Name: Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda imunoprecipitação com gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína em células HEK-293. Este método simplificado reduz a degradação proteica e confirma interações como DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1.

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Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (GN), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (GN), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (HO), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (GN) e MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (GN).

A Figura 1 apresenta uma visão geral do protocolo.
1. Preparação de soluções e tampões
<ol><li>Tampão de lise de proteínas: Prepare o tampão de lise de proteínas seguindo um relatório publicado anteriormente7 (Tabela 1).</li>
	<li>Tampão de lise de proteína + inibidor de protease (PI): Adicione o inibidor de protease (consulte a Tabela de Materiais) ao tampão preparado acima (etapa 1.1). Conservar a -20 °C.</li>
	<li>Tampão de amostra: Misture 900 μL de tampão de amostra 4x Laemmli (consulte a Tabela de Materiais) e 100 μL de 2-mercaptoetanol. Conservar a -20 °C.</li>
	<li>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano (PBS-P): Misture 1,998 L de PBS e 2 mL de monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano (ver Tabela de Materiais). Armazene em temperatura ambiente.</li>
	<li>1x tampão Tris/Glicina/SDS: Misture 450 mL de DDW e 50 mL de 10x Tris/Glicina/SDS. Prepare em temperatura ambiente no dia do uso.</li>
</ol>2. Transfecção de plasmídeo
<ol><li>Cultive células HEK-293 em um prato revestido de colágeno de 10 cm para subconfluência (80% -95%) usando meio de águia modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / mL de penicilina G e 10.000 μg / mL de estreptomicina) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prepare 1-10 μg de plasmídeo7 a ser transfectado por placa e faça uma mistura de transfecção. Adicionar 150 mM de NaCl a um volume final de 250 μL por placa. Vortex e gire a mistura.</li>
	<li>Adicione 60 μL de 1 mg / mL de polietilenimina (PEI, consulte a Tabela de Materiais) por prato, seguido de 150 mM de NaCl a um volume final de 250 μL de solução de PEI.</li>
	<li>Adicione a solução PEI à mistura de transfecção para fazer uma solução mista. Imediatamente vórtice (na velocidade máxima por 3-5 s, execute o mesmo depois disso) e gire para baixo.</li>
	<li>Incube em temperatura ambiente por 15-30 min. Durante esse tempo, mude o meio das células HEK-293.</li>
	<li>Polvilhe 500 μL / prato de solução misturada em todo o prato de células HEK-293 e incube durante a noite (13-14 h).</li>
	<li>Realize a troca média no dia seguinte.</li>
</ol>3. Lise celular e preparação de amostras
NOTA: Para evitar a degradação da proteína, as etapas subsequentes devem ser realizadas sem preservação ou congelamento e descongelamento da amostra, tanto quanto possível.
<ol><li>Aproximadamente 48 h após a transfecção, lave as células três vezes com PBS gelado, adicione 500 μL / prato de tampão de lise de proteína + PI e colete as células por raspador de células e uma pipeta em um tubo com baixa adsorção de proteínas no gelo.</li>
	<li>Vortex a cada 5 min e incubar as amostras no gelo por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue a 16.400 x g por 10 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 1,5 ml com baixa adsorção de proteínas. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C.</li>
	<li>Determine a concentração de proteína das amostras com um kit de medição de concentração de proteína de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Separe 200-1000 μg da mesma quantidade de proteína em cada amostra e, em seguida, adicione tampão de lise de proteína + PI para ajustar o volume total para 500-1000 μL. NOTA: As etapas a seguir são executadas no gelo.</li>
</ol>4. Preparação da pasta
NOTA: Prepare uma pasta 1:1 de gel de proteína G e gel de afinidade de etiqueta de epítopo no dia anterior ou no dia da imunoprecipitação.
<ol><li>Preparação de um gel de proteína G<ol><li>Usando uma ponta com a extremidade cortada, misture bem e separe o gel de proteína G (consulte a Tabela de Materiais) de modo que 20 μL de grânulos por amostra sejam preparados.</li>
		<li>Centrifugue a 12.000 x g por 20 s a 4 °C e coloque os grânulos no gelo por 1 min para permitir que os grânulos se nivelem. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
		<li>Adicione 1 mL de tampão de lise de proteína + PI ao gel de proteína G preparado na etapa 4.1.2 e misture batendo e invertendo. Centrifugue a 12.000 x g por 20 s a 4 °C, coloque os grânulos no gelo por 1 min para permitir que os grânulos se nivelem e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Repita a etapa 4.1.3 três vezes.</li>
		<li>Adicione um volume igual de tampão de lise de proteína ao gel de proteína G para fazer uma pasta de gel de proteína G 1:1. A pasta de gel de proteína G pode ser armazenada a 4 °C por aproximadamente 1 dia.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de um gel de afinidade de etiqueta de epítopo<ol><li>Usando uma ponta com a extremidade cortada, agite bem e separe o gel de afinidade da etiqueta de epítopo (consulte a Tabela de Materiais) de modo que 10-15 μL de grânulos por amostra sejam preparados.</li>
		<li>Centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 °C e aguarde 1 min no gelo para permitir que os grânulos se nivelem. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
		<li>Adicione 1 mL de tampão de lise de proteína + PI ao gel de afinidade de tag de epítopo preparado na etapa 4.2.2 e misture batendo e invertendo. Centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 ° C, coloque os grânulos no gelo por 1 min para permitir que os grânulos se nivelem e descarte o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Repita a etapa 4.2.3 duas vezes.</li>
		<li>Adicione 500 μL de glicina 0,1 M (pH 3,5) ao gel de afinidade da etiqueta de epítopo preparado na etapa 4.2.4 e misture batendo e invertendo. Esta etapa é realizada para remover anticorpos livres de marcação de epítopos. Dentro de 20 minutos após a adição de glicina, centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 ° C, coloque as esferas no gelo por 1 minuto para permitir que as esferas se nivelem e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 500 μL de tampão de lise de proteína + PI ao gel de afinidade de etiqueta de epítopo preparado na etapa 4.2.5 e misture batendo e invertendo. Centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 ° C, coloque os grânulos no gelo por 1 min para permitir que os grânulos se nivelem e descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Repita a etapa 4.2.6 três vezes.</li>
		<li>Adicione um volume igual de tampão de lise de proteína ao gel de afinidade de etiqueta de epítopo para preparar uma pasta de gel de afinidade de etiqueta de epítopo 1:1. A pasta de gel de afinidade de etiqueta de epítopo pode ser armazenada a 4 °C por aproximadamente 1 dia.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Pré-limpeza com o gel de proteína G e captura de complexos proteicos com o gel de afinidade de etiqueta de epítopo
<ol><li>Misturar a pasta de proteína G 1:1 (preparada no passo 4) com uma pipeta equipada com uma ponta cortada e adicionar 40 μL de cada vez à amostra.</li>
	<li>Girar a amostra durante 1 h num rotador (ver Tabela de Materiais) em cerca de 30 s por ciclo numa câmara frigorífica (4 °C).</li>
	<li>Centrifugue a 12.000 x g por 20 s a 4 °C e coloque os grânulos no gelo por 1 min para permitir que os grânulos se nivelem.</li>
	<li>Colete o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 1,5 ml com baixa adsorção de proteínas.</li>
	<li>Separe a amostra para entrada da amostra na etapa 5.4 e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 20-30 μL de pasta de gel de marcação de epítopo 1:1 à amostra.</li>
	<li>Girar sobre um rotador durante cerca de 30 s por ciclo numa câmara frigorífica (4 °C) durante 2 h.</li>
	<li>Adicione o tampão de amostra à entrada preparada na etapa 5.5 para diluí-la a 4x e aqueça a 98 ° C por 10 min. A entrada pode ser armazenada a -80 °C. NOTA: Devido à possibilidade de degradação da proteína devido ao congelamento e descongelamento, as etapas subsequentes devem ser realizadas sem preservar a proteína o máximo possível.</li>
</ol>6. Lavagem e eluição das proteínas precipitadas
<ol><li>Defina a temperatura do bloco de calor para 98 °C.</li>
	<li>Centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 °C e aguarde 1 min no gelo para permitir que os grânulos se nivelem. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lise de proteína + PI e misture batendo e invertendo. Girar sobre um rotador durante cerca de 30 s por ciclo numa câmara frigorífica (4 °C) durante 5 min. Centrifugue a 5.000 x g por 30 s a 4 °C, aguarde 1 min no gelo para permitir que os grânulos se nivelem e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 6.3 5-10 vezes.</li>
	<li>Adicione 10 μL de tampão de amostra à amostra preparada na etapa 6.4. Ferva a 98 °C por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue a 5.000 x g a 4 °C por 30 s.</li>
	<li>Coloque uma coluna em um novo tubo com baixa adsorção de proteínas e transfira o gel para a coluna usando uma pipeta com ponta cortada. Uma coluna é usada para evitar a contaminação do gel.</li>
	<li>Centrifugue a 9.730 x g por 1 min a 4 °C. Colete o fluxo. A amostra pode ser armazenada a -80 °C. NOTA: Se a degradação da amostra for uma preocupação, o seguinte immunoblotting deve ser realizado sem congelamento.</li>
</ol>7. Immunoblotting
NOTA: Os procedimentos de immunoblotting são baseados em relatos anteriores 7,8.
<ol><li>Carregue amostras inteiras em um gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE, consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Se necessário, use géis de poços grandes para que toda a amostra possa ser transferida. Géis com poços de 50 μL foram usados aqui.</li>
	<li>Coloque os géis na câmara de eletroforese e adicione 1x tampão Tris/Glicina/SDS (consulte a Tabela de Materiais) até o volume apropriado ao redor dos géis.</li>
	<li>Géis eletroforese a 100 V e 400 mA.</li>
	<li>Transfira para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF, consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Bloqueie os borrões de membrana de PVDF com 5% de leite desnatado em PBS-P por 1 h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a membrana três vezes com PBS-P em um shaker em velocidade máxima por 5 min. Execute o mesmo procedimento depois disso ao lavar.</li>
	<li>Incubar durante a noite num agitador com o anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) a 4 °C.</li>
	<li>Lave a membrana três vezes com PBS-P no dia seguinte.</li>
	<li>Incubar durante 1 h com o anticorpo secundário num agitador à temperatura ambiente. NOTA: Se o peso molecular da proteína-alvo estiver próximo da cadeia pesada de IgG, que tem um peso molecular de cerca de 50 kDa, um anticorpo secundário específico da cadeia leve pode ser usado para evitar a sobreposição da banda alvo com a cadeia pesada de IgG. Este estudo usou anticorpos específicos de cadeia leve7 ou Veriblot como reagente de detecção de IP (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Identifique bandas de proteínas com substratos luminescentes de peroxidase. A membrana pode ser guardada em PBS após lavá-la duas vezes com PBS-P.</li>
	<li>Descasque por 10 min com uma solução de decapagem (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Lave três vezes e bloqueie com 5% de leite desnatado em PBS-P. O protocolo posterior é o mesmo da etapa 7.6 em diante.</li>
</ol>

Análise de interação proteica em células HEK-293 usando co-imunoprecipitação

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+from+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li>
<li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics%3B+current+achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li>
<li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLAG+peptide%2C+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemical+and+biophysical+methods%22%5BJournal%5D)">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li>
<li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+PPAR%CE%B1+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143(2023).</li>
<li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16%2FCtBP+transcriptional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li>
<li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li>
<li>Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+effects+on+adipocytes+are+influenced+by+the+presence+of+lysine+methyltransferases%2C+G9a+%28EHMT2%29+and+GLP+%28EHMT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1).</a> Biology. 12 (5), 674(2023).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT1+controls+brown+adipose+cell+fate+and+thermogenesis+through+the+PRDM16+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex.</a> Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).</li>
<li>Bian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+establishing+a+protein-protein+interaction+network+using+tandem+affinity+purification+followed+by+mass+spectrometry+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).</li>
<li>Cristea, I. M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243(2009).</li>
<li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+%28IP%29+coupled+with+LC-MS%2FMS+identification+of+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li>
<li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).</li>
</ol>

Declaramos que nenhum dos autores tem conflitos de interesse relacionados a este estudo.

Este protocolo é quase como os protocolos relatados anteriormente 5,7,14,15. O ponto importante deste protocolo é que nunca paramos o experimento da etapa de lise celular para a etapa de imunoprecipitação. A degradação da proteína dificulta a detecção de IBP. O curso de tempo prolongado e os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento degradam as proteínas. A eletroforese em SDS-PAGE também deve ser realizada no mesmo dia da imunoprecipitação, não apenas para minimizar a degradação da proteína, mas também para maximizar a detecção de IBP.
Em adipócitos termogênicos, a interação entre EHMT1 e PRDM16 foi relatada em estudoanterior13. O complexo EHMT1 - PRDM16 regula o destino das células adiposas marrons e a termogênese13. O EHMT1 faz com que o PRDM16 se estabilize interrompendo a interação do PRDM16 - proteína de ligação à proteína amilóide (APPBP) 216. Esta estabilização PRDM16 é regulada por cullin(CUL) 2-APPBP2 e EHMT116.
Neste estudo, as células HEK-293 foram utilizadas porque as células HEK-293 são amplamente utilizadas na produção de proteínas recombinantes17. Outras linhagens celulares fáceis de transfectar com plasmídeos podem ser usadas, como células Cos-7 e células Hela. A PEI foi usada para transfecção porque a PEI é mais econômica e simples em comparação com a lipofecção convencional.
A pré-limpeza, a rotação em um gel de afinidade de etiqueta de epítopo e a lavagem são etapas particularmente importantes neste método. A pré-limpeza pode remover as proteínas que se ligam inespecificamente ao gel. Além disso, o tempo de rotação com o gel de afinidade da etiqueta de epítopo é importante porque o tempo excessivo pode resultar na detecção de proteínas inespecíficas, e o tempo insuficiente pode dificultar a detecção das proteínas-alvo.
Os seguintes pontos devem ser observados. As células HEK-293 se desprendem facilmente; portanto, pratos revestidos de colágeno devem ser usados na preparação das amostras. A solução de PEI é citotóxica; portanto, o meio deve ser substituído após a transfecção sem deixar as células por um período prolongado. Se os IBPs não forem observados, a quantidade de plasmídeos transfectados pode ser insuficiente e/ou a quantidade de proteína trazida para o IP pode ser baixa. Além disso, se o número de lavagens for excessivo, as interações podem ser perdidas. Para resolver isso, o seguinte pode ser considerado: aumentar a quantidade de plasmídeo introduzido nas células HEK-293, aumentar a quantidade de proteína usada para IP e reduzir o número de lavagens. Além disso, se sobrar muito sobrenadante na lavagem final, ele transbordará dos poços do gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio. Se forem observadas bandas inespecíficas, a quantidade de plasmídeo/proteína usada para IP pode ser muito alta ou o número ou intensidade das lavagens pode ser insuficiente. Isso pode ser resolvido reduzindo a quantidade de plasmídeo/proteína usada para IP, aumentando o número de lavagens ou aumentando o poder de lavagem aumentando a concentração de sal no tampão de lavagem.
Detergentes comumente usados, como o éter octilfenílico de polioxietileno (10), podem perturbar os IBPs funcionalmente significativos18. Detergentes mais suaves podem aumentar a recuperação de complexos funcionalmente importantes, enquanto podem produzir um nível inaceitável de interações inespecíficas devido à solubilização incompleta. O tampão de lise de proteína usado no estudo atual contém 1% de éter octilfenílico de polioxietileno (10). Este tampão lisa proteínas citoplasmáticas com grandes quantidades de proteínas superexpressas pelos plasmídeos transfectados. Quando a imunoprecipitação é realizada em amostras preparadas pela separação de núcleos e citoplasma, o fundo é diminuído em comparação com amostras preparadas por lise de células inteiras, e bandas alvo claras podem ser identificadas17. Se a imunoprecipitação for realizada com proteínas no núcleo, as proteínas nucleares podem ser extraídas usando um kit comercial de extração nuclear ou destruindo e removendo o citoplasma com tampão de baixo teor de sal contendo detergente e, posteriormente, extraindo proteínas nucleares com tampão de sal19. O tempo de desenvolvimento em immunoblotting deve ser ajustado não apenas para evitar o fundo, mas também para detectar certas bandas.
Este método tinha várias limitações. Primeiro, usamos um PPI que é altamente esperado para detectar. Em segundo lugar, como a expressão de cada gene depende da combinação de plasmídeos, proteína insuficiente pode ser obtida e, portanto, a interação pode não ser detectada.
Em resumo, usando este método, os IBPs podem ser confirmados de forma econômica e fácil em comparação com a espectrometria de massa. O PPI entre as várias proteínas fundidas da etiqueta de epítopo também pode ser confirmado usando anticorpos de afinidade contra cada etiqueta em vez do gel de afinidade da etiqueta de epítopo. Métodos de imunoprecipitação semelhantes podem ser realizados em outros tipos de células, introduzindo um plasmídeo expressando qualquer proteína fundida à etiqueta DYKDDDDK. Além disso, o uso de anticorpos endógenos em vez de um gel de afinidade de etiqueta de epítopo torna possível confirmar PPIs endógenos em vários tipos de células.

As proteínas desempenham um papel importante em todas as funções celulares, incluindo processamento de informações, metabolismo, transporte, tomada de decisão e organização estrutural. As proteínas medeiam suas funções interagindo fisicamente com outras moléculas. As interações proteína-proteína (PPIs) são importantes para mediar as funções celulares, como mediar a transdução de sinal, detectar o ambiente, converter energia em movimento físico, regular a atividade de enzimas metabólicas e de sinalização e manter a organização celular1. Assim, os IBPs podem ser usados para elucidar funções desconhecidas2. Os métodos de detecção de IBPs podem ser classificados em três tipos: in vitro, in vivo e in silico. Co-imunoprecipitação (co-IP), cromatografia de afinidade, purificação de afinidade em tandem, matrizes de proteínas, exibição de fagos, complementação de fragmentos de proteínas, cristalografia de raios-X e espectroscopia de ressonância magnética nuclear têm sido usadas para detecção in vitro de IBP3. Dentre esses métodos, o co-IP é amplamente utilizado devido à sua simplicidade.
A tag de fusão FLAG consiste em oito aminoácidos (AspTyrLysAspAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), incluindo um local de clivagem da enteroquinase, e foi projetada especificamente para cromatografia de imunoafinidade4. As proteínas marcadas com DYKDDDDK são reconhecidas e capturadas usando um anticorpo anti-DYKDDDDK. Portanto, eles são eficientemente puxados para baixo usando grânulos de agarose de ligação DYKDDDDK5 para confirmar sua ligação a proteínas específicas de maneira simples. A imunoprecipitação pode ser realizada em uma variedade de células, e uma ampla gama de IBPs pode ser confirmada usando anticorpos contra a proteína de interesse. Imunoprecipitação e eluição de peptídeos com grânulos de agarose anti-DYKDDDDK foram relatados anteriormente5.
Aqui, fornecemos um método simples de imunoprecipitação no qual um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com DYKDDDDK é introduzido transitoriamente em células HEK-293 para confirmar a associação de duas proteínas de interesse. Certos anticorpos DYKDDDDK podem se ligar ao terminal N e ao terminal C das proteínas de fusão, mas não a outros6. Portanto, para evitar confusão, o anticorpo que reconhece a etiqueta fundida aos terminais N e C deve ser escolhido. Ao inserir uma etiqueta de epítopo, pode ser possível evitar mudanças conformacionais na proteína inserindo de 3 a 12 pares de bases entre a etiqueta de epítopo e a proteína alvo. No entanto, a sequência inserida deve ser um par de bases em múltiplos de 3 para evitar o deslocamento de quadros.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH8.0)</td><td>Nippon gene</td><td>311-90075</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços, 50 &micro; L</td><td>Biorad</td><td>4561034</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, Ovelha Ab Inteira Ligada a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anti-Coelho, Burro Ab Inteiro Ligado a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células M</td><td>Sumitomo Baquelite</td><td>MS-93170</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I Prato de Revestimento 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Inibidor de Protease sem EDTA Coquetel</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>077-00735</td><td></td></tr><tr><td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724</td><td>Sinalização Celular</td><td>C29F4</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampão</td><td>de amostra Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colunas de Cromatografia</td><td>Biorad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell para Mini Géis Pré-moldados</td><td>Biorad</td><td>1658004JA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal ANTI-FLAG M2 produzido em camundongo</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td><td>Este artigo</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-EHMT1</td><td>Este papel</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-vector</td><td>Este papel</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Grau de Transfecção Linear Cloridrato de polietilenina</td><td>PSI</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA</td><td>Thermo scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno (10) Éter octilfenílico</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno (20) Monolaurato de sorbitano</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs</td><td>Cytiva</td><td>17061801</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes</td><td>eppendorf</td><td>30108442</td><td></td></tr><tr><td>ROTATOR RT-5</td><td>TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>leite desnatado</td><td>Morinaga</td><td>0652842&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução de decapagem</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>193-16375</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td><td>Biorad</td><td>1704156B03</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo System</td><td>Biorad</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>USDA Testado Fetal Soro Bovino (FBS)</td> <td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Veriblot</td><td>Abcam</td><td>ab131366</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin (13E5) Rabbit mAb&nbsp;#4970</td><td>Sinalização Celular</td><td>4970S</td><td></td></tr></tbody></table>

imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

As interações proteína-proteína (PPIs) desempenham um papel fundamental em fenômenos biológicos, como organização celular, transdução de sinal intracelular e regulação transcricional. Portanto, entender os IBPs é um ponto de partida importante para uma investigação mais aprofundada da função da proteína-alvo. Neste estudo, propomos um método simples para determinar a ligação de duas proteínas-alvo, introduzindo vetores de expressão de mamíferos em células HEK-293 usando o método de polietileminina, lisando as células em tampão de lise de proteína caseiro e puxando para baixo as proteínas-alvo em um gel de afinidade de etiqueta de epítopo. Além disso, o PPI entre as várias proteínas fundidas da etiqueta de epítopo pode ser confirmado usando anticorpos de afinidade contra cada etiqueta em vez do gel de afinidade da etiqueta de epítopo. Este protocolo também pode ser usado para verificar vários PPIs, incluindo extratos nucleares, de outras linhagens celulares. Portanto, pode ser usado como um método básico em uma variedade de experimentos de PPI. As proteínas se degradam por um longo curso de tempo e ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Portanto, a lise celular, a imunoprecipitação e o immunoblotting devem ser realizados da forma mais perfeita possível.

Os adipócitos termogênicos, também conhecidos como adipócitos marrons e bege, têm potenciais efeitos antiobesidade e anti-intolerância à glicose. O domínio 16 contendo PR (PRD1-BF1-RIZ1 homólogo) (PRDM16) é um cofator de transcrição que desempenha um papel importante na determinação da identidade dos adipócitos termogênicos 9,10.
EHMT1 (histona-lisina N-metiltransferase 1 eucromática), também conhecido como GLP, catalisa principalmente a mono e dimetilação da lisina 9 da histona H3 (H3K9) usando o cofator S-adenosil metionina11. Um relatório anterior indicou que o EHMT1 é uma metiltransferase essencial no complexo PRDM16 que controla o destino das células adiposas termogênicas por meio da metilação das histonas12,13. Além disso, relatamos anteriormente que os níveis de expressão de PRDM16 e EHMT1 estão significativamente correlacionados com os de genes termogênicos no tecido adiposo marrom perirrenal humano (BAT), sugerindo que tanto o PRDM16 quanto o EHMT1 desempenham papéis importantes no desenvolvimento do BAT humano8.
Para demonstrar a eficiência deste protocolo como método de confirmação de IBPs, transfectamos DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1 em células HEK-293 e imunoprecipitamos DYKDDDDK-PRDM16 usando o protocolo acima. PRDM16 marcado com DYKDDDDK e EHMT1 marcado com HA foram inseridos nos locais de clonagem do vetor de expressão de mamíferos pcDNA3.1 (ver Tabela de Materiais). O immunoblotting confirmou a associação entre DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1 nos grupos transfectados com DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da co-imunoprecipitação. O esquema do protocolo é mostrado aqui. O lado direito mostra o fluxo de trabalho do protocolo; O lado esquerdo mostra uma representação gráfica das reações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig02.jpg"> Figura 2: PRDM16 associa-se ao EHMT1. As células HEK-293 foram transfectadas com vetor (controle negativo), DYKDDDDK-PRDM16 ou DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1. A co-imunoprecipitação foi posteriormente realizada usando um gel de afinidade tag DYKDDDDK, seguido de immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Tampão de lise de proteínas 250 mL (filtração de 0,22 μm, armazenar a 4 °C)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ml</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>1 M Tris pH 8,0</td>
			<td>12.5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>5 M NaCl</td>
			<td>7.5</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>0,5 M Ácido etilenodiaminotetracético</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>Glicerol</td>
			<td>25</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Éter octilfenílico de polioxietileno(10)</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>DDW</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>250</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Composição do tampão de lise de proteínas.

As interações proteína-proteína são importantes para elucidar a função das proteínas-alvo, e a co-imunoprecipitação (co-IP) pode facilmente confirmar os IBPs. Transfectamos transitoriamente um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com epítopo em células HEK-293 e desenvolvemos um método de imunoprecipitação para confirmar facilmente a ligação de duas proteínas-alvo.

Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

O escopo de nossa pesquisa abrange a exploração dos mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento e a função da gordura marrom e bege. Troncos, fatores de atrito e cofatores, como o complexo PRDM 16, NFIA e o complexo PPR alfa ELK-1 que encontramos mais recentemente, controlam o destino e a função das células de gordura marrom e bege. Além disso, a diafonia de adipócitos de células imunes foi identificada como atores-chave.Para avançar na pesquisa em seu campo, empregamos várias tecnologias de ponta. Isso inclui PCR quantitativo e imunoprecipitação de cromatina para analisar mudanças na expressão gênica, bem como chamada de imunoprecipitação e espectrometria de massa para investigar alterações nas interações proteína-proteína, PPIs, associadas à diferenciação em adipócitos bege. Apesar de seguir o protocolo padrão para imunoprecipitação, a detecção de IBPs geralmente é um desafio.A degradação de proteínas é a principal causa desse problema, que devemos evitar com cuidado. Este protocolo é mais simples e menos dispendioso do que outras técnicas para examinar IBPs e não inclui congelamento no processo, reduzindo assim a degradação de proteínas o máximo possível.

immunoprecipitation-with-an-anti-epitope-tag-affinity-gel-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Este vídeo demonstra complexos proteicos co-imunoprecipitados em uma membrana de PVDF para análise de interação proteína-proteína. As proteínas reduzidas dos complexos foram tratadas com tripsina para clivar as proteínas individuais nos peptídeos menores e, em seguida, os peptídeos restantes foram extraídos da membrana do PVDF. O peptídeo puxado derivado de ambas as proteínas do complexo foi então seco e ressuspenso em baixa concentração de ácido fórmico para posterior análise.

Digestão de proteínas na membrana para preparar proteínas co-imunoprecipitadas para estudos de interação

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para realizar a co-imunoprecipitação de proteínas PD-1 do tipo selvagem e mutantes marcadas com GFP usando esferas revestidas com anticorpos anti-GFP. As proteínas PD-1-GFP ligadas a grânulos são incubadas com proteínas SHP2 que interagem com PD-1, permitindo a identificação de motivos estruturais específicos em PD-1 que desempenham um papel crítico na interação SHP2.

Ensaio de imunoprecipitação para estudar interações de receptores enzimáticos em células transfectadas

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.<br...

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Aprenda imunoprecipitação com gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína em células HEK-293. Este método simplificado reduz a degradação proteica e confirma interações como DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1.

Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

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