Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica
12 de janeiro de 2024
Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.
A microscopia correlativa de luz e elétrons é uma técnica de microscopia completamente estável, que pode combinar as informações de localização fornecidas pela microscopia fluorescente e é a ultraestrutura por microscopia eletrônica. No entanto, a mentalidade dessa técnica é preservar a fluorescência de depois de ter uma preparação simples. Usando esta proteína fluorescente, podemos obter luz correlativa e o microscópio eletrônico que pode manter a fluorescência e a ultra estrutura simultaneamente.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo detalhado para microscopia correlative de luz e elétrica pós-embutimento em Epon utilizando a proteína fluorescente mScarlet. O método preserva com sucesso tanto a fluorescência quanto a ultraestrutura, tornando-o aplicável a diversas aplicações biológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Microscopia correlativa de luz e elétrons
- Aplicações de proteínas fluorescentes
- Técnicas de microscopia
Antecedentes
- Combinação de microscopia fluorescente com microscopia eletrônica
- Dificuldades na preservação da fluorescência durante o preparo
- Uso de mScarlet para melhorar a imagem
Métodos Utilizados
- Técnicas de microscopia correlativa de luz e elétrona
- Tecido cerebral de camundongo como modelo biológico
- Pós-inclusão usando Epon e mScarlet
Resultados Principais
- Preservação bem-sucedida da fluorescência e ultraestrutura
- Imagem detalhada de tecido cerebral
- Alinhamento eficaz dos sinais de microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica
Conclusões
- O estudo demonstra um método confiável para microscopia correlativa de luz e elétrons
- Destaca o potencial para aplicações mais amplas na pesquisa biológica
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia correlative de luz e elétrica (CLEM) com inclusão em resina epóxi permite a preservação simultânea da fluorescência e da ultraestrutura, abordando um desafio crítico na etapa de descoberta em imagem celular. Essa capacidade aumenta a desvinculação mecanicista e a validação de alvos ao fornecer contexto espacial de alta resolução para a localização molecular. O método oferece confiança preditiva em pontos críticos importantes dos estágios iniciais de descoberta e nas etapas pré-clínicas de pesquisa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a localização precisa de alvos moleculares dentro da ultraestrutura celular preservada.
- Apóia a validação funcional de alvos ao correlacionar sinais de fluorescência com características ultraestruturais.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da visualização direta de relações moleculares e estruturais.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos na linha de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara seções biológicas validadas para fluxos de trabalho de imagem de alto conteúdo downstream.
- Garante reprodutibilidade e resultados de imagem quantitativa ao manter tanto a fluorescência quanto a ultraestrutura.
- Apoia a padronização e escalabilidade de ensaios para aplicações de triagem que exigem resolução espacial.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre estruturas subcelulares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de localização molecular com alterações ultraestruturais relevantes para a doença em modelos pré-clínicos.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica ao integrar dados de imagem multimodal.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em evidências espaciais e moleculares robustas.
- Impulsiona o desenvolvimento de biomarcadores translacionais ao correlacionar fluorescência com patologia ultraestrutural.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a pesquisa pré-clínica, conectando a localização molecular e a análise ultraestrutural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao correlacionar dados moleculares e estruturais.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições de alta resolução e saídas de registro de imagens para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhar marcadores moleculares com ultraestruturas relevantes para doenças em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável para diversos programas de P&D que exigem microscopia correlativa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem e garante reprodutibilidade entre experimentos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados espaciais robustos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos de descoberta e pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica.
- Exige acesso a instrumentação avançada de imagem e software de registro de imagens.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de tecidos ou sistemas modelo.
- Depende da compatibilidade das proteínas fluorescentes com a inclusão em Epon e o preparo para microscopia eletrônica.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
