Name: Efeito antagônico de Jiawei Shengjiang San em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Explore a farmacologia de rede e o docking molecular para investigar o mecanismo do Jiawei Shengjiang San na nefropatia diabética em ratos. Este método revela componentes ativos e alvos terapêuticos com eficiência superior.

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<meta charset="utf8"></head><body>Jiawei Shengjiang San abordará a nefropatia diabética usando farmacologia de rede

<table><tbody><tr><td>2 vezes; SYBR Green qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Servicebio, Wuhan, China</td><td>G3320-05</td><td></td></tr><tr><td>Quantificação de proteína urinária de 24 horas (UTP)</td><td>Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina</td><td>Shanghai Huzheng Biotech, China</td><td>91-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de análise bioquímica automática</td><td>Hitachi, Japão</td><td>7170A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Biosharp, Tianjin, China</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BAX Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, USA</td><td>AF0120</td><td>Rat</td></tr><tr><td>BCL-2 Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, USA</td><td>AF6139</td><td>Rat</td></tr><tr><td>BX53 microscópio</td><td>Olympus, Japão</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de clorofórmio</td><td>ECOTOP, Guangzhou, China</td><td>ES-8522</td><td></td></tr><tr><td>Software Desmond&nbsp;</td><td>Nova York, NY, EUA</td><td>Lançamento 2019-1</td><td></td></tr><tr><td>Banho de Água Digital de Temperatura Constante</td><td>Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China</td><td>DK-8D</td><td></td></tr><tr><td>EGFR Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, EUA</td><td>AF6043</td><td>Rat</td></tr><tr><td>Embed-812 RESIN</td><td>Shell Chemical, EUA</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Glicemia de jejum (FBG)</td><td>Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FC-type full-wavelength enzyme label analyser</td><td>Multiskan; Thermo, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH&nbsp; Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, EUA</td><td>AF7021</td><td></td></tr><tr><td>Proteína sérica glicada de rato (GSP)</td><td>Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>Hitachi, Japão</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de hematoxilina/eosina (HE)</td><td>Servicebio, EUA</td><td>G1003</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus</td><td>MEDIA CYBERNETICS, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de Amplificação de PCR em Tempo Real</td><td>Applied Biosystems, EUA</td><td>iQ5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de irbesartan</td><td>Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Biosharp, Tianjin, China</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Grânulos JWSJS</td><td>Guangdong Yifang Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Image Station 2000 MM imaging system</td><td>Kodak, USA</td><td>IS2000</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol de baixa densidade (LDL-C)</td><td>Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MAPK3/1Primary antibodies&nbsp;</td><td>Affinity, EUA</td><td>AF0155</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Médica para Ratos</td><td>Hunan Xiangyi Desenvolvimento de Instrumentos de Laboratório, China&nbsp;</td><td>TGL-16K</td><td></td></tr><tr><td>Mini sistema de transferência trans-blot</td><td>Bio-Rad, EUA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad, EUA</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoVue Plus</td><td>Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia</td><td>111765</td><td></td></tr><tr><td>p-EGFR Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, USA</td><td>AF3044</td><td>Rat</td></tr><tr><td>Ácido periódico-Schiff (PAS) solução de coloração</td><td>Servicebio, USA</td><td>G1008</td><td></td></tr><tr><td>p-MAPK3/1 Anticorpos primários&nbsp;</td><td>Affinity, USA</td><td>AF1015</td><td>Rat</td></tr><tr><td>Secondary anticorpos</td><td>&nbsp; Santa Cruz, EUA</td><td>sc-2357</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma, EUA</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>GeneCopeia, USA</td><td>QP056T</td><td></td></tr><tr><td>TriQuick Reagent</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>R1100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clean Workbench</td><td>Suzhou Purification Equipment, China</td><td>SW-CJ-1F&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

efeito antagônico de jiawei shengjiang san em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização egfr / mapk3 / 1

Antagonistic Effect of Jiawei Shengjiang San on a Rat Model of Diabetic Nephropathy: Related to EGFR/MAPK3/1 Signaling Pathway

Seguindo o protocolo, 90 ingredientes ativos de JWSJS foram finalmente obtidos a partir da análise após triagem e desduplicação de acordo com os padrões estabelecidos de OB e DL. Estes incluíram 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, quatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum e seis tipos de componentes de Bombyx Batryticatus . Como existem muitos ingredientes ativos no JWSJS, apenas 20 estão listados (consulte a Tabela 1). Após a desduplicação, 396 alvos correspondentes aos ingredientes ativos do JWSJS foram finalmente obtidos.
Depois de procurar genes relacionados a doenças, 3035 genes-alvo relacionados ao DN foram finalmente obtidos após fusão e desduplicação. Os alvos correspondentes de ND foram comparados e analisados com os alvos dos ingredientes ativos dos medicamentos. A interseção foi determinada, o que resultou em 227 alvos de interseção de JWSJS e DN. Um diagrama de Wayne foi então desenhado (ver Figura 1A). O diagrama de rede "medicamento-ingrediente-alvo" foi construído usando o software Cytoscape 3.8.0 (ver Figura 1B) e a análise topológica foi realizada. Cada nó foi classificado de alto a baixo de acordo com o valor do grau. Os cinco principais componentes do medicamento foram quercetina, ácido palmitoleico, luteolina, kaempferol e naringenina, e os cinco principais alvos foram PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR e ESR1.
Em seguida, foi desenvolvida uma rede PPI para alvos de interseção JWSJS e DN (196 nós e 1714 arestas com um valor médio de grau de 17,4). Além disso, sete alvos principais que podem ser os principais alvos do JWSJS para o tratamento de ND foram obtidos após três triagens: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 e MAPK1 (ver Figura 1C).
Em seguida, a análise de enriquecimento de GO foi realizada para especular sobre as características biológicas do alvo da JWSJS no tratamento da ND. Entre BP, CC e MF, as dez principais entradas enriquecidas são plotadas na Figura 1D. Os resultados mostram que o JWSJS pode regular a proliferação, diferenciação e apoptose celular ligando-se a fatores de transcrição e proteínas quinases em jangadas de membrana e microdomínios de membrana, resultando assim em um efeito terapêutico no DN. A análise de enriquecimento da via KEGG foi realizada nos alvos participantes para explorar as possíveis vias de ação do JWSJS no ND. As trinta principais vias enriquecidas são plotadas na Figura 1E. Os resultados mostram que o tratamento da ND por JWSJS pode atuar em 181 vias de sinalização, envolvendo principalmente lipídios e aterosclerose, a via de sinalização PI3K-Akt, carcinogênese química, hepatite, câncer de próstata, apoptose, a via de sinalização HIF-1 e a via de sinalização TNF.
Para explorar ainda mais os alvos das primeiras 30 vias enriquecidas com KEGG, usamos o software Cytoscape 3.8.0 para construir um mapa de rede de relacionamento de via de sinalização KEGG para DN tratado com JWSJS. MAPK1, MAPK3, EGFR e AKT1 foram considerados alvos de várias vias agindo juntas (ver Figura 1F), sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel central na mediação dos efeitos do JWSJS no DN.
Para validar ainda mais os alvos potenciais do JWSJS no tratamento de DN, em seguida, selecionamos três alvos principais, MAPK1, MAPK3 e EGFR, com altos valores de grau na rede PPI e na rede de vias de sinalização KEGG. Estes foram molecularmente acoplados com quercetina, ácido palmitoleico e luteolina - os três principais componentes dos núcleos do JWSJS para tratamento de ND. As condições para triagem de PDB ID são as seguintes: (1) Ser derivado de humanos; (2) Resolução conformacional ≤ 2,5Å, ou seja, o menor possível; (3) A sequência conformacional deve ser o mais completa possível, ou seja, o complexo estrutural deve ter informações de ligantes de moléculas pequenas; e (4) O valor do pH cristalino deve ser o mais próximo possível da faixa fisiológica normal do corpo humano35. Finalmente, os IDs PDB de MAPK1, MAPK3 e EGFR foram 4QTA, 4QTB e 7JXQ.
Para verificar a confiabilidade do software AutoDock para o sistema de acoplamento neste estudo36, primeiro reencaixamos as três proteínas de MAPK1, Mapk3 e EGFR. A conformação do ligante na estrutura cristalina original das três proteínas-alvo foi sobreposta aos ligantes após o acoplamento (Figura 2A). Os valores de desvio quadrático médio (RMSD) entre a conformação do ligante pós-acoplamento e a estrutura cristalina original foram então calculados. Os valores de RMSD foram 1,129, 1,201 e 1,877 Å, respectivamente, todos ≤ 2Å. Isso mostrou que o método de acoplamento era confiável e poderia ser usado para a próxima verificação de encaixe molecular. Para comparar e declarar o potencial inibitório dos componentes principais, os ligantes originais de MAPK1, MAPK3 e EGFR foram usados como controles. A análise de encaixe previu com sucesso a energia de ligação entre luteolina, ácido palmitoleico e quercetina e os três alvos principais. Todos foram negativos e inferiores a -637; ver Tabela 2. É importante notar que o acoplamento molecular entre a luteolina e a MAPK1 tem o maior tamanho de cavidade e a menor energia de ligação. No geral, os resultados do docking molecular mostraram que luteolina, ácido palmitoleico e quercetina tiveram boa atividade de ligação com três alvos principais ( Figura 2B , C ).
O RMSD é utilizado para quantificar as mudanças médias de deslocamento de um grupo selecionado de átomos em relação a um sistema de referência. Enquanto isso, o RMSF caracteriza efetivamente alterações localizadas ao longo da cadeia proteica. O gráfico RMSD (Figura 2D) mostra que os valores RMSD do complexo composto luteolina-MAPK1 e do complexo quercetina-MAPK3 se estabilizaram em 5 ns. O complexo luteolina-EGFR mostrou um RMSD flutuante variando de 0-35 ns; este valor estabilizou-se em 35 ns até o final da simulação de 100 ns MD. Todos os complexos interagiram de forma estável no final da simulação de 100 ns MD. O valor de RMSF foi avaliado a partir da trajetória de simulação de MD: Átomos no sítio ativo e na cadeia principal que flutuaram minimamente implicaram uma mudança conformacional mínima, sugerindo que o composto principal mencionado está firmemente ancorado dentro da cavidade da bolsa de ligação da proteína alvo. Os resultados do RMSF mostraram flutuações limitadas nas estruturas complexas.
Finalmente, verificamos os resultados acima in vivo. Observamos primeiro que o peso dos ratos no grupo modelo diminuiu significativamente, e GSP, LDL-C, UTP e FBG aumentaram significativamente (P &lt; 0,05). O peso corporal dos ratos aumentou significativamente no grupo do irbesartan e em cada grupo JWSJS em comparação com o grupo modelo. GSP, LDL-C, UTP e FBG diminuíram em diferentes graus (P &lt; 0,05; ver Tabela 3).
Em seguida, a coloração HE mostrou que os glomérulos do grupo normal tinham um tamanho normal. Eles eram regulares e claros em estrutura e tinham uma membrana basal lisa, túbulos renais bem organizados e nenhuma infiltração de células inflamatórias. No grupo modelo, os glomérulos estavam hipertróficos, a membrana basal estava espessada e a matriz mesangial estava aumentada. O interstício foi infiltrado com células inflamatórias. As manifestações patológicas de cada grupo de administração foram aliviadas em diferentes graus em comparação com o grupo modelo (ver Figura 3A).
A coloração PAS mostrou que o grupo modelo apresentou aumento dos volumes glomerulares, espessamento da membrana basal e aumento da matriz mesangial em comparação com o grupo normal. Essas manifestações patológicas foram significativamente aliviadas por cada grupo de administração (ver Figura 3B). Usando microscopia eletrônica de transmissão, descobrimos que a membrana basal glomerular no grupo modelo estava espessada em comparação com o grupo normal. A matriz mesangial cresceu e os processos do pé do podócito foram extensivamente fundidos. As manifestações microscópicas de ratos em cada grupo de administração foram aliviadas em graus variados em comparação com o grupo modelo (ver Figura 3C).
Finalmente, as expressões de EGFR total, p-EGFR, MAPK3 / 1 e p-MAPK3 / 1 foram detectadas para ver se elas mudaram em ratos DN tratados com JWSJS. Não houve alteração significativa na expressão total de EGFR e MAPK3/1 nos grupos modelo versus o grupo normal. A expressão de p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX aumentou significativamente, e a expressão de BCL-2 diminuiu significativamente. Em comparação com o grupo modelo, a expressão de p-EGFR, p-MAPK3 / 1 e BAX foi significativamente reduzida, e a expressão de BCL-2 foi significativamente regulada positivamente em graus variados em tecidos renais de ratos em cada grupo de dosagem ( Figura 3D , E ). Esse resultado foi confirmado por imuno-histoquímica (Figura 3F,G). Este estudo mostrou que o JWSJS pode proteger os rins em ratos com DN, regulando a expressão das proteínas p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 e reduzindo a apoptose celular. Além disso, qPCR foi utilizado para avaliar os níveis de expressão de mRNA de MAPK3, MAPK1 e EGFR em vários grupos. Os resultados revelaram que a expressão relativa no grupo ND foi significativamente maior em comparação com o grupo controle, bem como nos grupos Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M e JWSJS-H. Esse achado corrobora ainda mais os resultados iniciais (Figura 3H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig01.jpg"> Figura 1: A Farmacologia de Rede esclareceu os alvos potenciais do JWSJS e as vias de sinalização na nefropatia diabética. (A) Diagrama de Venn dos alvos de interseção do JWSJS e da nefropatia diabética. Verde representa o número de alvos terapêuticos dos componentes do JWSJS e roxo representa o número de alvos relevantes do DN. A parte de interseção representa o número de alvos de interseção (ou seja, o número de destinos do JWSJS para DN). (B) Diagrama de rede "medicamento-ingrediente-alvo" de JWSJS no tratamento de ND. O azul claro representa os alvos relevantes do JWSJS para o tratamento de ND. Fúcsia representa o ingrediente ativo de Bombyx Batryticatus. Verde representa os ingredientes ativos de Hedysarum Multijugum Maxim. O azul escuro representa os ingredientes ativos do Radix Rhei et Rhizome. O vermelho representa os ingredientes ativos da Cicadae Periostracum. O roxo representa os ingredientes ativos do Epimrdii Herba. O amarelo representa os ingredientes ativos do Smilacis Glabrae Rhixoma. O azul celeste representa os ingredientes ativos do Curcumaelongae Rhizoma. (C) Rede PPI de alvos de interseção JWSJS e DN. (D) Os 10 genes mais significativos identificados por meio da análise ontológica de genes-alvo de terapia implicados no tratamento de DN por JWSJS. (E) Os 30 genes mais significativos identificados por meio da análise de vias de genes-alvo de terapia implicados no tratamento de DN por JWSJS. (F) A rede de relacionamento da via de sinalização KEGG no tratamento de DN por JWSJS. Os ícones amarelos representam as vias de sinalização. Os ícones azuis representam alvos de ação. Um gráfico maior implica que mais caminhos estão conectados a ele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig02.jpg"> Figura 2: Docking molecular e visualização de trajetórias de dinâmica molecular de JWSJS no tratamento da nefropatia diabética. (A) As conformações do ligante na estrutura cristalina original dos três complexos de proteínas-alvo 7JXQ (a), 4QTA (b) e 4QTB (c) são comparadas com as conformações do ligante após o docking. Verde, laranja e rosa são proteínas-alvo EGFR, MAPK1 e MAPK3, respectivamente. O ouro é a molécula de ligante original e o azul é a molécula de ligante após o acoplamento. (B) Visualização de docking molecular 3D de JWSJS no tratamento de nefropatia diabética. Verde, laranja e rosa são as proteínas-alvo 7JXQ, 4QTA e 4QTB, respectivamente. 1a-3a representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA e 4QTB com o inibidor original (azul). 1b-3b representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina (amarelo). 1c-3c representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e ácido palmitoleico (fúcsia). 1d-3d representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina (roxo). (C) Visualização de docking molecular 2D de JWSJS no tratamento de nefropatia diabética. 1a-3a representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA e 4QTB com o inibidor original. 1b-3b representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina. 1c-3c representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e ácido palmitoleico. 1d-3d representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina. (D) Análise RMSD e RMSF das trajetórias dinâmicas moleculares de (a) luteolina e proteína alvo 7JXQ, (b) luteolina e proteína alvo 4QTA e (c) quercetina e proteína alvo 4QTB complexos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66179/66179fig03.jpg"> Figura 3: JWSJS alivia a lesão renal e suprime a ativação da via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1 em experimentos in vivo . (A) Coloração HE e (B) coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) de tecidos renais de ratos em diferentes grupos (Ampliação, 200x; n = 10). (C) Microscopia eletrônica de transmissão do tecido renal em diferentes grupos de ratos (Ampliação, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 em tecido renal de ratos diabéticos por western blotting (n = 3). (E) Análise estatística da expressão de p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2. (F) Análise imuno-histoquímica da expressão de p-EGFR E p-MAPK3/1 nos seis grupos (n = 6). (G) Análise estatística da expressão de p-EGFR E p-MAPK3/1. (H) análise de qPCR da expressão de mRNA de MAPK3, MAPK1 e EGFR em seis grupos. *P &lt; 0,05 vs. controle. **P &lt; 0,01 vs. controle. ▲P &lt; 0,05 vs. DN. ▲▲P &lt; 0,01 vs. DN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/66179fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Informações de alguns ingredientes ativos do JWSJS. Ele fornece detalhes sobre cada componente e suas características ou propriedades. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Tabela de resultados de encaixe dos principais alvos e principais ingredientes ativos do JWSJS. A tabela apresenta os resultados dos estudos de acoplamento dos principais alvos e principais componentes ativos do JWSJS. Esta tabela mostra como esses constituintes interagem com seus respectivos alvos, o que pode fornecer informações sobre o mecanismo de ação do JWSJS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Efeito da JWSJS no peso corporal e nos índices bioquímicos em ratos com nefropatia diabética (expresso como média ± desvio padrão, n = 10). Em comparação com o grupo normal: * P &lt; 0,05. Comparado com o grupo modelo: # P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66179/Table%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Efeito antagônico de Jiawei Shengjiang San em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1

We aimed to delve into the mechanisms underpinning Jiawei Shengjiang San's (JWSJS) action in treating diabetic nephropathy and deploying network ...

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