Name: Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a preparar meios anaeróbios para microrganismos exigentes usando a técnica modificada de Hungria. Este método facilita o cultivo de microrganismos de matéria escura microbiana em ambientes terrestres.

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Os autores gostariam de reconhecer a linhagem de informação e orientação que influenciou/evoluiu essas técnicas ao longo dos anos. O Dr. Hamilton-Brehm como ex-aluno de pós-graduação, pós-doc e atual professor tem uma dívida de gratidão com aqueles que dedicaram tempo para ensinar técnicas anaeróbicas: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser e Dr. Brian Hedlund. A Nature Conservancy e a American Rivers apoiaram este trabalho através dos subsídios G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, respectivamente. Quaisquer opiniões, descobertas, conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Nature Conservancy ou da American Rivers. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do SIU Advanced Energy Institute, que agradece o financiamento concedido através do Advanced Energy Resource Board. A NGS foi realizada pela LC Sciences.

Método anaeróbico simulado in situ para cultura de micróbios ambientais

<ol><li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li>
<li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22MSystems%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055(2018).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+biological+%26%2334%3Bdark+matter%26%2334%3B+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissecting biological &#34;dark matter&#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li>
<li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the%27omics%27+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+unculturable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li>
<li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands%3A+Knowledge+gained+and+remaining+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184(2011).</li>
<li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%26%2334%3B+uncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating&#34; uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012(2011).</li>
<li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li>
<li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogens%3A+Reevaluation+of+a+unique+biological+group%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li>
<li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).</li>
<li>Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013).</li>
<li>Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018).</li>
<li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a%7E+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535(2020).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.%2C+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224(2019).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.%2C+an+anaerobic%2C+extremely+thermophilic%2C+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.%2C+a+hyperthermophilic%2C+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li>
<li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A seção de produção de meios deste protocolo (seção 1) deve sua estrutura à técnica de Hungate modificada de Miller e Wolin17, que tem sido amplamente utilizada desde sua publicação. A praticidade deste protocolo expandido advém de sua natureza descritiva e de seu pareamento com a aquisição in situ de microrganismos. Frascos de cultura contendo meios ambientalmente informados e simulados foram usados para cultivar com sucesso os seguintes ex-membros da "matéria escura microbiana" adquirid...

A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de "Anomalia da Grande Contagem de Placas"1. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientesdiferentes 2. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatório de uma comunidade microbiana), mas não foram cultivados, têm sido referidos como "matéria escura microbiana"3,4.
Na era da -ômica, a cultura de microrganismos continua sendo imperativa para avaliar completamente os dados genômicos e verificar a função/fenótipo dos genes presentes. O sequenciamento de microrganismos cultivados ainda é a única maneira de obter genomas completos com confiança até que tecnologias como a metagenômica shotgun e genomas montados em metagenomas do ambiente se tornem admissivelmente infalíveis5. Avaliações genômicas juntamente com microrganismos cultivados fornecem fortes inferências para a compreensão da "matéria escura microbiana". Muitos membros da "matéria escura microbiana" desempenham funções cruciais que afetam a ciclagem de nutrientes e outros elementos e a produção de produtos naturais valiosos, apoiam sistemas ecológicos e executam serviços ecológicos. Do ponto de vista médico, cerca de metade de todos os produtos farmacêuticos atualmente comercializados são produtos e derivados de produtos de bactérias, e suspeita-se que o perfil de espécies não cultivadas revele os antibióticos do futuro. Para ter acesso a essa maioria inculta, uma variedade de metodologias de cultivo deve ser aumentada6. Entre os membros da "matéria escura microbiana", os microrganismos anaeróbios oligotróficos são amplamente subnotificados e provavelmente possuem vias bioquímicas ecológica e industrialmente valiosas7, tornando-os importantes alvos de cultivo. No entanto, microrganismos oligotróficos anaeróbios são mais difíceis de cultivar do que seus homólogos aeróbios e copiotróficos devido a tempos de incubação mais longos frequentemente exigidos, condições fastidiosas (por exemplo, temperaturas in vitro não padronizadas específicas) e o uso de receitas de meios especializados.
As técnicas atuais de desenvolvimento para cultivar membros da "matéria escura microbiana", incluindo novos microrganismos anaeróbios oligotróficos, melhoraram muito nossa compreensão e aumentaram a representação desses microrganismos dentro da árvore filogenética. As técnicas atuais que utilizam meios informados para o cultivo de novos microrganismos (isto é, meios derivados do conhecimento do(s) microrganismo(s) de interesse) podem ser separadas em três métodos distintos. O primeiro dos métodos envolve a remoção direta de uma seção discreta do ambiente para transferência para uma câmara de crescimento in vitro que já contém os microrganismos de interesse dentro de uma membrana. A seção discreta (por exemplo, água do mar) atua para fornecer aos microrganismos de interesse o habitat geoquímico que eles usam in situ, enquanto a membrana interrompe o movimento das células através (células de interesse permanecerão dentro; células estranhas que chegaram com a seção discreta permanecerão sem). Ao incluir compostos naturalmente disponíveis para atingir microrganismos em seu habitat natural, tais microrganismos podem ser cultivados8. O segundo método utiliza metatranscriptômica ou genômica para elucidar capacidades metabólicas, fornecendo pistas para parâmetros de cultivo estreitos para um planejamento de meio alvo. Esta abordagem fornece um perfil eco-fisiológico que pode ser usado para direcionar o enriquecimento de tipos específicos de microrganismos fora de um ambiente. As provisões do meio são atendidas para os genes identificados presentes que se presume suportarem o(s) microrganismo(s) alvo(s) para reduzir a diversidade de enriquecimento9,10. Uma ressalva é que a informação genômica não infere diretamente a expressão dos genes, enquanto a informação transcriptômica infere.
O terceiro método engloba mídias ambientalmente informadas e simuladas, distintas do primeiro, que não simula as mídias, mas utiliza diretamente o ambiente como fonte de mídia. Este terceiro método requer o reconhecimento ambiental da geoquímica de um local de campo contendo microrganismos de interesse. Com esse conhecimento, componentes primários e parâmetros físicos são identificados para produzir um meio simulado ambientalmente informado. O meio então recebe uma infusão direta de sedimento ou líquido contendo microrganismos do ambiente para o meio. Este método é particularmente valioso nos casos em que o microbiologista de cultura não tem acesso a quantidades suficientes de ambiente de origem (conforme necessário para o primeiro método) nem a dados metatranscriptômicos ou genômicos apropriados (conforme necessário para o segundo).
O protocolo a seguir é um exemplo do terceiro método; É informado e tem como objetivo simular ambientes de interesse. Três receitas de meios ingênuos visando diferentes culturas de microrganismos anaeróbios adquiridas no campo são apresentadas em paralelo dentro do protocolo. As três culturas representadas são culturas mistas originárias do solo (doravante, cultura mista de solo), culturas mistas originárias de um poço (doravante, cultura mista de poço) e um metanogênio isolado originário de um poço (doravante, metanogênio isolado de poço). As identidades e quantidades compostas nas receitas de mídia compartilhadas aqui são destinadas como um guia inicial; eles são capazes e incentivados a serem personalizados para o ambiente do leitor e microrganismos de interesse.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais Gerais</forte>Frasco de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>borosillicado de 1 L</td> Seringa de 1 mL da <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com ponta deslizante</td> Pipeta de vidro de 10 mL <td>da Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de 100 mL</td><td>da Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frisador de mão de 20 mm</td><td>Agulha Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>23 G</td> Frasco de borossilicato <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vedação de alumínio</td><td>Cânula Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 31,5 cm de comprimento</td><td>Cânula Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>6 cm de comprimento</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corer</td><td>Giddings Machine Company&nbsp;</td><td></td><td>Montado a partir de peças da empresa</td></tr><tr><td>Coletor de gás</td><td>Swagelok</td><td></td><td>Montado a partir de muitas partes</td></tr><tr><td>diferentes Isqueiro</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gás</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampa de borracha (para garrafas GL45)</td><td>Glasgeratebau OCHS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rolha de borracha (para frascos de cultura)</td> <td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa quente de agitação</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligoelementos</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< forte > materiais específicos do biorreator< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 10 rolha de borracha</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#7 rolha de borracha</td><td>Seringa Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1 mL com ponta luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4" válvula de esfera de mangueira Amazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL com ponta luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>garrafa de borossilicato de 3,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/16" - 1/4" adaptador de mangueira barb encaixe</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mL seringa com ponta luer lock garrafão</td> borosillicate <td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 L</td><td>Allen Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector de mangueira angular para tampa superior aberta GL14</td><td>Ace Glass</td><td>7623-20</td><td></td></tr><tr><td>Balloon</td><td>Party City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate biorreator</td><td>Allen Scientific Glass</td><td></td><td>Feito sob encomenda</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fêmea luer lock adaptador acoplador</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 tampa superior aberta</td><td>Ace Glass</td><td>7621-04</td><td></td></tr><tr><td>GL18 tampa superior aberta</td><td>Ace Glass</td><td>7621-08</td><td></td></tr><tr><td>GL45 tampa superior aberta</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTFE septo de silicone para tampa superior aberta GL14</td><td>Ace Vidro</td><td>7625-06</td><td></td></tr><tr><td>PTFE enfrentou septo de silicone para GL18 tampa superior aberta</td><td>Ace Glass</td><td>7625-07</td><td></td></tr><tr><td>Suporte</td> de anel <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampo de corrente de suporte de anel</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anel de suporte</td><td>Tubulação de silicone Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; 1/4" id, 1/2" od</td><td>Grainger</td><td>55YG13</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone; 3/16" id, 3/8" od</td><td>Conector</td> de mangueira reta Grainger <td></td><td></td></tr><tr><td>para tampa superior aberta GL14</td><td>Ace Glass</td><td>7623-22</td><td></td></tr><tr><td>Torneira de três vias</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torneira de duas vias</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minibomba de fluxo variável de fluxo ultra baixo</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Septo de borracha branca Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para tubos de 13-18 mm OD</td><td>Ace Glass</td><td>9096-49</td><td></td></tr><tr><td>Wire</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zip tie</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

A pesquisa de microrganismos anaeróbios dependente da cultura baseia-se na competência metodológica. Esses métodos devem criar e manter condições adequadas de crescimento (por exemplo, pH e fontes de carbono) para microrganismos anaeróbios, ao mesmo tempo em que permitem que as amostras sejam extraídas sem comprometer o ambiente artificial. Para isso, métodos que são informados e simulam um ambiente in situ podem ser de grande auxílio na cultura de microrganismos desse ambiente. Aqui, delineamos um método anaeróbio informado e simulado in situ para cultivo de microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, enfatizando a coleta de amostras anaeróbias com o mínimo de perturbação. Este protocolo detalha a produção de um meio líquido anaeróbio personalizável, a aquisição ambiental e o crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios. O protocolo também abrange componentes críticos de um biorreator anaeróbio usado para simulações ambientais de sedimentos e meios líquidos anaeróbios para culturas ambientalmente adquiridas. Incluímos dados preliminares de sequenciamento de próxima geração de um microbioma mantido ao longo da vida útil de um biorreator onde a cultura ativa se ajustou dinamicamente em resposta a uma fonte de carbono experimental.

Aqui nós mostramos os resultados de um estudo de biorreator usando um método de preparação de meio de cultura misto de poço e um método de configuração de biorreator como descrito aqui. O meio de cultura misto do furo foi modificado para conter como fonte de carbono uma lama de espigas de milho processada por Dissolução Hidrotérmica Oxidativa (OHD)13,14. Meio de cultura modificado foi bombeado para o biorreator por 44 dias a uma taxa de 0,4 mL/min. No dia 23, um ...

O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a "matéria escura microbiana".

Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

Nossa pesquisa se concentra em microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, cultivando-os e investigando seus genomas e fenótipos. De particular enfoque são os microrganismos em ambientes que não são bem compreendidos, como aqueles na subsuperfície profunda e em certas áreas úmidas. A maioria dos microrganismos que cultivamos são anaeróbios, o que significa que o processo de cultivo geralmente requer mais tempo e atenção do que os processos para microrganismos aeróbios mais comumente usados.Esperamos que a apresentação audiovisual da preparação do meio anaeróbio ajude os pesquisadores iniciantes na técnica a aprendê-la de forma relativamente rápida e fácil. Esta preparação do meio é baseada na técnica modificada de Hungate de Miller e Wolin. Cultivar micróbios fastidiosos é tedioso e problemático.Ter mais ferramentas para cultivá-las é muito bem-vindo à comunidade científica. Pesquisas futuras em geral serão semelhantes às nossas pesquisas atuais de microrganismos terrestres pouco estudados. Ainda há muitos micróbios novos para descobrir e estudar.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Ahmadi, S., et al. Um modelo de cultivo lotado in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra um método para modelar a fermentação microbiana intestinal incubando amostras fecais com fibra fermentável dietética sob condições anaeróbias para estudar a produção de metabólitos pela microbiota intestinal.

In vitro Modelo de Cultura em Lote para Imitar a Fermentação Cólica pela Microbiota Intestinal Humana

Clostridium difficile é uma bactéria patogênica que é um anaeróbio estrito e causa diarreia associada a antibióticos (DAA). Aqui, os métodos para o isolamento, a cultura e manter C. As células vegetativas difficile e esporos são descritos. Essas técnicas necessitam de uma câmara de anaerobiose, o que requer uma manutenção regular para garantir condições adequadas para melhor C. cultivo difficile.

Cultivar e Manter<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Em um ambiente anaeróbico

Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.

Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana

Como os organismos anaeróbios obrigam são incapazes de crescer em cima da exposição de oxigênio, o uso de técnicas de cultivo anaeróbicos é indispensável. Aqui, demonstramos um método simples e efetivo para cultivar uma cultura mista derivada de uma usina de biogás a partir da preparação de mídia para o gás e quantificação de ácidos graxos voláteis.

Preparação média para o cultivo de microrganismos condições estritamente anaeróbicas/anóxicas

O protocolo resume as melhores práticas para minimizar a carga biológica microbiana em um ambiente de sala limpa e inclui estratégias como monitoramento ambiental, monitoramento de processo e teste de esterilidade do produto. É relevante para instalações de fabricação e teste que são necessárias para atender aos padrões atuais de boas práticas de tecidos e aos padrões atuais de boas práticas de fabricação.

Estratégias de Controle e Monitoramento Microbiano para Ambientes de Salas Limpas e Terapias Celulares

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Este protocolo descreve o projeto e o uso de um chip de isolamento (iChip) para o cultivo in situ de micróbios recalcitrantes do solo em seu ambiente natural. Também descreve o cultivo in situ de bactérias do solo produtoras de antimicrobianos. O protocolo pode ser adaptado para recuperar bactérias de diversos nichos com outras propriedades desejáveis.

In situ Isolamento e Cultura de Bactérias Recalcitrantes do Solo usando um Chip de Isolamento (iChip)

Este protocolo detalha a montagem de matrizes de mini-biorreatores a serem utilizados para cultura de fluxo contínuo de comunidades fecais complexas sob condições anaeróbicas. Também discutimos os métodos de montagem, inoculação e amostragem dos reatores para análise posterior.

Montagem de biorreatores para cultura contínua de comunidades fecais complexas

Mudanças induzidas pela pesca para a pesca de crustáceos explorados, tais como a pesca de lagosta americano, poderia influenciar a sua dinâmica reprodutiva, levando a uma redução no sucesso de acasalamento. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método não invasivo para determinar o sucesso de acasalamento de lagostas fêmeas que podem ser fisiologicamente ou funcionalmente maduro.

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

A Solid State (UASS) Reator Anaeróbio romance foi utilizado para a produção de biogás a partir de matéria-prima fibrosa. Digestores de UASS reator foi hidrotermal carbonizada em HTC biochar em um reator de batelada pressurizado. A integração dos dois conceitos de bioenergia foi aplicado neste estudo para aumentar a produção global de bioenergia.

Avaliação Integrada Digestão Anaeróbia e carbonização hidrotérmica para Bioenergy Production

Aprenda a preparar meios anaeróbios para microrganismos exigentes usando a técnica modificada de Hungria. Este método facilita o cultivo de microrganismos de matéria escura microbiana em ambientes terrestres.

Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos (Vídeo) | JoVE Journal

Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

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