glândulas tubulares eram compostas por células glandulares em forma de cone com abundantes substâncias mucosas no citoplasma, sem edema óbvio nos tecidos conjuntivos, sem anormalidades óbvias nos vasos sanguíneos intersticiais e sem necrose óbvia e infiltrado de células inflamatórias. (B) Grupo 2.5: No campo visual, observa-se atrofia ocasional das células epiteliais da glândula lacrimal, com volume reduzido, cavidades glandulares dilatadas de forma irregular e substância mucinosa reduzida no interior da cavidade (indicada pela seta vermelha). Há também infiltração ocasional de linfócitos livres no estroma (indicada pela seta azul), mas não são observadas anormalidades óbvias na morfologia do ducto ou sinais de edema. (C) Grupo 5: No campo visual, as células epiteliais lacrimais foram ocasionalmente atrofiadas e reduzidas de tamanho, a cavidade glandular estava aumentada, a substância mucosa na cavidade estava reduzida (seta vermelha) e ocasionalmente observava-se infiltração livre de linfócitos no estroma (seta azul), não sendo observadas anormalidades óbvias na morfologia ductal ou edema do tecido conjuntivo entre os lóbulos das glândulas lacrimais. (D) Grupo 7.5: Edema pode ser visto no campo visual; o espaçamento entre as glândulas lacrimais é alargado, e o arranjo é irregular (seta verde), as células epiteliais das glândulas lacrimais são frequentemente atrofiadas, o volume torna-se menor, e a forma é irregular (seta amarela), ocasionalmente a cavidade glandular é aumentada, a matéria mucosa na cavidade é reduzida (seta vermelha), ocasionalmente o linfócito livre é infiltrado (seta azul), sem anormalidades aparentes na morfologia ductal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig06.jpg"> Figura 6: Coloração HE da conjuntiva de ratos. Comparados ao epitélio conjuntival do grupo controle, todos os três grupos de epitélio conjuntival medicado com escopolamina apresentaram graus variados de dano estrutural. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66036/66036fig07.jpg"> Figura 7: Coloração PAS da conjuntiva. (A) Ratos controles normais. (B) ratos do grupo escopolamina. (C) Densidade de células caliciformes em cada grupo (20x). Barra preta = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66036/66036fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="7">Teste de Schirmer I, SIT(Valor médio, unidade [mm])</td>
		</tr><tr><td>Grupo</td>
			<td>0 dias</td>
			<td>3 dias</td>
			<td>5 dias</td>
			<td>7 dias</td>
			<td>11 dias</td>
			<td>15 dias</td>
			<td>19 dias</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>6</td>
			<td>4.2</td>
			<td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>7</td>
			<td>5.5</td>
			<td>6.3</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2.7</td>
			<td>2</td>
			<td>2.7</td>
			<td>3.3</td>
			<td>3.7</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>2.7</td>
			<td>1.7</td>
			<td>2.3</td>
			<td>3.2</td>
			<td>3.7</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>7.5</td>
			<td>2.3</td>
			<td>3.2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.8</td>
			<td>2.7</td>
			<td>3.2</td>
			<td>2.8</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Teste de Schirmer dos ratos dos quatro grupos em diferentes momentos (mm). Após a aplicação da medicação, a secreção de lágrimas em ratos diminuiu significativamente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Número</td>
			<td>Necrose</td>
			<td>Inflamação</td>
			<td>Edema</td>
			<td>Atrofia epitelial</td>
		</tr><tr><td>0 Grp-1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>0 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>0 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 Grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>2.5 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 Grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -2</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7.5 Grp -3</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Escore tecidual patológico da glândula lacrimal de ratos. Critérios de pontuação: 0: Em condições normais, considerando fatores como idade, sexo e cepa do animal, o tecido é considerado normal;
1: As alterações observadas ultrapassaram a faixa normal; 2: Lesões podem ser observadas, mas ainda não são graves; 3: As lesões são evidentes e continuam a piorar; 4: As lesões são extremamente graves e acometem todo o tecido16.

Aqui, estabelecemos um modelo de disfunção da glândula lacrimal em ratos para fornecer uma base para o estudo do olho seco aquoso-deficiente.

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

O processo de desenvolvimento de um modelo animal de olho seco é longo. Requer injeção subcutânea contínua de escopolamina nas patas traseiras do arroz para suprimir a secreção da glândula lacrimal no arroz. Assim, os experimentadores precisam ter paciência suficiente para administrar a medicação regularmente por um longo período de tempo.Nosso protocolo é um método muito útil que pode criar diferentes graus de modelos de olho seco com base em diferentes concentrações de drogas. Isso pode tornar mais fácil para os futuros pesquisadores estudar o tratamento da doença do olho seco. Nossa equipe continuará a explorar o campo da regeneração da glândula lacrimal, muito animada para trabalhar na reconstrução 3D e na realização de experimentos de transplante.Nosso objetivo final é desenvolver opções de tratamento mais avançadas e eficientes para indivíduos que sofrem da síndrome do olho seco.

a-rat-dry-eye-model-with-lacrimal-gland-dysfunction-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Uma técnica para induzir olho seco autoimune experimental crônico em ratos

Sem usar anestesia, injete subcutaneamente a emulsão na base das caudas dos ratos. Então, no dia 14, de maneira semelhante, injete 200 microlitros do mesmo antígeno e adjuvante de Freund incompleto. No mesmo dia, injetar intraperitonealmente 300 nanogramas de toxina pertussis em 100 microlitros de PBS.

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Coloração com fluoresceína em um modelo de rato de olho seco autoimune para examinar danos na córnea

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Aprenda a criar um modelo de olho seco em ratos usando injeção subcutânea de escopolamina para suprimir a secreção da glândula lacrimal. Este método permite estudar diferentes graus de disfunção lacrimal.

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

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