Name: Bactérias da Impressão 3D para Estudo da Motilidade e Crescimento em Meios Porosos 3D Complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprenda a imprimir colônias bacterianas em matrizes de hidrogel granular para estudar motilidade e crescimento em ambientes 3D porosos. Este método revela diferenças no comportamento de Vibrio cholerae e E. coli comparado a culturas líquidas tradicionais.

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R.K.B. agradece o apoio do Programa de Bolsistas Presidenciais de Pós-Doutorado. Este material também é baseado em trabalho apoiado pela NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (para A.M.H.). A.S.D.-M. e H.N.L. agradecem o apoio do Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund da Universidade de Princeton. Agradecemos também ao laboratório de Bonnie Bassler pelo fornecimento de cepas de V. cholerae. A S.S.D. reconhece o apoio da NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 e EF-2124863, bem como do Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, da New Jersey Health Foundation, do Pew Biomedical Scholars Program e do Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Esta abordagem consiste em converter uma impressora comercial de modelagem de deposição fundida 3D em uma bioimpressora 3D usando um protocolo previamente estabelecido por Tashman et al.34. Em resumo, Tashman e colaboradores substituíram uma cabeça de extrusora comercial por uma extrusora de bomba de seringa personalizada. Esta extrusora permite a impressão de suspensões líquidas altamente concentradas de células bacterianas em 3D, com seu volume extrudado e posição 3D controlados pela linguagem de programação G-code. O volume extrudado é especificado no software pela etapa da extrusora (E-step) e é adicionalmente calibrado conforme descrito abaixo. Essas suspensões bacterianas são, portanto, impressas diretamente em uma matriz granular de hidrogel, que atua como um suporte 3D para as células. Abaixo, o protocolo também descreve como preparar matrizes com diferentes concentrações de polímeros, caracterizar as mudanças resultantes no tamanho dos poros e propriedades reológicas, e caracterizar a motilidade e o crescimento bacterianos subsequentes usando imagens diretas.
1. Conversão de uma impressora 3D comercial em uma bioimpressora 3D
<ol><li>Remova a extrusora e o aquecedor de uma impressora 3D comercial (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Siga os protocolos anteriores para fabricar a extrusora da bomba de seringa34, com uma modificação adicional para acomodar uma seringa Luer lock descartável. Monte a extrusora da bomba de seringa na impressora. NOTA: Os arquivos CAD necessários para modificar a extrusora da bomba de seringa para seringas de plástico são fornecidos em Arquivos suplementares 1-3.</li>
	<li>Instale e abra o software da impressora 3D (consulte Tabela de Materiais) em um computador. Conecte a impressora 3D ao computador.</li>
	<li>Coloque uma seringa descartável de 1 mL com uma agulha de tamanho adequado nas pinças impressas em 3D alinhando as metades superior e inferior do mecanismo (Figura 1). Fixe as abraçadeiras ao redor da seringa usando três parafusos de soquete M8 e porcas hexadecimais finas de aço (consulte a Tabela de Materiais). O êmbolo da seringa conecta-se com o parafuso de chumbo na extrusora da bomba de seringa. Levante manualmente o êmbolo girando o parafuso de chumbo para criar uma folga de 0,5 mL de ar na seringa.</li>
	<li>Se a contaminação for uma preocupação para o experimento, transporte o complexo seringa-pinça para um biohood e esterilize com spray de etanol 70% na entrada antes de completar as etapas seguintes.</li>
</ol>2. Preparação da suspensão bacteriana
<ol><li>Para V. cholerae e E. coli, crescer durante a noite em uma placa de ágar Lennox LB (Caldo de Luria, ver Tabela de Materiais) a 37 °C.<ol><li>Para V. cholerae, inocular as células em 3 mL de LB líquido com dez esferas de vidro estéreis. Cultivar as células em uma incubadora de agitação a 37 °C por 5-6 h até a fase exponencial média para uma densidade óptica (OD) 600 de ~0,9.</li>
		<li>Para E. coli, inocular as células em 3 mL de LB líquido. Inocular 200 μL da cultura noturna em LB fresco por 3 h até que o DO atinja 0,6.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir a cultura para um tubo de centrífuga de 10 mL. Centrifugar a cultura por 5 min a 5.000 x g à temperatura ambiente para formar um pellet. Remova o sobrenadante. Ressuspender com ~10 μL de LB líquido para atingir uma densidade celular de ~9 x 1010 células por mL.</li>
</ol>3. Carregar a suspensão bacteriana na seringa
NOTA: São fornecidos dois métodos para carregar as bactérias na seringa (passo 3.1 e passo 3.2). O passo 3.1 trabalha para carregar pequenos volumes de suspensões bacterianas, <200 μL, e o passo 3.2 trabalha para carregar volumes maiores de suspensões bacterianas, >200 μL. A etapa 3.1 foi utilizada para os resultados representativos aqui apresentados.
<ol><li>Coloque uma seringa Luer lock de plástico vazia de 1 mL na bioimpressora 3D. Conecte o êmbolo da seringa com o parafuso de chumbo. Retrair manualmente a seringa para adicionar 0,2 mL da folga de ar para fornecer espaço para o êmbolo se mover na seringa, pois um pequeno volume de células ~20-50 μL são usados para cada lote de experimentos.<ol><li>Fixe uma agulha romba à ponta da seringa com o tamanho da agulha necessário para o tamanho das características de impressão necessárias. Aqui, uma agulha de 2 polegadas 20 G é usada.</li>
		<li>Coloque a suspensão bacteriana na seringa colocando um tubo de centrífuga de 10 mL com o inóculo bacteriano abaixo da agulha. Gire manualmente o parafuso para retrair o êmbolo da seringa e carregar as células na seringa. Os volumes de células bacterianas são tão pequenos que, muitas vezes, as células são apenas carregadas na agulha.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire o êmbolo do complexo seringa-pinça e use outra seringa e agulha para carregar cuidadosamente o complexo seringa-pinça com as suspensões bacterianas desejadas, tomando cuidado para evitar o aprisionamento de bolhas de ar. O complexo seringa-pinça deve ser preenchido ligeiramente sobre a borda com a suspensão bacteriana desejada e, em seguida, transferido para a bioimpressora.<ol><li>Introduza cuidadosamente o complexo seringa-pinça sem o êmbolo no soquete correspondente no núcleo principal da extrusora da bioimpressora.</li>
		<li>Certifique-se de que o carro da impressora esteja aproximadamente na metade do parafuso de chumbo e que uma placa de coleta esteja presente sob a seringa carregada. Em seguida, insira cuidadosamente o êmbolo através do carrinho e do complexo seringa-pinça até que ele pegue no carrinho. Deprima o êmbolo lentamente na suspensão bacteriana para evitar o aprisionamento de bolhas de ar na seringa.</li>
		<li>Deslize a fixação do adaptador sobre o carro sobre a parte de trás do êmbolo para prendê-lo no lugar para manobras de extrusão e retração.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Calibração da etapa da extrusora para o volume depositado
<ol><li>Para calibrar a etapa da extrusora (E-step) para o volume depositado, primeiro configure a bioimpressora com a seringa, a agulha da seringa e a suspensão bacteriana de depósito que serão utilizadas no experimento. Aqui, uma seringa Luer lock de 1 mL é usada.</li>
	<li>Determine um intervalo estimado de passo E para calibrar extrudindo um número arbitrário de passo E (~200) e observe a mudança de volume do êmbolo com marcadores de volume de seringa.</li>
	<li>Use esta relação E-passo grosso/volume para determinar as configurações do E-step para executar a varredura de calibração. Por exemplo, se um passo E de 200 extrusa aproximadamente 20 μL por inspeção visual e se deseja depositar 10-200 μL, teste os passos E entre 100-2000.</li>
	<li>Para realizar a varredura de calibração linear, primeiro rotule e meça a massa seca de vinte tubos de coleta de 1,5 mL em uma balança analítica com sensibilidade de 0,1 mg.</li>
	<li>Extruda a suspensão bacteriana nos tubos de 1,5 mL pré-medidos. Para cada etapa E, execute pelo menos 2 repetições. Repita para todos os passos E ao longo da faixa linear, substituindo a suspensão bacteriana conforme necessário. Se a contaminação for uma preocupação para o experimento, limpe o exterior da agulha da seringa com um lenço sem fiapos saturado com etanol 70% após cada amostra.</li>
	<li>Medir a massa de todos os tubos de 1,5 mL com a mesma balança analítica. Subtrair o primeiro valor de massa do segundo para obter uma massa líquida de suspensão bacteriana depositada.</li>
	<li>Converta a massa da suspensão bacteriana em um volume com a densidade do material. Para muitas suspensões bacterianas compostas principalmente de água, 1 g/mL é uma aproximação de densidade apropriada.</li>
	<li>Execute um ajuste linear entre o passo E e o volume extrudado para concluir o processo de calibração.</li>
</ol>5. Preparação da matriz de hidrogel granular
<ol><li>Em um gabinete de biossegurança, adicionar grânulos secos de copolímeros de ácido acrílico/acrilato de alquila reticulados (ver Tabela de Materiais) a 400 mL de Lennox Luria-Bertani (LB) a 2% para manter a matriz estéril; no entanto, outros meios líquidos de cultura de células também podem ser usados para inchar a matriz de hidrogel. NOTA: A porcentagem em peso de grânulos adicionados ao LB depende do tamanho dos poros que se almeja. No presente estudo, para uma matriz de hidrogel granular a 0,9%, 3,6 g de grânulos secos são adicionados ao LB e para uma matriz de hidrogel granular a 1,2%, 4,8 g de grânulos secos são adicionados ao LB. Os grânulos de hidrogel são homogeneamente dispersos misturando-os em um misturador de bancada por 2 min.</li>
	<li>Uma vez misturado, ajuste o pH para 7,4 adicionando incrementos de 20 a 500 μL de hidróxido de sódio (NaOH) 10 M para garantir a viabilidade celular. Após cada adição de NaOH, meça o pH mergulhando uma ponta de pipeta na mistura e, em seguida, limpando a matriz de hidrogel em um papel de teste de pH. NOTA: À medida que o NaOH é adicionado, a viscosidade da mistura aumentará à medida que os grânulos de hidrogel começarem a inchar. Os grânulos de hidrogel inchados têm ~5 μm a 10 μm de diâmetro e estão amontoados em uma matriz de hidrogel. A malha interna dos grânulos é de ~40 nm a 100 nm, conforme previamente estabelecido32. O tamanho da malha é grande o suficiente para que moléculas pequenas (por exemplo, oxigênio e nutrientes) se difundam livremente, mas pequenas o suficiente para que as bactérias fiquem confinadas entre os poros intersticiais.</li>
	<li>Em seguida, transfira a matriz de hidrogel granular para um tubo centrífugo de 50 mL usando uma seringa plástica estéril de 50 mL. Centrifugar a matriz de hidrogel a 161 x g por 1 min à temperatura ambiente para remover as bolhas formadas durante o processo de mistura.</li>
	<li>Deixe a matriz de hidrogel descansar por pelo menos 2 dias à temperatura ambiente para garantir que não tenha ocorrido contaminação. A contaminação aparece como microcolônias suspensas na matriz de hidrogel. Após dois dias, centrifugar a matriz de hidrogel a 161 x g por 1 min para remover quaisquer bolhas adicionais que se formem. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a matriz de hidrogel à temperatura ambiente por até uma semana.</li>
	<li>Na cabine de biossegurança, utilizando uma seringa plástica estéril de 30 mL, transfira a quantidade desejada de matriz hidrogel para o recipiente onde ocorrerá a impressão (aqui foram utilizados ~20 mL para um frasco de cultura de tecidos de 20 mL ou 1 mL para micro cubetas plásticas de 1 mL).</li>
</ol>6. Caracterização das propriedades reológicas da matriz de hidrogel granular
<ol><li>Coloque ~3 mL da matriz de hidrogel em um reômetro de cisalhamento (ver Tabela de Materiais) com um intervalo de 1 mm entre placas paralelas rugosas de 50 mm de diâmetro para medir as propriedades reológicas.</li>
	<li>Quantifique o comportamento do escoamento usando medidas de cisalhamento unidirecionais no reômetro de cisalhamento medindo a tensão de cisalhamento em função de uma varredura logarítmica da taxa de cisalhamento de 10-4 s-1 a 102 s-1 (por exemplo, Figura 2A). NOTA: Em baixas taxas de cisalhamento, a matriz de hidrogel terá uma tensão de cisalhamento constante (a tensão de escoamento) que é independente da taxa de cisalhamento. Em altas taxas de cisalhamento, a tensão de cisalhamento aumentará com uma dependência da lei de potência da taxa de cisalhamento, indicando a fluidização da matriz de hidrogel. Esse comportamento de estresse de rendimento permite que as bactérias sejam impressas em 3D dentro da matriz granular de hidrogel29.</li>
	<li>Medir os módulos de armazenamento e perda, G' e G'', respectivamente, em função da frequência, utilizando reologia oscilatória de pequena amplitude com amplitude de deformação de 1% e frequências entre 0,1 a 1 Hz (por exemplo, Figura 2B). NOTA: A matriz de hidrogel granular ideal para impressão 3D deve ter um módulo de armazenamento maior que o módulo de perda, o que indica que o meio atua como um sólido elástico emperrado29.</li>
</ol>7. Caracterização do tamanho dos poros intersticiais da matriz de hidrogel granular
<ol><li>Sonicate 100 nm nanopartículas fluorescentes de poliestireno carboxilado (~3,6 x10 13 partículas/mL, ver Tabela de Materiais) em sua embalagem por 15 min para ressuspender para quebrar quaisquer agregações/aglomerados de partículas. Transfira 50 μL de nanopartículas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.<ol><li>Centrifugar por 10 min a 9.500 x g à temperatura ambiente até que o pellet se forme e o sobrenadante esteja límpido. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL do meio de cultura líquido (aqui LB) utilizado para preparar a matriz de hidrogel granular. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui armazenando as nanopartículas ressuspensas a 4 °C por até 3 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar as nanopartículas ressuspensas por 30 min. Transferir 1 mL de matriz granular de hidrogel para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL das nanopartículas ressuspensas à matriz granular de hidrogel e misturá-las com uma ponta de pipeta. Após a mistura, centrifugar por 30 s a 161 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira a matriz de hidrogel e a mistura de nanopartículas para uma placa de Petri de 35 mm de diâmetro com um poço de fundo de vidro de 0,1 mm de espessura. O poço tem 20 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade. Coloque uma tampa de vidro por cima e pressione para baixo para desativar o fluxo e a evaporação durante a imagem. Uma alternativa à tampa de vidro é adicionar 1 mL de óleo de parafina na parte superior.</li>
	<li>Obtenha imagens das nanopartículas usando um microscópio confocal com uma objetiva de óleo de 40x com zoom adicional de 8x no software de imagem (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Um objetivo de ampliação mais alto poderia ser usado em vez de usar zoom digital adicional no software.<ol><li>Imagem de um loop temporal sem atraso (idealmente ~19 quadros/s) em um único plano z por 2 minutos com pelo menos quatro nanopartículas dentro do campo de visão. Repita de 15 a 20 vezes em locais diferentes para coletar dados suficientes para estatísticas (100 a 200 nanopartículas).</li>
	</ol></li>
	<li>Use um software de rastreamento de partículas para analisar o deslocamento das partículas. Aqui, um script personalizado é usado com base no algoritmo clássico de Crocker-Grier para rastrear o centro de massa da nanopartícula35 (veja Arquivo Suplementar 7).<ol><li>A partir do rastreamento de partículas, calcule o deslocamento quadrático médio (MSD). O MSD exibirá difusão livre no espaço de poros em curtos comprimentos e escalas de tempo e transição para escalonamento subdifusivo em grandes comprimentos e escalas de tempo devido ao confinamento35.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique a escala de comprimento onde ocorre a transição para a escala subdifusiva para estimar o tamanho dos poros locais. Calcule o tamanho dos poros adicionando esta escala de comprimento ao diâmetro das nanopartículas. Repita a análise do tamanho dos poros para cada nanopartícula medida. Isso produzirá uma distribuição de tamanho de poro a partir da qual um tamanho médio de poro pode ser calculado (por exemplo, Figura 3).</li>
</ol>8. 3D processo de impressão
<ol><li>Suportes personalizados para impressão 3D para os recipientes de amostra (consulte Arquivos Suplementares 4-6 para os arquivos CAD). Aqui, são utilizados suportes para frascos de cultura de tecidos e microcubetas. Os suportes permitem programar a impressora para imprimir várias amostras em uma única sessão de impressão. Coloque os recipientes de amostra com meio hidrogel nos suportes na plataforma de construção.</li>
	<li>Abra o software de impressão 3D. Carregue um código g pré-programado no software. Para obter os resultados representativos, a etapa 3.1 é usada para carregar a suspensão bacteriana na impressora 3D. NOTA: Um exemplo de um código g para imprimir geometrias verticais lineares é dado na Tabela 1.</li>
	<li>Através do software de impressão 3D, mova os planos x-y-z para centralizar a cabeça de impressão no plano x-y para ser o primeiro recipiente e, em seguida, para abrigar o eixo z. O eixo z do homing levantará a cabeça de impressão. Gire manualmente o parafuso lentamente para deprimir o êmbolo da seringa até que uma pequena quantidade da suspensão bacteriana possa ser vista na ponta da agulha.<ol><li>Limpe levemente o excesso de suspensão bacteriana com um lenço descartável estéril. Com base na altura do porta-amostras, da agulha e da seringa, usando o software de impressão 3D, abaixe a cabeça de impressão a uma distância fixa no meio de hidrogel no recipiente de amostra de escolha. Inicie o processo de impressão clicando em Imprimir.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando a impressão estiver concluída, feche os recipientes de amostra. Limpe a impressora com etanol 70%. Descarte corretamente a seringa e a agulha.</li>
</ol>9. Crescimento e obtenção de imagens da V. cholerae
<ol><li>Para imagens de campo de visão grande, use uma câmera com um acessório de lente de zoom para o crescimento da célula de imagem com uma caixa de luz. Fotografe as amostras logo após a impressão à temperatura ambiente e, em seguida, transfira-as para uma incubadora. Manter as amostras a 37 °C em uma incubadora estacionária entre as sessões de imagem durante o experimento.</li>
	<li>Capturar imagens durante um período de tempo desejado para observar o comportamento de crescimento em longos períodos na matriz granular de hidrogel.</li>
</ol>

Bioimpressão de bactérias em matrizes de hidrogel para o estudo da motilidade e crescimento

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<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+approach+for+3D+bacterial+printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward approach for 3D bacterial printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
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</ol>

A plataforma experimental usada para imprimir e fotografar comunidades bacterianas em 3D nesta publicação é objeto de um pedido de patente depositado pela Universidade de Princeton em nome de Tapomoy Bhattacharjee e S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).

Etapas críticas do protocolo É importante garantir que, ao preparar cada matriz de hidrogel, a matriz seja feita em um ambiente estéril. Caso contrário, pode ocorrer contaminação, que se manifesta como, por exemplo, microcolônias (pequenos esferoides) na matriz após vários dias. Durante o processo de mistura, é importante que todas as partículas de hidrogel granular seco sejam dissolvidas. Além disso, ao ajustar o pH de cada matriz de hidrogel com o NaOH, os grânulos começarão a inchar, o que aumenta a viscosidade da matriz de hidrogel, tornando a mistura mais difícil. O uso do misturador de suporte ajudará a garantir que o NaOH seja bem misturado à matriz de hidrogel. Durante o carregamento de cada suspensão bacteriana, bolsas de ar podem se formar na agulha. Para evitar esse problema, certifique-se de que a ponta da agulha esteja sempre sentada na suspensão bacteriana no tubo da centrífuga e não na parte inferior do tubo ou perto da superfície superior. Outra forma de superar essa questão é cultivar grandes volumes de células e, assim, ter volumes maiores da suspensão bacteriana para impressão.
Limitações Atualmente, durante a impressão, a baixa viscosidade da suspensão bacteriana limita as geometrias que podem ser impressas e muitas vezes leva à formação de biofilme e crescimento no topo da superfície da matriz de hidrogel devido a células-traço. Existem alguns métodos potenciais para superar essa limitação, incluindo aumentar a viscosidade da suspensão bacteriana ou otimizar ainda mais as configurações da impressora 3D. Para aumentar a viscosidade da suspensão bacteriana, pode-se misturar a suspensão bacteriana com outro polímero - por exemplo, o alginato, que já foi usado anteriormente para a impressão 3D de bactérias em superfícies planas38. As configurações da impressora podem ser otimizadas para permitir a retração do êmbolo da seringa durante a retirada da agulha da matriz granular de hidrogel, o que teria o potencial de impedir que as células fossem depositadas durante a remoção da agulha da matriz de hidrogel.
A importância do método em relação aos métodos existentes/alternativos O método aqui descrito permite a impressão de colônias bacterianas em matrizes granulares de hidrogel. As matrizes granulares de hidrogel permitem o estudo do impacto de fatores ambientais externos (por exemplo, tamanho dos poros, deformabilidade da matriz) sobre a motilidade e o crescimento de bactérias. Além disso, enquanto neste trabalho, LB é usado como meio de crescimento líquido para inchar a matriz de hidrogel, a matriz de hidrogel pode ser inchada com outros meios de crescimento líquidos, incluindo meios com antibióticos. Métodos prévios para o estudo de bactérias em ambientes confinados eram limitados pelo tempo de experimentação, pelo tamanho da malha polimérica e pela rigidez da matriz de hidrogel circundante37,38. Já existem protocolos para a confecção de matrizes granulares de hidrogel a partir de diferentes polímeros, de modo que o potencial para estudar os impactos de diferentes condições ambientais sobre a motilidade e o crescimento de bactérias é vasto. Este método permite o estudo de bactérias em ambientes de controle que mais facilmente recapitulam os ambientes que as bactérias habitam no mundo real, como o muco do hospedeiro ou o solo. Outra limitação de muitos outros métodos é a opacidade da matriz circundante; no entanto, essa abordagem usando materiais opticamente transparentes fornece a capacidade de explorar, por exemplo, o controle optogenético e o padrão de bactérias em 3D.
Além de estudar a motilidade e o crescimento, o método de impressão 3D descrito aqui supera a limitação de muitos outros métodos de bioimpressão que exigem a deposição de uma biotinta em um substrato e, portanto, são limitados na altura do material vivo projetado que podem produzir. No futuro, este protocolo de bioimpressão pode ser expandido para fabricar materiais biohíbridos misturando polímeros com células formadoras de biofilme. As matrizes de hidrogel granulares fornecem suporte para impressão 3D de materiais vivos mais espessos e em maior escala e geometrias mais complexas do que muitos outros métodos atuais de bioimpressão de bactérias. Enquanto este trabalho utilizou apenas V. cholerae e E. coli, outras espécies, como Pseudomonas aeruginosa, também foram impressas com sucessoem 3D 37. Além da impressão, a impressora pode ser adaptada para fazer uma amostragem controlada de bactérias após o crescimento para ver se houve alguma alteração genética, por exemplo.

As bactérias frequentemente habitam diversos e complexos ambientes porosos 3D, desde géis mucosos no intestino e pulmões até solo no solo 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. Nesses cenários, o movimento bacteriano através da motilidade ou crescimento pode ser impedido por obstáculos circundantes, como redes poliméricas ou embalagens de grãos minerais sólidos, influenciando a capacidade das células de se espalhar por seus ambientes26, acessar fontes de nutrientes, colonizar novos terrenos e formar comunidades protetoras de biofilme27. No entanto, estudos de laboratório tradicionais normalmente empregam geometrias altamente simplificadas, com foco em células em culturas líquidas ou em superfícies planas. Embora essas abordagens produzam insights importantes sobre a microbiologia, elas não recapitulam totalmente a complexidade dos habitats naturais, levando a diferenças dramáticas nas taxas de crescimento e no comportamento da motilidade em comparação com medições realizadas em ambientes do mundo real. Portanto, um método para definir colônias bacterianas e estudar sua motilidade e crescimento em ambientes porosos 3D mais semelhantes a muitos de seus habitats naturais é extremamente necessário.
Inocular células em gel de ágar e, em seguida, visualizar sua disseminação macroscópica por olho ou usando uma câmera fornece uma maneira simples de conseguir isso, como proposto pela primeira vez por Tittsler e Sandholzer em 193628. No entanto, essa abordagem sofre de uma série de desafios técnicos importantes: (1) Embora os tamanhos dos poros possam, em princípio, ser variados variando a concentração de agarose, a estrutura dos poros de tais géis é mal definida; (2) O espalhamento de luz faz com que esses géis sejam turvos, dificultando a visualização de células em escala individual com alta resolução e fidelidade, particularmente em grandes amostras; (3) Quando a concentração de ágar é muito grande, a migração celular é restrita à superfície plana superior do gel; (4) A complexa reologia desses géis torna desafiadora a introdução de inóculos com geometrias bem definidas.
Para resolver essas limitações, em trabalhos anteriores, o laboratório de Datta desenvolveu uma abordagem alternativa usando matrizes granulares de hidrogel - compostas por partículas de hidrogel biocompatíveis inchadas em cultura bacteriana líquida - como "placas de Petri porosas" para confinar células em 3D. Essas matrizes são sólidas macias, auto-reparáveis, de tensão de escoamento; assim, ao contrário dos géis reticulados usados em outros processos de bioimpressão, um microbocal de injeção pode mover-se livremente dentro da matriz ao longo de qualquer caminho 3D prescrito, reorganizando localmente as partículas de hidrogel29. Essas partículas então se redensificam rapidamente e se auto-curam ao redor das bactérias injetadas, apoiando as células no lugar sem qualquer processamento prejudicial adicional. Este processo é, portanto, uma forma de impressão 3D que permite que as células bacterianas sejam dispostas - em uma estrutura 3D desejada, com uma composição de comunidade definida - dentro de uma matriz porosa com propriedades físico-químicas ajustáveis. Além disso, as matrizes de hidrogel são completamente transparentes, permitindo que as células sejam visualizadas diretamente por imagem.
A utilidade dessa abordagem foi demonstrada anteriormente de duas maneiras. Em um conjunto de estudos, células diluídas foram dispersas por toda a matriz hidrogel, o que possibilitou estudos da motilidade de bactérias individuais30,31. Em outro conjunto de estudos, comunidades multicelulares foram impressas em 3D em géis em escala centimétrica usando um bico injetor montado em um palco de microscópio programável, o que possibilitou estudos da disseminação de coletivos bacterianos em seu entorno32,33. Em ambos os casos, esses estudos revelaram diferenças até então desconhecidas nas características de disseminação de bactérias que habitam ambientes porosos em comparação com aquelas em cultura líquida/em superfícies planas. No entanto, por terem sido montados em um estágio de microscópio, esses estudos anteriores foram limitados a pequenos volumes de amostra (~1 mL) e, portanto, a escalas de tempo experimentais curtas. Eles também foram limitados em sua capacidade de definir geometrias de inóculos com alta resolução espacial.
Aqui, a próxima geração desta plataforma experimental que aborda ambas as limitações é descrita. Especificamente, são fornecidos protocolos pelos quais se pode usar uma impressora 3D modificada com uma extrusora de seringa acoplada à impressão 3D e imagem de colônias bacterianas em grandes escalas. Além disso, dados representativos indicam como esta abordagem pode ser útil para estudar a motilidade e o crescimento de bactérias, usando o biofilme Vibrio cholerae e a Escherichia coli planctônica como exemplos. Essa abordagem permite que as colônias bacterianas sejam sustentadas por longos tempos e visualizadas usando várias técnicas de imagem. Assim, a capacidade dessa abordagem de estudar comunidades bacterianas em habitats porosos 3D tem um enorme potencial de pesquisa e aplicação, impactando o tratamento e o estudo de micróbios no intestino, na pele, no pulmão e no solo. Além disso, essa abordagem pode ser usada no futuro para impressão 3D de materiais vivos projetados à base de bactérias em formas independentes mais complexas.

<table><tbody><tr><td>Cuvetes de 1 mL</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer lock de 1 mL</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>100 nm nanopartículas de poliestireno fluorescente carboxilado (FluoSpheres)&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)</td><td> F8803</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-237</td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba de 20 G</td><td>McMaster Carr</td><td>75165A252</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos de 25 mL</td><td>VWR</td><td>10861-566</td><td></td></tr><tr><td>Impressora 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot Mini 2</td><td></td></tr><tr><td>Software de impressão 3D</td><td>Cura</td> Tubos de centrífuga <td>Cura-Lulzbot</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-955-239</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Carbomer Partículas de Hidrogel Granular</td><td>Lubrizol&nbsp;</td><td>Carbopol 980NF</td><td>grânulos secos de copolímeros de ácido acrílico/acrilato de alquila reticulados</td></tr><tr><td>Centrífuga (capacidade do tubo de 2 mL)</td><td>Centrífuga VWR</td><td>2405-37</td><td></td></tr><tr><td>(capacidade do tubo de 50 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75007200</td><td>Sorvall (marca) ST 8 (modelo)</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>A1R+ microscópio confocal invertido Fundo</td><td></td></tr><tr><td>de vidro placa de Petri</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB (Caldo Lubria)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>M8 &vezes; 1,25 mm, 150 mm de comprimento, Tampa de Soquete Totalmente Rosqueada</td><td>McMaster Carr</td><td>91290A478</td><td></td></tr><tr><td>M8 &vezes; 1,25 mm, Porca Sextavada Fina de Latão</td><td>McMaster Carr</td><td>93187A300</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa de código aberto</td><td>Replistruder</td> <td>feito sob medida</td> 4 <td>https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791</td></tr><tr><td>placa de Petri (60 mm redonda)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Shear Rheometer</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 501</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassónico</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr></tbody></table>

bactérias da impressão 3d para estudo da motilidade e crescimento em meios porosos 3d complexos

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

As bactérias são ubíquas em ambientes porosos tridimensionais complexos (3D), como tecidos biológicos e géis, solos subsuperficiais e sedimentos. No entanto, a maioria dos trabalhos anteriores tem se concentrado em estudos de células em líquidos a granel ou em superfícies planas, que não recapitulam totalmente a complexidade de muitos habitats bacterianos naturais. Aqui, essa lacuna no conhecimento é abordada descrevendo o desenvolvimento de um método para imprimir colônias densas de bactérias em 3D em matrizes de hidrogel granulares emperradas. Essas matrizes possuem tamanhos de poros ajustáveis e propriedades mecânicas; eles confinam fisicamente as células, suportando-as em 3D. Eles são opticamente transparentes, permitindo a visualização direta da disseminação bacteriana através de seus arredores usando imagens de imagem. Como prova desse princípio, aqui, a capacidade deste protocolo é demonstrada pela impressão 3D e imageamento de Vibro cholerae não móveis e móveis, bem como Escherichia coli não móvel, em matrizes granulares de hidrogel emperradas com tamanhos variados de poros intersticiais.

Este protocolo descreve um procedimento para impressão tridimensional (3D) de colônias bacterianas para estudar sua motilidade e crescimento em matrizes complexas de hidrogel poroso 3D que são mais semelhantes aos seus habitats naturais do que culturas líquidas convencionais ou placas de Petri.

Bactérias da Impressão 3D para Estudo da Motilidade e Crescimento em Meios Porosos 3D Complexos

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

As bactérias são ubíquas em ambientes complexos, tridimensionais e porosos, como tecidos biológicos e géis, solos e sedimentos subsuperficiais. Aqui desenvolvemos um método para imprimir em 3D colônias densas de bactérias em matrizes granulares de hidrogel para estudar seu crescimento e motilidade em ambientes complexos. Estudos têm revelado diferenças até então desconhecidas nas características de disseminação de bactérias que habitam ambientes porosos em comparação com aquelas em culturas líquidas em superfícies planas.O desenvolvimento do uso de matrizes granulares de hidrogel compostas por partículas de hidrogel biocompatíveis emperradas inchadas em cultura bacteriana líquida como placas de Petri porosas para confinar células em 3D. Estudos anteriores foram limitados a pequenos volumes de amostra em torno de um ml e, portanto, escalas de tempo experimentais curtas, e também foram limitados em sua capacidade de definir geometrias de inóculos com alta resolução espacial. Estabelecemos que as características de propagação celular das bactérias dependem do tamanho dos poros e da motilidade da célula.

3d-printing-bacteria-to-study-motility-growth-complex-3d-porous

Research

JoVE Journal

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