Name: Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: Aprenda a cultivar neurônios de bag cells de Aplysia californica para imagens de alta resolução de cones de crescimento. Este protocolo detalhado facilita estudos de motilidade e dinâmica do citoesqueleto em neurociência.

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Gostaríamos de agradecer Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) para filmar o nosso procedimento e Rodney McPhail (Departamento de Ciências Biológicas, Purdue University) para a assistência com a edição do vídeo de dissecação. Pesquisa no laboratório Suter é suportado por concessões do NIH (NS049233 R01) e do Centro de Biociências Bindley da Universidade Purdue, a DMS

Soluções <ul><li> L15-ASW meio de cultura celular (1l) <ul><li> 1 saco de pó L15 </li><li> adicionar 800 ml de H 2 O ultrapura </li><li> NaCl 400 mM </li><li> MgSO 4 27 mM </li><li> MgCl 2 28 mM </li><li> L-Glutamina 4mM </li><li> Gentamicina 50 mg / ml </li><li> HEPES 5 mM </li><li> Ajustar o pH 7,9 </li><li> Adicione gota a gota, CaCl 2 9,3 mM (parar se precipita) </li><li> Adicionar H 2 O ultrapura a 1 l </li><li> Verifique osmolaridade (950-1000 mmol / kg) com osmômetro (pressão de vapor Wescor, # 5520) </li><li> Filtro de 0,22 mM usando uma unidade de filtragem de pressão positiva (Filtros: SVGV010RS Millipore) </li><li> Armazenar a 4 ° C por até 1 mês </li></ul></li><li> Poli-L-lisina (70-150 kD) 200 mg / ml de solução estéril em H 2 O ultrapura mantida a -20 º C </li><li> 0,5 M MgCl 2 solução </li></ul> Dia 1: Dissecção da Aplysia gânglio abdominal Preparação da solução de dissociação enzimática <ol><li> Pesar 90-10 mg de Dispase enzima (Worthington, Cat: LS02111) em um tubo Eppendorf </li><li> Adicionar 900 mL de L15-ASW meio de cultura, e 100 l de H 2 O estéril ultrapura </li><li> Misture e coloque em temperatura ambiente (RT) </li></ol> Dissecção do gânglio abdominal <ol><li> Encha uma seringa de 50 ml com 0,5 M MgCl 2 solução. </li><li> Tome um animal do tanque, lidar com cuidado para evitar resposta animal de defesa de tinta. </li><li> Coloque o Aplysia do seu lado em uma placa de dissecção (isopor board), lado rostral para o lado, certo caudal para a esquerda. </li><li> Inserir a agulha no animal logo atrás da cabeça e injectar toda a solução MgCl 2 na cavidade do corpo. </li><li> Suavemente esfregue o animal para dispersar a solução de MgCl 2 em toda cavidade do corpo, aguarde alguns minutos para que o animal ser completamente anestesiado. </li><li> Pin a cabeça ea cauda do animal para o conselho de dissecação com duas agulhas. </li><li> Use uma pinça para tirar a pele, corte através da pele e da camada muscular com tesoura grande para a cabeça ea cauda para fazer uma grande abertura na lateral. </li><li> Encontrar o gânglio abdominal, sob o ovário escova-like. Use uma pinça para segurar os nervos conectando cerca de 1 cm à frente do gânglio abdominal, cortar os nervos com tesouras de dissecação em frente à posição de fórceps segurando e atrás do gânglio abdominal. </li><li> Gânglio lugar na solução Dispase e incubar por 15-16 horas a 22 ° C em banho-maria com temperatura controlada. </li></ol> Dia 2: Chapeamento de células saco Aplysia Preparando poli-lisina revestido lamínulas <ol><li> Em um banco de fluxo, preparar três pratos de petri 35 milímetros como trabalhar pratos para dissecção do gânglio, enchendo-os com 4 ml de meio L15-ASW cada. Transferir o gânglio abdominal a partir da solução dispase a um dos pratos úteis após 15,5 horas de digestão. </li><li> Utilizando uma pinça tomar ácido-limpos # 1.5 lamínulas (22x22 mm) armazenados em etanol, remover o álcool e esterilizar lamínulas por flaming-los brevemente em bico de Bunsen. Deixe-os esfriar antes de colocar brevemente as lamelas na placas de cultura. </li><li> Prepare uma ponta plating curvas, dobrando uma ponta amarela sobre o bico de Bunsen (chama apenas brevemente para evitar derretimento do plástico!). </li><li> Preparar a quantidade adequada de 20 mg / solução de poli-lisina ml, diluindo 200 mg / ml de solução estéril com H 2 O ultrapura. </li><li> Cobrir cada lamela com 500 mL de 20 mg / ml poli-lisina e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lave cada lamela 3-5 vezes com 500 mL estéreis H 2 O ultrapura cada. </li><li> Retirar a água de lamínulas; preencher cada prato com 4 ml de L15-ASW meio de cultura. </li></ol> Dissociação de células saco <ol><li> Sob um microscópio de dissecação, corte o gânglio abdominal em meia tesoura e pinça de dissecção utilizando previamente limpas com etanol a 95% (linha 1 Figura 1). </li><li> Em uma metade do gânglio, corte entre clusters saco célula e as células hemiganglion (linha 1 Figura 2), e cortar extensões nervosas remanescentes do outro lado do saco células (linha 1 Figura 3). Trabalhe em uma metade do gânglio de cada vez, deixe a outra metade no prato, enquanto as células do primeiro cluster estão sendo folheado. </li><li> Utilizando duas pinças (ou uma pinça e tesouras de dissecção), a liberação aglomerado de células saco, empurrando de lado a bainha de tecido conjuntivo ao redor do aglomerado de células saco. Cortar tecido conjuntivo com tesouras de dissecação, se necessário. Cuidado para não apertar e tocar o cluster de células saco muito durante este processo. </li><li> Quando a maioria do tecido conjuntivo é removido, a transferência do bag aglomerado de células em um prato novo a trabalhar com a ponta curvada amarelo preparado anteriormente. Tenha cuidado para não deixar que o cluster de células saco de ficar preso dentro da ponta amarela ou preso na interface ar / médio. </li><li> Triturar o cluster com ponta amarela para remover as células saco individual. Faça isso por pipetagem do cluster dentro e fora da ponta. Comece com baixa forças de cisalhamento e aumentar a força quando necessário. Sempre usar a menor força necessária para remover neurônios sem matar células demais. </li><li> Coletar 3-5 células saco saudável e transferi-los para um prato com uma lamela poli-lisina-revestido. Evitar a captação de células mortas (eles são preto / transparente no centro) e restos de tecido conjuntivo. </li><li> Repita a etapa 6. e coloque cerca de 15-25 neurônios vivem no centro de cada lamela. Se as células mortas ou detritos são transferidos, bem como, retirar o material indesejado por pegá-la ou assoar-lo longe das células saudáveis. Este processo leva cerca de 2-3 horas em ambos os clusters. </li><li> Uma vez terminado manter os pratos da cultura no banco de fluxo para pelo menos 2 horas em temperatura ambiente para permitir que as células attach (manter banco de fluxo blower off para evitar vibrações indesejadas). </li><li> Coloque os pratos em uma incubadora a 14 ° C durante a noite, ou até à sua utilização. Cones de crescimento pode se desenvolver em 10/04 horas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="Figura 1. Esquemática de Aplysia californica gânglio abdominal. Linhas de cor indicam onde cortar para obter grupos de células do saco." /> Figura 1. Esquemática de Aplysia californica gânglio abdominal. Linhas de cor indicam onde cortar para obter grupos de células do saco. Dia 3: Configurando câmara para imagens ao vivo de células saco Aplysia Montagem de imagens da câmara <ol><li> Antes de utilizar células saco para experimentos com imagens de células vivas, inspecionar as células em um microscópio de baixa potência. Se as células não se desenvolveram cones crescimento saudável, fonte de meio fresco e deixe em temperatura ambiente por 1-2 horas. </li><li> Para fornecer placas com o meio-L15 ASW fresco, remover metade (~ 2ml) de meio de idade, com uma linha de vácuo, e adicionar 2 ml de novos L15-ASW média por placa de Petri. É importante não remover completamente todos os suportes do prato de uma só vez, pois isso irá remover as células da lamela. </li><li> Para imagens de células saco, montamos duas lamínulas e dois espaçadores de plástico em uma câmara de imagem sanduíche-like. A lamela superior no sanduíche é cortar mais curto para permitir a troca fácil de médio e reagentes. Durante a montagem, lamínulas com células saco anexado deve ser submerso em L15-ASW médio em todos os momentos para impedir as células de desalojar. </li><li> Para preparar a câmara, cortado ~ 2 milímetros do lado direito de um milímetro lamínulas # 1 22x22 com diamante caneta (cortador de vidro) e régua. </li><li> Usando uma seringa de 1 ml, aplique graxa de alto vácuo para os dois lados da lamela mais curta, e anexar espaçadores de plástico para cada lado. Aplique graxa de vácuo para a parte superior de ambos os espaçadores. </li><li> Inverter a lamela e montagem espaçador, e coloque em placa de Petri contendo células saco em uma lamela. Alinhar e pressione suavemente para baixo para furar lamela cima para baixo com lamínula na extremidade oposta de dois Q-dicas. </li><li> Utilizando uma pinça, levantar delicadamente montagem sanduíche fora da placa de Petri sem o meio vazando. Alinhe as duas lamelas, se necessário, e retire o excesso com uma média Kimwipe. Coloque o sanduíche para a parte inferior do titular lâmina de microscópio e coloque a tampa com cuidado usando clipes. </li><li> Limpar o centro da parte superior do sanduíche com Q-dicas dabbed no limpador de vidros (Sparkle é usado como um limpador de vidro). Rapidamente secar o limpador de vidros com um segundo, seca Q-dica para evitar filas raia. Faça o mesmo para a lamela inferior. Lamínulas limpa livre de linhas de raia são importantes para geração de imagens de alta qualidade. </li></ol> Células bolsa no microscópio Uma vez que as culturas de células neuronais saco Aplysia estão em baixa densidade, é melhor se a sua configuração microscópio tem funções estágio posicionamento para facilitar a mudança entre as células. Células saco pode ser facilmente mantidos em temperatura ambiente por várias horas no palco durante as experiências de imagem. Troca do meio periodicamente para evitar a evaporação.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

Neurônios de células Aplysia fornecer um saco de soro livre de sistema de cultura de células neuronais, com muito poucas células não-neuronais. Estes neurônios formam cones de crescimento muito grande, adequado para tratar uma série de questões importantes células biológicas. Neurônios de células saco pode ser facilmente manipulado e fotografada em temperatura ambiente durante várias horas. Usando Microscopia fluorescente Speckle (FSM) pode-se analisar quantitativamente os vários parâmetros de F-actina e polimerização dos microtúbulos ea di...

<table><tbody><tr><td>Lâminas de vidro #1 22x22 mm</td><td>Ferramenta</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro #1,5 22x22 mm</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Ferramenta</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para filtração de meio</td><td>Ferramenta</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV010RS</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td>Ferramenta</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Ferramenta</td><td>Wescor</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Calços plásticos</td><td>Ferramenta</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SHSP-200</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4030</td><td></td></tr><tr><td>Meio L15</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>41300-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Reagente</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Reagente</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6070-12</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (70-150 kD)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Reagente</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581</td><td></td></tr><tr><td>Protease neutra (Dispase)</td><td>Reagente</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS02111</td><td></td></tr></tbody></table>

culturas de células neuronais de aplysia para imagens de alta resolução de cones de crescimento

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Cones de crescimento neuronal são as estruturas altamente móveis na ponta dos axônios que podem detectar sinais de orientação no meio ambiente e transdução esta informação em movimento direcional para a célula de destino. Para entender completamente como a informação é transmitida a orientação da superfície da célula para a dinâmica subjacente redes do citoesqueleto, um precisa de um sistema modelo adequado para imagens de células vivas da dinâmica de proteínas na resolução temporal e espacial de alta. Típicos cones de crescimento vertebrados são pequenos demais para analisar quantitativamente F-actina e dinâmica de microtúbulos. Neurônios da lebre do mar Aplysia californica são 5-10 vezes maior do que os neurônios dos vertebrados, podem ser facilmente mantidos em temperatura ambiente e são células muito robusta para micromanipulação e medidas biofísicas. Cones seu crescimento tem muito definido regiões do citoplasma e um sistema bem-descrito do citoesqueleto. Os corpos celulares neuronais podem ser microinjeção com uma variedade de sondas para estudar a motilidade cone de crescimento e orientação. No presente protocolo que demonstrar um procedimento para a dissecção do gânglio abdominal, a cultura de neurônios de células saco e criação de uma câmara de imagem para imagens de células vivas de cones de crescimento.

Neurônios Aplysia californica desenvolver cones grande crescimento na cultura que são excelentes para imagens de alta resolução da motilidade cone de crescimento e orientação. Aqui, apresentamos um protocolo para a dissecção e chapeamento de neurônios células Aplysia saco, bem como para a criação de uma câmara para imagens de células vivas.

Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento

Os cones de crescimento neuronais são as estruturas altamente móveis na extremidade dos axônios que podem detectar sinais de orientação no ambiente e transduzir essa informação...

No laboratório simulado, cultivamos neurônios da célula-traseira do molusco marinho Plegia California car. Esses neurônios projetam cones de crescimento muito grandes, o que os torna um excelente sistema modelo para estudos de alta resolução da motilidade e orientação do cone de crescimento, especialmente para analisar a dinâmica do citoesqueleto. Neste vídeo, demonstramos como realizar a dissecação de Plegia e o cultivo de células-traseiras.Olá, sou Daniel Suter do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue. Hoje vamos mostrar a vocês o procedimento para dissecção, cultura e imagem de neurônios de células traseiras de plegia. Neurônios da C, her apia CAA têm sido amplamente utilizados em estudos de aprendizado e memória.Como Apia possui um sistema nervoso simples e neurônios grandes adequados para eletrofisiologia, em nosso laboratório utilizamos esses neurônios porque seus cones de crescimento são grandes e muito apropriados para imagens de alta resolução da dinâmica de proteínas relacionadas à motilidade e orientação do cone de crescimento. O procedimento completo envolve os seguintes passos.No primeiro dia, o animal é sacrificado e dissecado para obter os gânglios abdominais. No segundo dia, preparam-se as placas de cultura. Os aglomerados de células dorsais são dissecados e neurônios individuais são semeados.No terceiro dia, uma câmara de imagem para aquisição de imagens com microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) é montada, demonstrando e narrando o procedimento. A responsável pelo procedimento de hoje será iTune Lee, aluna de pós-graduação no meu laboratório. Ela agora mostrará a vocês como preparar neurônios de células-tronco.Vamos começar. Os neurônios das células traseiras fazem parte do gânglio abdominal do sistema nervoso pleural, portanto isolaremos todo o gânglio abdominal para digestão enzimática. Em seguida, separaremos os dois aglomerados de células em bolsa do restante do gânglio.O gânglio abdominal será digerido nesta solução da fase dois por 15 a 16 horas para soltar os tecidos conjuntivos. Agora precisamos preparar uma seringa grande de 60 mililitros preenchida com 0,5 molar de cloreto de magnésio para sacrificar o animal e limpar as ferramentas de dissecação, uma pinça de dissecação, tesoura e tesoura grande. Nós coletamos *Plegia californica* da costa da Califórnia, que possuem cerca de 150 gramas de peso.Mantemos os animais em um tanque para lagostas por um período máximo de três a quatro semanas. O animal é injetado próximo à cabeça, na cavidade corporal, com a solução de cloreto de magnésio. Massagear o animal ajuda a espalhar a solução e evita que ele entre em contração.Fixe o animal pela cabeça e pela cauda sobre uma placa de isopor usando agulhas de seringa. Levante o músculo da parede corporal com uma pinça e abra a cavidade corporal com uma tesoura grande. Em seguida, corte a parede corporal ao longo do lado, da cabeça até a cauda, e fixe o músculo na placa.Em seguida, o gânglio abdominal deve ser localizado sob o ovário, que é um órgão amarelado com aspecto de pincel. O gânglio abdominal pode ser encontrado. Desconecte o gânglio cortando os nervos com a tesoura de dissecação na face anterior e na face posterior do gânglio.Em seguida, transfira o gânglio para um tubo de ensaio com um mililitro da solução de dissociação e coloque-o em banho-maria a 22 graus por 15,5 horas. Durante esta incubação, o tecido conjuntivo se soltará ao ponto em que os aglomerados de células posteriores poderão ser removidos facilmente. Antes de iniciar o cultivo das células posteriores, prepararemos as lamínulas nas quais os neurônios serão cultivados.Cultivamos neurônios de células-tronco em lamínulas recobertas com lisina em placas de Petri de 35 milímetros. Em seguida, são submersas em meio L 15 A SW, que é um meio de cultura com alta concentração de sal. Para este tipo de células, normalmente preparamos de oito a dez placas de Petri com lamínulas por animal.Agora vamos discutir as ferramentas utilizadas para o plaqueamento dos neurônios das células em bolsa. Para a dissecação dos aglomerados de células em bolsa, precisaremos de três placas de cores pêssego sem lamínulas, contendo L 15 A SW, pinças e tesouras finas esterilizadas com álcool e uma ponteira amarela curvada acoplada a uma pipeta P 20. A ponteira amarela é aquecida passando-se rapidamente pela chama de um bico de Bunsen e, com o auxílio de pinças, é curvada.Tenha cuidado para não esmagar a parte curvada. Caso contrário, o aglomerado de células da bolsa pode ficar preso ali posteriormente. A dissecação e o plaqueamento das células da bolsa de plegia são realizados em temperatura ambiente sob o microscópio estereoscópico.Agora terminou a incubação enzimática de 15,5 horas e podemos transferir o gânglio abdominal do espaço do disco para um dos recipientes de trabalho com meio L 15 A SW. Antes de mostrar como as células em bolsa são isoladas, vamos primeiro analisar o esquema. Para visualizar como o gânglio abdominal é dissecado, primeiro cortamos o gânglio abdominal pelo centro.Como você pode ver por esta linha. Em seguida, fazemos dois cortes na frente e atrás das costas. Assim, o agrupamento, como você pode ver aqui.Agora, olhando através do estereomicroscópio, você pode ver que o gânglio abdominal está cortado ao centro e que agora dois cortes foram feitos na frente e atrás do agrupamento de células traseiro. Em seguida, usamos uma pinça para encontrar uma abertura no tecido conjuntivo e empurramos suavemente para baixo a bainha de tecido conjuntivo que envolve o agrupamento de células em bolsa. Remova o tecido conjuntivo do agrupamento inteiro, se possível, usando a tesoura de dissecação.Mas tenha cuidado para não danificar o agrupamento de células da bolsa. Com um meio aspirado na ponta curvada, transfira suavemente o agrupamento de células da bolsa para outro recipiente de trabalho. Agite suavemente o agrupamento de células da bolsa com uma ponteira amarela para remover células individuais do agrupamento.Para fazer isso, aspire o agregado para dentro da ponteira da pipeta e expulse-o sem provocar bolhas de ar. Transfira as células viáveis do agregado para placas contendo lamínulas revestidas com poli. Células mortas aparecem pretas no centro, enquanto as células vivas são brancas.É importante posicionar as células no centro da lamínula para microscopia e remover qualquer detrito celular e células mortas o mais rapidamente possível. Ao recolher o material indesejado ou soprá-lo para longe, as células saudáveis se aderirão rapidamente à placa de polilisina. Cerca de 15 a 25 células por lamínula.Quando todas as células do primeiro grupo tiverem sido posicionadas, o tecido conjuntivo do segundo grupo é removido e o mesmo procedimento de semeadura celular continua. Após a finalização de todas as placas, deixe-as em repouso à temperatura ambiente na bancada por pelo menos duas horas para permitir a correta adesão das células, evitando qualquer vibração. Em seguida, coloque as placas sobre uma bandeja de isopor ou plástica e transfira-as para uma incubadora a 14 graus antes de qualquer uso adicional.Nós geralmente realizamos a imagem dos cones de crescimento neuritais um ou dois dias após o plaqueamento. Para a imagem em tempo real da dinâmica dos cones de crescimento neuronais, montamos uma pequena câmara de imagem composta por duas lamínulas separadas por espaçadores de plástico. A lamínula inferior possui os neurônios aderidos a ela.O lamínula superior é cortado mais curto com uma caneta de diamante para permitir uma troca fácil do meio. Na platina do microscópio, o "sanduíche" de lamínulas é então colocado em um suporte personalizado para fixação no microscópio. Graxa de alto vácuo é usada para manter os elementos da câmara unidos sem vazamento do meio. Usando uma pequena seringa, a graxa de alto vácuo é aplicada sobre o vidro de cobertura superior e, em seguida, utilizamos pinças para posicionar os espaçadores e depois aplicamos mais graxa de vácuo por cima.Em seguida, pegamos todo o conjunto, viramo-lo e pressionamos suavemente sobre a lamínula com as células ainda imersas na placa. Utilize cotonetes para alinhar as lamínulas e pressionar a lamínula superior sem quebrá-la. Depois, removemos cuidadosamente o "sanduíche" da placa, limpamos qualquer meio em excesso e colocamo-lo na base do suporte.Coloque o preparo no porta-objetos sem rachar o lamínula por pressão. Limpe ambas as lamínulas com limpador de vidro sparkle em um cotonete, e preferimos usar sparkle porque deixa menos riscos no vidro. Limpe a lamínula coberta com movimento circular a partir do centro e siga imediatamente com um cotonete seco para evitar riscos.O vidro limpo e coberto é muito importante para a obtenção de imagens de alta qualidade, especialmente com óptica DIC. Os cultivos neuronais de células da camada profunda são cultivos de baixa densidade, portanto será muito útil se seu microscópio possuir funções de posicionamento da platina para alternar facilmente entre diferentes células. Agora estamos prontos para observar a morfologia e a motilidade do cone de crescimento.Visualizamos o crescimento na morfologia e na motilidade com alto contraste de interferência diferencial de resolução, imagens de lapso de tempo DIC. A microscopia DIC é útil para esta aplicação porque fornece uma visão da superfície da estrutura do cone de crescimento neste filme de lapso de tempo DIC 60X. Pode-se claramente observar os três domínios de um cone de crescimento típico.O domínio periférico, composto por afetação enriquecida da la mela podia e op podia. A zona de transição caracterizada por atividade de pregueamento e o domínio central que contém principalmente microtúbulos e organelas. Para estudar os mecanismos de direcionamento do crescimento, desenvolvemos o ensaio de interação com microesferas restritas (RBI), neste ensaio.Microesferas revestidas com proteínas artesianas são usadas para imitar substratos-alvo celulares. A esfera é colocada sobre o domínio periférico do cone de crescimento com uma micropipeta no filme com contraste de interferência diferencial (DIC) com lapso de tempo. Pode-se observar o efeito e o fluxo retrógrados por meio de ondas móveis em direção retrógrada no domínio central.As organelas se movem sobre microtúbulos. Após um período inicial durante o qual não ocorrem mudanças significativas, pode-se observar um movimento repentino para frente do limite do domínio central em direção à esfera imobilizada. Um acompanhamento pelo crescimento da borda anterior e aumento da tensão, além de provocar atenuação do fluxo e extensão dos microtúbulos, pode ser observado especificamente ao longo do eixo de interação com a esfera.Para analisar a dinâmica do citoesqueleto em cones de crescimento, utilizamos microscopia de manchas fluorescentes. Injetamos microscópicamente sondas de tubulina e actina marcadas com fluorescência no corpo celular neuronal e realizamos filmes com intervalos de tempo. Dos movimentos dinâmicos do citoesqueleto, o afetado mostrado em vermelho é montado ao longo da borda anterior, deslocado por fluxo retrógrado e reciclado na zona de transição.Micrótúbulos dinâmicos mostrados em verde exploraram a periferia de crescimento por meio de uma combinação de comportamentos de montagem e translocação. A baixa quantidade de marcação resulta em um padrão pontilhado, permitindo-nos analisar quantitativamente os diversos parâmetros da dinâmica do citoesqueleto. Mostramos a você como realizar a dissecação, cultura e obtenção de imagens de células nervosas, caso deseje realizar imagens de alta resolução de cones de crescimento neuronais.Este é realmente o sistema a ser utilizado devido ao grande tamanho dos cones de crescimento, às regiões citoplasmáticas bem definidas e ao citoesqueleto bem descrito. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aplysia Preparação de Ganglia para Análises Eletrofisiológicas e Moleculares de Neurônios Únicos

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Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Para avançar, os cones de crescimento devem exercer forças de tração contra o ambiente externo. A geração de forças de tração depende da dinâmica actin e do acoplamento da embreagem. O presente estudo descreve métodos para analisar a dinâmica do actin, acoplamento de embreagem e forças de tração para o avanço do cone de crescimento.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

Aprenda a cultivar neurônios de bag cells de Aplysia californica para imagens de alta resolução de cones de crescimento. Este protocolo detalhado facilita estudos de motilidade e dinâmica do citoesqueleto em neurociência.

Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento

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