Name: Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a gerar uma linhagem celular U937 knockout para RIP1 usando CRISPR-Cas9. Este método demonstra a eficácia da edição genética e destaca desafios experimentais na pesquisa com células humanas.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Meio DMEM ajustado</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimida Hoechst 33342 tricloridrato</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio Completo</td><td>Sigma</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de E.coli gRNA CRISPR NTC</td><td>transOMIC</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de E.coli de gRNA CRISPR RIP1</td><td>transOMIC</td><td>TEVH-1162203</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de ponta a ponta</td><td>Thermo Científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência EVOS FL</td><td>Tecnologias da Vida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep de plasmídeo GenElute</td><td>Sigma</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-coelho de cabra, conjugado HRP (H + L)</td><td>Sigma</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Células</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>Científico de New Brunswick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar LB</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de embalagens lentivirais LV-MAX</td><td>Gibco</td><td>Resposta A43237</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Vermelho</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>Thermo Científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Necrostatina-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622A</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>Pág. 7255</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-humano RIP1 mAb</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE e equipamento de western blot</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937 Monócitos Humanos</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de proliferação celular WST-1</td><td>Takara</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de DNA X-tremeGENE 9</td><td>Roche Diagnósticos</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>A1902</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de uma linha celular rip1 knockout u937 usando o sistema crispr-cas9

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

Após a produção de uma população confluente de células U937 mutantes RIP1 CRISPR, foram realizadas análises de SDS-PAGE e Western blot. A análise de Western blot foi usada para determinar a criação bem-sucedida de uma linhagem celular mutante RIP1 CRISPR, avaliando a perda dos níveis de expressão da proteína RIP1. Essa determinação foi feita com base no resultado comparativo dos monócitos WT U937 e células NTC. Na Figura 2, a expressão de RIP1 não foi detectada para as célu...

Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

Nossa pesquisa se concentra na morte celular do programa de mamíferos, estudando especificamente o equilíbrio entre apoptose e necroptose no contexto da hiperglicemia. Mais recentemente, a proteína de morte celular RIP1 quinase demonstrou modular a expressão gênica durante a necroptose. Nosso desafio experimental atual é manipular geneticamente as células imunes que crescem em suspensão, particularmente nocauteando o gene da quinase RIP1 usando CRISPR-Cas9.Nosso protocolo oferece duas vantagens distintas. Melhora os métodos de transfecção para células imunes que crescem em suspensão usando lentivírus e elimina a necessidade de clonagem de célula única durante o processo de criação de um nocaute genético usando CRISPR-Cas9, Nossos resultados abriram caminho para estudar o papel da RIP1 quinase na mudança hiperglicêmica na necroptose. Para iniciar a sequência do quadrante, Escherichia coli abrigando o RNA guia do vetor lentiviral em placas de ágar Luria-Bertani ou LB suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Incube as placas a 37 graus Celsius por um a dois dias até que as colônias individuais sejam visíveis na área mais diluída da placa. Após a incubação, usando uma alça estéril, selecione uma única colônia e adicione-a a cinco mililitros de caldo LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em um tubo cônico de 50 mililitros. Ventile e prenda a tampa do tubo.Incube o tubo em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 225 RPM por oito horas. Enquanto isso, adicione 40 mililitros de caldo LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina em quatro tubos de 50 mililitros. Após a incubação, transfira 40 microlitros da cultura cultivada para cada um dos quatro tubos.Ventile e prenda as tampas dos tubos antes de incubá-los em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 225 RPM por 12 a 16 horas. No dia seguinte, centrifugue as culturas a 3.220 x g em um rotor de balde oscilante por 20 minutos. Transvase os sobrenadantes em um copo de resíduos e combine todos os quatro pellets em 10 mililitros de caldo LB, suplementado com ampicilina.Centrifugar os pellets combinados à velocidade máxima num rotor de balde oscilante durante 20 minutos para obter um único pellet e deitar fora o máximo possível de sobrenadantes no copo de resíduos. Semeie HEK293T células a uma concentração de três a cinco vezes 10 elevado a seis células em um frasco T25 contendo DMEM. Incubar o frasco durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção usando uma proporção de 1:1:1:1 de plasmídeos e uma proporção de 3:1 de reagente de transfecção para DNA de plasmídeo com meio de soro reduzido. Misture 75 microlitros de reagente de transfecção, 2.500 microlitros de meio de soro reduzido e 25 microgramas de DNA de plasmídeo total. Deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos.Em seguida, pipete cuidadosamente a mistura de transfecção nas células HEK293T confluentes no frasco contendo o meio. Agitar suavemente o balão para assegurar uma homogeneização adequada da mistura e incubá-lo a 37 graus Celsius durante 48 horas. Após dois dias de incubação, transferir o meio do produtor HEK293T frasco de células para um tubo cónico de 15 ml.Centrifugar o tubo a 800 x g durante cinco minutos para pulverizar as células HEK293T restantes. Remover cuidadosamente todo o vírus que contém sobrenadante sem perturbar o sedimento e transferi-lo para um novo tubo cónico de 15 ml. Conte e calcule o volume necessário da suspensão de células U937 para obter um projétil de 2 x 10 elevado a seis células.Em seguida, centrifugar a suspensão celular num tubo de 15 mililitros a 400 x g durante 10 minutos e decantar o sobrenadante, deixando o sedimento de célula no tubo. Ressuspender o sedimento celular no vírus contendo sobrenadante e centrifugar o tubo a 290 x g durante 60 minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta para ressuspender o pellet com o vírus contendo sobrenadante no tubo.Coloque o tubo em um rotador de ponta a ponta por 60 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo a 400 x g por 10 minutos e ressuspenda o pellet na proporção de 1:1 do vírus contendo sobrenadantes e meio RPMI 1640 completo, suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor. Transfira a mistura de células para um novo frasco de cultura de tecidos T25 e incubada a 37 graus Celsius por 48 horas.Após a incubação, centrifugue as células U937 a 400 x g durante 10 minutos e retire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com meio RPMI 1640 completo, suplementado com FBS inativado por calor a 10% e cinco microgramas por mililitro de puromicina. Transferir a cultura de células para um balão T25.Incube as células a 37 graus Celsius por duas a três semanas, verificando as células a cada um ou dois dias em busca de sinais de crescimento. A análise de Western blot confirmou a perda da expressão da proteína RIP1 em células mutantes RIP1 CRISPR sem sinal detectável em comparação com o sinal forte em células de controle do tipo selvagem e não-alvo. O tratamento com TCZ induziu morte celular necroptótica significativa em células controle selvagens e não-alvo, que foi revertida pelo tratamento com necrostatina-1s.Em contraste, as células nocaute RIP1 CRISPR mostraram morte celular significativamente menor em comparação com as células de controle do tipo selvagem e não-alvo sem efeito da necrostatina-1s, indicando uma perda da função RIP1. A microscopia de fluorescência de células vivas mostrou um aumento significativo na produção de superóxido mitocondrial em células de controle selvagens e não-alvo após o tratamento com TCZ, que foi reduzido após o tratamento com necrostatina-1. As células nocaute RIP1 CRISPR exibiram produção mínima de superóxido mitocondrial sem efeito observável do tratamento com necrostatina-1s.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 é um sistema robusto para produzir ruptura de genes e elementos genéticos. Aqui descrevemos um protocolo para a criação eficiente de deleções genômicas em linhagens celulares de mamíferos usando CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.

Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar mutante materno que acopla uma linha knock-in zpc:cas9 estável com a entrega mediada por Tol2 de de expressão de sgRNA.

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

Aprenda a gerar uma linhagem celular U937 knockout para RIP1 usando CRISPR-Cas9. Este método demonstra a eficácia da edição genética e destaca desafios experimentais na pesquisa com células humanas.

Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

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