Name: Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a produzir matriz extracelular cardíaca a partir de fibroblastos humanos adultos para revestimento de placas de cultura. Este método permite estudar interações célula-matriz em modelos de engenharia tecidual tridimensional.

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<meta charset="utf8"></head><body>Geração de matriz extracelular que imita miocárdio para cultura de células

<ol><li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Frasco de laboratório de 1 L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td>Limpar e autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>Estéril,&nbsp; placa de vidro de poliestireno</td></tr><tr><td>de 100 mm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>Limpar e autoclave antes de utilizar</td></tr><tr><td>Placas de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Treated, placa de cultura de células estéreis</td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tubos estéreis de centrífuga, polipropileno</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Vidros de cobertura</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>Autoclave antes da utilização</td></tr><tr><td>25 mL pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>Estéril, &nbsp; frasco de laboratório de poliestireno</td></tr><tr><td>250 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>Limpar e autoclave antes de utilizar</td></tr><tr><td>placas de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Treated, placa de cultura de células estéreis</td></tr><tr>5<td>mL pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>357543</td> Tubos estéreis de <td>poliestireno</td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Tubos estéreis para centrífugas, polipropileno</td></tr><tr><td>Frasco de laboratório de 500 mL</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>Limpar e autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Placas de 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Treated, placa de cultura de células estéreis</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio (NH4OH)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>338818</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>Estéril e descartável</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Armazene a 2-8 > C; evite a exposição à luz Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino (FBS)</td> <td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Armazene a -20 ° C. O soro deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>Limpar e autoclave antes</td></tr><tr><td>de usar Gelatina de pele suína</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Pó Comercial</td></tr><tr><td>Solução Salar Balanceada Hank's (HBSS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica grande</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>Limpar e autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S3146</td><td>Limpe e autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina e Estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Loja a -20&deg;C. A solução&nbsp; deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores</td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Pó Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio em Pó&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>Filtros de Pó</td></tr><tr><td>Stericup</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>Membranas de filtro estéreis e descartáveis de 0,22 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Líquida-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Armazenar a -20 °C. Deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores</td></tr></tbody></table>

produção de matriz extracelular cardíaca a partir de fibroblastos humanos adultos para revestimento de placa de cultura

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

O crescimento de fibroblastos dos pequenos fragmentos de miocárdio nativo colocados em cultura foi observado dentro de 3-5 dias (Figura 1).
Nos dias subsequentes, o número de fibroblastos continuou a aumentar, possivelmente devido ao crescimento sustentado da amostra de tecido cardíaco e à proliferação de fibroblastos migrados na superfície da placa. Não se deve esperar que todos os fragmentos de miocárdio obtidos por desagregação mecânica com bisturi produzam o mesmo número de fibroblastos no mesmo tempo, pois os fragmentos de tecido resultantes podem ter volumes e taxas de sobrevivência celular ligeiramente diferentes. Notavelmente, fragmentos de miocárdio com atividade de crescimento confirmada podem ser retidos e replaqueados, permitindo que sejam usados pelo menos duas vezes para isolamento de fibroblastos.
Os fibroblastos podem ser subcultivados por várias passagens para aumentar o número de células disponíveis para experimentos futuros. No entanto, uma vez que atingem a confluência, os fibroblastos deixam de proliferar in vitro e assumem atividade de síntese e secreção, depositando matriz extracelular. A descelularização subsequente deixa a superfície da placa revestida com tela de MEC cardíaca (Figura 2). A observação visual da placa de cultura, a olho nu e usando um microscópio de contraste de fase invertido, durante a remoção de fibroblastos é essencial para minimizar o tempo de incubação na solução de descelularização ao mínimo necessário e suficiente. A presença de um véu flutuante durante a incubação indica permeabilização e descolamento da monocamada de fibroblastos, e a solução de descelularização deve ser diluída e removida imediatamente após.
A composição da ECM cardíaca derivada de fibroblastos depende da fonte dos fibroblastos. Em nossos experimentos, a MEC cardíaca produzida por fibroblastos isolados de corações humanos normais e de corações humanos com cardiopatia isquêmica apresentou diferentes teores proteicos e exerceu diferentes influências na proliferação, apoptose e migração de células cardíacas primitivas11,12. Embora a perda de proteína da MEC seja inevitável durante o processo de descelularização, o método empregado no presente protocolo preservou em grande parte a composição e a arquitetura da MEC cardíaca produzida in vitro (Figura 3).
Nesse protocolo, o tecido atrial foi utilizado porque pode ser obtido tanto de corações normais (doadores) quanto patológicos (receptores). Embora todo o coração patológico (receptor) possa ser seccionado e usado para pesquisa (seguindo os princípios da Declaração de Helsinque e com a aprovação do comitê de ética local), não é possível obter amostras de ventrículos do coração do doador no momento do transplante. Por esse motivo, se o objetivo do estudo é investigar diferenças entre o tecido cardíaco em condições normais e patológicas, a melhor fonte de amostra é a parede atrial. Dependendo da disponibilidade de outras fontes viáveis de tecido cardíaco, amostras das paredes atriais ou ventriculares dos corações normais ou patológicos podem ser usadas seguindo o mesmo protocolo para o revestimento da placa de ECM cardíaca.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento de fibroblastos cardíacos. Crescimento de fibroblastos de fragmentos de miocárdio após 4 dias (A), 8 dias (B) e 12 dias (C) dias de cultura. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg"> Figura 2: Descelularização da matriz extracelular. Fibroblastos após aproximadamente 10 s (A), 20 s (B), 30 s (C), 40 s (D), 50 s (E) e 60 s (F) de incubação na solução de descelularização. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg"> Figura 3: Composição da matriz extracelular antes e depois da descelularização. Coloração por imunofluorescência indireta de proteínas representativas da matriz extracelular cardíaca, incluindo colágeno tipo III (A,E) e tipo IV (B,F), laminina (C,G) e fibronectina (D,H), antes (A-D) e após (E-H) remoção de fibroblastos. Os núcleos celulares foram corados com DAPI (azul). Barras de escala: (A-C,E-G) 50 μm; (D,H) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluções</td>
			<td colspan="2">Composição das soluções</td>
			<td>Volume final</td>
			<td>Comentários</td>
		</tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td>
			<td colspan="2">Sais comercializados + água estéril bidestilada + 0,35 g de bicarbonato de sódio</td>
			<td>1 L</td>
			<td>Esterilizado por filtração/armazenamento a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solução de descelularização</td>
			<td colspan="2">0,25% Triton X-100 + 10 mM NH4OH+ PBS</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>Esterilizado por filtração/armazenamento a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td>
			<td colspan="2">223,75 mL de DMEM + 25 mL de soro fetal bovino + 1,25 mL de solução de penicilina/estreptomicina</td>
			<td>250 mL</td>
			<td>Conservar a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solução de gelatina</td>
			<td colspan="2">0,2 g de gelatina em pó + 100 mL de solução salina tamponada com fosfato</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>Esterilizado por filtração/armazenamento a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0,1 g de fosfato de potássio monobásico + 0,1 g de cloreto de potássio + 4,0 g de cloreto de sódio + 0,575 g de fosfato de sódio dibásico + água estéril bidestilada</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>Esterilizado por filtração/armazenamento a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Solução de parada de tripsina (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 mL de soro fetal bovino + 45 mL de solução salina balanceada de Hank</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>Conservar a 4 °C</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Os componentes e as respectivas concentrações para cada solução utilizada no estudo.

Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

O objetivo do presente protocolo é a produção de fibras da matriz extracelular toda alvejado para reparação da ferida que são apropriados para avaliação pré-clínicos como parte de um implante de andaime regenerativa. Estas fibras são produzidas pela cultura de fibroblastos nas membranas de fibra oca e extraídas por dissolução das membranas.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).

Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial

O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Apresentado aqui é um protocolo para gerar tecidos conjuntivos projetados para uma cultura paralela de 48 tecidos em uma placa multi-bem com polos duplos, adequado para estudos mecanísticos, modelagem de doenças e aplicações de rastreamento. O protocolo é compatível com fibroblastos de diferentes órgãos e espécies e é exemplificado aqui com fibroblastos cardíacos primários humanos.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Aprenda a produzir matriz extracelular cardíaca a partir de fibroblastos humanos adultos para revestimento de placas de cultura. Este método permite estudar interações célula-matriz em modelos de engenharia tecidual tridimensional.

Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura

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