Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

Nossa pesquisa se concentra na morte celular do programa de mamíferos, estudando especificamente o equilíbrio entre apoptose e necroptose no contexto da hiperglicemia. Mais recentemente, a proteína de morte celular RIP1 quinase demonstrou modular a expressão gênica durante a necroptose. Nosso desafio experimental atual é manipular geneticamente as células imunes que crescem em suspensão, particularmente nocauteando o gene da quinase RIP1 usando CRISPR-Cas9.

Nosso protocolo oferece duas vantagens distintas. Melhora os métodos de transfecção para células imunes que crescem em suspensão usando lentivírus e elimina a necessidade de clonagem de célula única durante o processo de criação de um nocaute genético usando CRISPR-Cas9, Nossos resultados abriram caminho para estudar o papel da RIP1 quinase na mudança hiperglicêmica na necroptose. Para iniciar a sequência do quadrante, Escherichia coli abrigando o RNA guia do vetor lentiviral em placas de ágar Luria-Bertani ou LB suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Incube as placas a 37 graus Celsius por um a dois dias até que as colônias individuais sejam visíveis na área mais diluída da placa. Após a incubação, usando uma alça estéril, selecione uma única colônia e adicione-a a cinco mililitros de caldo LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em um tubo cônico de 50 mililitros. Ventile e prenda a tampa do tubo.

Incube o tubo em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 225 RPM por oito horas. Enquanto isso, adicione 40 mililitros de caldo LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em quatro tubos de 50 mililitros. Após a incubação, transfira 40 microlitros da cultura cultivada para cada um dos quatro tubos.

Ventile e prenda as tampas dos tubos antes de incubá-los em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 225 RPM por 12 a 16 horas. No dia seguinte, centrifugue as culturas a 3.220 x g em um rotor de balde oscilante por 20 minutos. Transvase os sobrenadantes em um copo de resíduos e combine todos os quatro pellets em 10 mililitros de caldo LB, suplementado com ampicilina.

Centrifugar os pellets combinados à velocidade máxima num rotor de balde oscilante durante 20 minutos para obter um único pellet e deitar fora o máximo possível de sobrenadantes no copo de resíduos. Semeie HEK293T células a uma concentração de três a cinco vezes 10 elevado a seis células em um frasco T25 contendo DMEM. Incubar o frasco durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção usando uma proporção de 1:1:1:1 de plasmídeos e uma proporção de 3:1 de reagente de transfecção para DNA de plasmídeo com meio de soro reduzido. Misture 75 microlitros de reagente de transfecção, 2.500 microlitros de meio de soro reduzido e 25 microgramas de DNA de plasmídeo total. Deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos.

Em seguida, pipete cuidadosamente a mistura de transfecção nas células HEK293T confluentes no frasco contendo o meio. Agitar suavemente o balão para assegurar uma homogeneização adequada da mistura e incubá-lo a 37 graus Celsius durante 48 horas. Após dois dias de incubação, transferir o meio do produtor HEK293T frasco de células para um tubo cónico de 15 ml.

Centrifugar o tubo a 800 x g durante cinco minutos para pulverizar as células HEK293T restantes. Remover cuidadosamente todo o vírus que contém sobrenadante sem perturbar o sedimento e transferi-lo para um novo tubo cónico de 15 ml. Conte e calcule o volume necessário da suspensão de células U937 para obter um projétil de 2 x 10 elevado a seis células.

Em seguida, centrifugar a suspensão celular num tubo de 15 mililitros a 400 x g durante 10 minutos e decantar o sobrenadante, deixando o sedimento de célula no tubo. Ressuspender o sedimento celular no vírus contendo sobrenadante e centrifugar o tubo a 290 x g durante 60 minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta para ressuspender o pellet com o vírus contendo sobrenadante no tubo.

Coloque o tubo em um rotador de ponta a ponta por 60 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo a 400 x g por 10 minutos e ressuspenda o pellet na proporção de 1:1 do vírus contendo sobrenadantes e meio RPMI 1640 completo, suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor. Transfira a mistura de células para um novo frasco de cultura de tecidos T25 e incubada a 37 graus Celsius por 48 horas.

Após a incubação, centrifugue as células U937 a 400 x g durante 10 minutos e retire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com meio RPMI 1640 completo, suplementado com FBS inativado por calor a 10% e cinco microgramas por mililitro de puromicina. Transferir a cultura de células para um balão T25.

Incube as células a 37 graus Celsius por duas a três semanas, verificando as células a cada um ou dois dias em busca de sinais de crescimento. A análise de Western blot confirmou a perda da expressão da proteína RIP1 em células mutantes RIP1 CRISPR sem sinal detectável em comparação com o sinal forte em células de controle do tipo selvagem e não-alvo. O tratamento com TCZ induziu morte celular necroptótica significativa em células controle selvagens e não-alvo, que foi revertida pelo tratamento com necrostatina-1s.

Em contraste, as células nocaute RIP1 CRISPR mostraram morte celular significativamente menor em comparação com as células de controle do tipo selvagem e não-alvo sem efeito da necrostatina-1s, indicando uma perda da função RIP1. A microscopia de fluorescência de células vivas mostrou um aumento significativo na produção de superóxido mitocondrial em células de controle selvagens e não-alvo após o tratamento com TCZ, que foi reduzido após o tratamento com necrostatina-1. As células nocaute RIP1 CRISPR exibiram produção mínima de superóxido mitocondrial sem efeito observável do tratamento com necrostatina-1s.