Name: Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda o modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo em camundongos para estudar lesão de isquemia-reperfusão pulmonar. Este método reprodutível permite investigar os mecanismos celulares envolvendo neutrófilos e células B.

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Modelo de camundongo para estudo de lesão de isquemia-reperfusão pulmonar

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Os autores não relatam divulgações relevantes.

Descrevemos uma técnica de pinça hilar que envolve a aplicação de um nó corrediço no hilo esquerdo que oclui a artéria pulmonar e veias e brônquios para induzir isquemia quente seguida de reperfusão. Após o pinçamento hilar, o pulmão esquerdo pode ser colhido para uma variedade de técnicas experimentais, como histologia, citometria de fluxo, sequenciamento em massa ou de célula única e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Além disso, o sangue e o baço podem ser usados para estudar os efeitos sistêmicos, enquanto o pulmão direito não isquêmico pode servir como controle interno. Neste protocolo, também descrevemos métodos detalhados para obter medições de gasometria arterial e/ou determinar o extravasamento celular.
A técnica de pinçamento hilar murino é fundamental para o estudo da IRI pulmonar e para o campo mais amplo do transplante pulmonar. Por exemplo, usando este modelo de grampo hilar, nosso grupo descobriu que os monócitos clássicos CCR2+ derivados do baço medeiam o extravasamento de neutrófilos para o pulmão após o IRI18. Outro grupo mostrou que as células epiteliais alveolares do tipo II produzem CXCL1 (um quimioatraente de neutrófilos) de maneira dependente de NADPH oxidase-IL-17-TNFα usando um modelo de pinça hilar19. Descobriu-se que o TLR4 desempenha um papel no desenvolvimento de edema em um modelo murino de pinçamento hilar20.
Embora o transplante ortotópico de pulmão murino seja mais clinicamente aplicável e possa simular isquemia quente e fria, ele também introduz trauma cirúrgico de anastomoses vasculares e brônquicas e estímulos alogênicos de incompatibilidade doador-receptor. Assim, a principal vantagem da técnica do grampo hilar é sua capacidade de isolar os efeitos da IRI pulmonar desses outros fatores. Além disso, para o microcirurgião de camundongo inexperiente, o procedimento de pinça hilar é tecnicamente menos exigente e pode ser dominado mais rapidamente em comparação com o transplante de pulmão. Uma limitação do modelo de pinça hilar é que a isquemia fria é difícil de alcançar. A isquemia fria in situ foi realizada em porcos com perfusão anterógrada através da artéria pulmonar esquerda25, porém isso é muito mais desafiador no camundongo devido ao seu tamanho menor e à necessidade de manter a normotermia durante a cirurgia. No entanto, o estudo da isquemia quente isolada é importante, pois geralmente é mais deletéria para a função orgânica do que a isquemia fria 4,5,6. Além disso, os centros de transplante estão adotando cada vez mais transplantes de pulmão DCD, que são acompanhados por tempos isquêmicos quentes muito mais longos do que os transplantes pulmonares DBD tradicionais7. Assim, o estudo detalhado dos eventos durante a isquemia quente e o período de reperfusão subsequente é crítico e pode ser realizado com este modelo de pinça hilar.
Muitas variações da técnica do grampo hilar foram criadas nas últimas duas décadas. Isso inclui o uso de uma pinça microvascular atraumática 8,9,10,11,12,13, um torniquete Rumel 14,15 e uma gravata com um nó corrediço ao redor do hilo16. Descrevemos nossa adaptação da técnica do nó corrediço em camundongos. A principal vantagem dessa técnica sobre outras técnicas de pinçamento hilar é que ela permite o fechamento do tórax durante o período de isquemia, o que minimiza as perdas insensíveis de líquidos, principalmente em protocolos com períodos mais longos de isquemia. Isso não pode ser feito quando um grampo ou torniquete é colocado no hilo.
Em relação à seleção de animais, optou-se por desenvolver este modelo em camundongos em oposição a ratos ou modelos animais de grande porte, como porcos. O raciocínio é duplo - nosso laboratório tem vasta experiência em microcirurgia de camundongos com transplante ortotópico de pulmão de camundongos17. Em segundo lugar, embora os camundongos sejam menores e tecnicamente mais difíceis de operar do que os ratos, atualmente existem mais cepas de camundongos transgênicos disponíveis comercialmente do que cepas de ratos26,27. Os camundongos também se reproduzem mais rapidamente, permitindo o desenvolvimento mais rápido de novas cepas, o que é particularmente útil ao investigar os mecanismos imunológicos do IRI. Por esses motivos, optamos por desenvolver essa técnica em camundongos.
Até onde sabemos, este é o primeiro artigo baseado em vídeo usando a técnica de pinça hilar do pulmão esquerdo em camundongo com um nó corrediço. Saito e cols. publicaram um artigo baseado em vídeo demonstrando o clamp hilar em ratos usando um clamp microvascular22. Em camundongos, Liao e cols. publicaram um modelo de IRI pulmonar com pinçamento da artéria pulmonar (AP) com nó corrediço, porém o pulmão permanece ventilado neste modelo, pois o brônquio é excluído do clamp28. A técnica de pinçamento do AP tem sido utilizada como modelo para estudar embolia pulmonar29, hipertensão pulmonar e/ou insuficiência ventricular direita30,31. Como a área de estudo é a IRI pulmonar no transplante, optamos por pinçar todo o hilo, incluindo o brônquio, para minimizar o barotrauma além da lesão isquêmica.
É importante notar que 30 minutos de isquemia quente foram escolhidos seguidos de 1 h de reperfusão porque estamos interessados na dinâmica das células infiltrantes pulmonares no período inicial pós-IRI. Por exemplo, estudos relataram regulação positiva de genes citoprotetores, como a heme oxigenase 1, após apenas 30 min de isquemia seguido de 2 h de reperfusão13. Anteriormente, pensava-se que os neutrófilos eram o tipo de célula central que se infiltrava no pulmão após a IRI32, no entanto, mostramos que os monócitos precedem os neutrófilos em sua chegada ao pulmão 18,24. Mais recentemente, descobrimos que as células B precedem até mesmo os monócitos e entram no pulmão dentro de 1 h após a reperfusão (dados não publicados). Ao adaptar essa técnica, as durações de isquemia e reperfusão quentes podem ser ajustadas de acordo com a questão e hipótese do estudo. Períodos mais longos de isquemia quente são possíveis sem preocupação com perda excessiva de líquidos e calor, pois o tórax pode ser fechado durante esse período.
Várias complicações podem ocorrer no perioperatório, com o resultado final comum sendo a morte perioperatória. Observamos que a incidência de morte de animais durante a cirurgia diminui com a repetição da técnica pelo cirurgião. Estimamos que os cirurgiões exijam pelo menos 2 meses de prática e/ou pelo menos 20 casos para atingir um patamar de habilidade. Neste ponto, estimamos que a mortalidade intraoperatória ocorra em aproximadamente 1 em 50 casos. A morte no camundongo anestesiado é freqüentemente anunciada por respirações agonais que envolvem contrações vigorosas do diafragma e da musculatura da parede torácica. Após o início dessas respirações agonais, a morte ocorrerá em 3-5 minutos se nenhuma intervenção for realizada. Existem várias causas que podem precipitar a morte intraoperatória, muitas das quais são reconhecíveis e evitáveis. Destacaremos abaixo as etapas críticas desta cirurgia e as técnicas de solução de problemas para alcançar um resultado bem-sucedido.
Intubação O primeiro passo crítico é a intubação cuidadosa e a fixação das vias aéreas para evitar a extubação inadvertida. Em uma cirurgia de sobrevivência, é particularmente importante garantir que as cordas vocais não sejam danificadas durante a intubação inicial, pois o camundongo não conseguirá respirar após a extubação. O avanço do TET além dos cordões deve ser feito sob visualização direta através do microscópio. Se a resistência for encontrada durante a intubação, o TET não deve ser avançado às cegas. Ao manter a orofaringe aberta com a pinça de mosquito, deve-se tomar cuidado para não perfurar a mucosa oral, pois o sangue obscurecerá a visão das vias aéreas. O número de tentativas de intubação deve ser limitado a menos de cinco.
Extubação acidental Se em algum momento durante o procedimento, os pulmões não parecerem estar inflando adequadamente, é possível que o TET tenha se deslocado. Outra manifestação de extubação acidental que passa despercebida por um período prolongado é o camundongo desenvolvendo repentinamente a respiração agonal. Após a intubação inicial, deve-se tomar cuidado para prender bem o TET ao nariz circunferencialmente com fita de seda, e o ajuste do pescoço e do tronco do camundongo deve ser limitado. Se nem o pulmão esquerdo nem o direito estiverem inflando, o TET pode ter saído da traqueia. Tentativas podem ser feitas para empurrar o TET de volta, no entanto, o camundongo pode precisar ser reintubado de maneira rápida para evitar a morte prematura do animal. Se apenas um pulmão estiver inflando quando ambos devem estar inflando, o TET pode ser muito profundo e deve ser cuidadosamente recuado e reprotegido.
Mobilização pulmonar A mobilização do pulmão esquerdo deve ser feita com aplicadores com ponta de algodão com leve pressão no parênquima pulmonar, pois a lesão por compressão pode danificar os alvéolos e diminuir a complacência do pulmão. Os pulmões não devem ser agarrados com pinças ou pinças, pois isso danificará o parênquima pulmonar.
Aplicação de grampo hilar A pinça hilar esquerda deve ser colocada sob visualização direta, tomando cuidado para não colocar o nó muito centralmente (para não pegar o átrio esquerdo) ou muito perifericamente (para não pegar nenhum parênquima pulmonar). Pegar o átrio esquerdo com o grampo hilar provavelmente precipitará a fibrilação atrial e a morte subsequente. A visualização do hilo pode ser melhorada garantindo a retração adequada da costela para expandir o campo de visão. Depois de amarrar o nó corrediço, é útil garantir que a pinça esteja completamente oclusiva, realizando uma manobra de recrutamento - ocluindo manualmente a tubulação de saída que conecta o TET ao ventilador e garantindo que o pulmão esquerdo não se expanda com pressão positiva. A oclusão vascular é presumida com a confirmação da oclusão brônquica, dada a colapsibilidade aumentada da artéria e veias pulmonares em comparação com o brônquio cartilaginoso. Além disso, o grampo hilar não deve ser amarrado com força excessiva, pois esmagará as porções cartilaginosas do brônquio principal esquerdo e impedirá a expansão do pulmão esquerdo após a liberação do grampo hilar. Uma vez liberado o grampo hilar, é importante verificar se o pulmão ainda pode ser ventilado realizando outra manobra de recrutamento.
Fechamento do peito Ao fechar o tórax, a4ª e a5ª costelas devem ser unidas quando o pulmão estiver no final máximo. Isso minimizará a quantidade de ar restante na cavidade pleural, o que resultaria em pneumotórax quando as costelas estivessem fechadas. As camadas musculares e a pele devem ser fechadas de maneira hermética para evitar o desenvolvimento de pneumotórax hipertensivo.
Obtenção de ABGs Finalmente, ao obter gasometria arterial, é importante primeiro pinçar o hilo direito para que a medição da gasometria arterial reflita apenas a função pulmonar esquerda 22,23. Sem o clamp hilar direito, o pulmão direito normalmente ventilado mais do que compensará o pulmão esquerdo isquêmico danificado e as medições de gasometria arterial parecerão normais.
Em resumo, a técnica de pinça hilar que descrevemos acima é uma ferramenta valiosa para o estudo do transplante de pulmão e, mais importante, pode isolar o estudo da IRI quente sem a introdução de alogenicidade, trauma relacionado à anastomose cirúrgica ou armazenamento isquêmico frio. Notavelmente, esta técnica descrita de pinçamento hilar é facilmente ensinada e amplamente adotável e pode levar a resultados confiáveis e reprodutíveis.

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An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66232">Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury</a>. The Protocol and Representative Results&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

A IRI durante o transplante de órgãos é um importante fator de risco para disfunção primária do enxerto e episódios posteriores de rejeição do enxerto 1,2. Durante o transplante, o tempo de isquemia quente é definido como o período de tempo desde o pinçamento cruzado aórtico do doador até o início da perfusão fria e desde a remoção do órgão do gelo até o implante do órgão. O tempo de armazenamento refrigerado é definido como o período de tempo desde o início da perfusão fria até a remoção do órgão do gelo3. A isquemia quente é mais deletéria para a função orgânica tardia do que a isquemia fria 4,5,6, e seus mecanismos subjacentes justificam um estudo mais aprofundado em modelos pré-clínicos. Além disso, o transplante de órgãos por doação após morte cardíaca (DCD) está associado a tempos isquêmicos quentes mais longos do que a doação tradicional após morte encefálica (DBD)7. Embora o uso de doadores DCD possa expandir o pool de doadores e aumentar a utilização pulmonar, são necessários mais estudos pré-clínicos para avaliar os efeitos da isquemia quente na função pulmonar pós-transplante. Abaixo, descrevemos um modelo de IRI quente em camundongos por meio do grampo hilar pulmonar esquerdo.
Vários modelos animais de pinçamento hilar pulmonar foram desenvolvidos e adaptados nos últimos anos e podem incluir o uso de um clamp microvascular atraumático 8,9,10,11,12,13, um torniquete Rumel 14,15 ou ligadura de sutura16 como o grampo hilar. O ponto crucial do grampo hilar é que ele deve ser reversível e causar danos mínimos ou nenhum dano às estruturas hilares para que a reperfusão possa ser alcançada. Aqui, descrevemos nossa técnica de pinça hilar em camundongos que envolve ligadura de sutura reversível do hilo pulmonar esquerdo com um nó corrediço. Este método oclui o fluxo arterial pulmonar, o fluxo venoso e o fluxo de ar para dentro e para fora do brônquio principal. O principal benefício de um nó corrediço sobre uma pinça vascular, clipe ou torniquete é que o tórax pode ser fechado durante períodos prolongados de isquemia, minimizando assim a perda insensível de fluido e calor no camundongo. Fornecemos um protocolo para obter medições confiáveis de gasometria arterial (ABG) e para medir o extravasamento celular após o pinçamento hilar.
Essa técnica de pinça hilar ocupa um lugar importante no estudo mais amplo do transplante de pulmão. Em comparação com modelos de pequenos animais de transplante pulmonar ortotópico, a técnica de pinça hilar pode isolar os efeitos da IRI sem a adição de trauma anastomótico cirúrgico ou alogenicidade17. Além disso, a técnica do grampo hilar pode ser dominada com mais facilidade e rapidez do que o transplante de pulmão de camundongo. De fato, usando técnicas de clamp hilar, vários mecanismos importantes na patogênese da IRI foram identificados na última década, como TLR4, NADPH oxidase e receptor de adenosina A2A 14,18,19,20. No protocolo a seguir, apresentamos um método confiável, ensinável e reprodutível de pinçamento hilar como ferramenta para estudar a IRI pulmonar.

<table><tbody><tr><td><forte>Medicamentos</forte>solução de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>iodopovidona a 10%</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Para desinfetante</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Saúde Animal</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Para controle da dor</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Cronus Pharma</td><td>NDC 69043-027-18</td><td>Para controle da dor</td></tr><tr><td>Heparina 1000 unidades/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC 25021-404-01</td><td>Para obter sangue arterial</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%-1,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Puralube Vet</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Para prevenir a dessecação ocular</td></tr><tr><td>Xylazine 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Para controle da dor</td></tr><tr><td>Tools and Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen</td><td>McKesson</td><td>231</td><td>Para coagular vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Curved mosquito clamp</td><td>Fine Science</td><td>Tools 13009-12</td><td>Para procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pinça curva fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Para cirúrgico procedimento</td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td>Para procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Configuração de braçadeira de intubação</td><td>Fine Science Tools</td><td>18374-44, 18144-30</td><td>Para segurar o mouse verticalmente pela língua durante a intubação. Veja a Figura Suplementar 1A.&nbsp;</td></tr><tr><td>Retractores magnéticos de costelas</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01, 18200-10</td><td>Para retração de toracotomia. O fixador magnético e o afastador devem ser conectados por um tubo de micro látex abaixo.</td></tr><tr><td>Fibra Óptica de Plástico de Grau Óptico Não Revestida, 500&mu; m</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td>Para fazer o introdutor para o tubo endotraqueal. Veja a Figura Suplementar 1B. Um comprimento de 1,5 polegada desta fibra óptica deve ter um pedaço de fita de seda preso a uma extremidade. Pode então ser usado como um introdutor para o tubo endotraqueal. A extremidade do introdutor deve ser ligeiramente curvada.</td></tr><tr><td>Power Pro Ultra clipper</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td>Para cortar o cabelo</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14370-22</td><td>Para procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento para pequenos animais</td><td>K & H Pet Products</td><td>Thermo-Peep Almofada Aquecida</td><td>Para manter a normotermia</td></tr><tr><td>Ventilador para pequenos animais</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0000</td><td>Para ventilação (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)</td></tr><tr><td>Spearit Micro Tubo de Borracha de Látex (1/8 pol de diâmetro externo, 1/16 pol de diâmetro interno)</td><td>Amazon.com</td><td>https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1</td><td>Para retração de toracotomia</td></tr><tr><td>Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer</td><td>Nova Biomedical</td><td>https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB&nbsp; &nbsp;</td><td>Para retração da toracotomia</td></tr><tr><td>Grampo reto</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td>Para procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pinça reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Para procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>não é mais produzido</td><td>Para intubação e procedimento cirúrgico; recomenda-se a substituição por microscópios cirúrgicos Leica</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac12; cc com &frac12; polegada 29G</td> agulha <td>McKesson</td><td>942665</td><td>Para injetar cetamina/xilazina intraperitonealmente</td></tr><tr><td>&frac12; polegada 31G agulha em uma seringa de tuberculina de 1 cc</td><td>McKesson</td><td>16-SNT1C2705</td><td>Para aspiração de sangue arterial do ventrículo esquerdo</td></tr><tr><td>1 polegada 20G IV cateter</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Para tubo endotraqueal (ETT)</td></tr> <tr><td>1 polegada seda fita</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Para prender o ETT no nariz e prender os membros</td></tr><tr><td>Seringa de 3/10 cc com agulha 31G de 5/16 polegadas</td><td>McKesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td>Para injeção de anticorpos na veia cava inferior</td></tr><tr><td>6-0 sutura monofilamentar em uma agulha P-10</td><td>McKesson</td><td>S697GX</td><td>Para fechamento de toracotomia, camada muscular e</td></tr><tr><td>pele 6-0 gravata de seda</td><td>Surgical Specialties</td><td>Look SP102</td><td>Para fazer nó corrediço para grampo hilar</td></tr><tr><td>Aplicadores pontiagudos com ponta de algodão</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Para manipular o pulmão e para dissecção romba</td></tr></tbody></table>

modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) durante o transplante pulmonar é um importante fator de risco para complicações pós-transplante, incluindo disfunção primária do enxerto, rejeição aguda e crônica e mortalidade. Os esforços para estudar os fundamentos do IRI levaram ao desenvolvimento de um modelo de camundongo confiável e reprodutível de pinçamento hilar do pulmão esquerdo. Este modelo envolve um procedimento cirúrgico realizado em um camundongo anestesiado e intubado. Uma toracotomia esquerda é realizada, seguida por mobilização pulmonar cuidadosa e dissecção do hilo pulmonar esquerdo. O clamp hilar envolve a ligadura de sutura reversível do hilo pulmonar com um nó corrediço, que interrompe a entrada arterial, o fluxo venoso e o fluxo de ar através do brônquio principal esquerdo. A reperfusão é iniciada pela remoção cuidadosa da sutura. Nosso laboratório utiliza 30 min de isquemia e 1 h de reperfusão para o modelo experimental nas investigações atuais. No entanto, esses períodos de tempo podem ser modificados dependendo da questão experimental específica. Imediatamente antes do sacrifício, a gasometria arterial pode ser obtida do ventrículo esquerdo após um período de 4 minutos de pinçamento hilar direito para garantir que os valores de PaO2 obtidos sejam atribuídos apenas ao pulmão esquerdo lesado. Também descrevemos um método para medir o extravasamento celular com citometria de fluxo, que envolve injeção intravenosa de um anticorpo marcado com fluorocromo específico para a(s) célula(s) a ser(em) estudada(s) antes do sacrifício. O pulmão esquerdo pode então ser colhido para citometria de fluxo, congelado ou fixo, imuno-histoquímica embebida em parafina e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Esta técnica de pinça hilar permite um estudo detalhado dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à IRI. Resultados representativos revelam diminuição da oxigenação do pulmão esquerdo e evidência histológica de lesão pulmonar após pinçamento hilar. Essa técnica pode ser prontamente aprendida e reproduzida por funcionários com e sem experiência em microcirurgia, levando a resultados confiáveis e consistentes e servindo como um modelo amplamente adotável para o estudo da IRI pulmonar.

Após o pinçamento hilar esquerdo, a pressão parcial de oxigenação no sangue arterial (PaO2) atribuída ao pulmão esquerdo é de ~100 mmHg, significativamente menor em comparação com os ~500 mmHg após toracotomia simulada (Figura 7A, n=6-7). É importante notar que toracotomias simuladas foram realizadas em camundongos B6 com medição de gasometria arterial feita após 4 min de pinçamento hilar direito, representando valores atribuídos apenas ao pulmão esquerdo. A coloração de H &amp; E do pulmão esquerdo com pinçamento hilar demonstrou infiltração de células inflamatórias que preenchem as vias aéreas e ingurgitamento dos vasos sanguíneos com eritrócitos, enquanto esses achados estão ausentes no pulmão esquerdo virgem (Figura 7B, n = 2). Esses resultados demonstram a lesão tecidual imediata e a infiltração celular após um período de isquemia e reperfusão.
Conforme discutido na etapa 6, os neutrófilos intravasculares e intersticiais podem ser diferenciados com injeção intravenosa de anticorpo anti-Ly6G marcado com FITC 5 minutos antes do sacrifício, seguido pela marcação de todos os neutrófilos com anticorpos APC-Ly6G18,24. Gráficos representativos mostram que ~ 75% dos neutrófilos são intravasculares (APC-Ly6G + FITC-Ly6G +) e ~ 25% são intersticiais (APC-Ly6G + FITC-Ly6G-) após o pinçamento hilar do pulmão esquerdo ( Figura 7C , n = 4). Esses resultados demonstram uma maneira confiável de avaliar o extravasamento de neutrófilos e podem ser adaptados a outros tipos de células, dependendo dos anticorpos usados (ou seja, anti-Ly6C para monócitos, anti-CD19 para células B). Esta técnica é útil para o estudo da dinâmica celular após o IRI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2.jpg"> Figura 1: Intubação em camundongos. (A) Rato com tórax esquerdo e abdômen raspado. (B) Tubo endotraqueal conectado ao tubo do ventilador. (C) Assim que a intubação for confirmada, prenda o tubo circunferencialmente ao nariz do camundongo. (D) Camundongo intubado com tubulação de entrada e saída de e para o ventilador de pequenos animais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig02.jpg"> Figura 2: Toracotomia esquerda. (A) Incisão na pele sobre o4º espaço intercostal (CI). (B) Camadas musculares divididas no4º espaço intercostal. (C) Fazer uma pequena incisão logo acima da5ª costela. (D) Extensão da incisão anterior e posterior no4º ICS. (E) Pulmão visualizado no4º ICS. (F-G) Afastadores de costela colocados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig03.jpg"> Figura 3: Pinça hilar esquerda. (A) Pulmão esquerdo mobilizado com cotonetes. (B) Ligamento pulmonar inferior (LIP) visualizado. (C) Com o pulmão esquerdo virado anteriormente, a gravata de seda é colocada posteriormente ao hilo. (D) Com a esquerda virada posteriormente sobre a gravata de seda, o hilo anterior é visualizado. (E) Gravata do instrumento do nó corrediço sobre o hilo esquerdo. (F) Nó corrediço no hilo. (G) Com a oclusão manual do fluxo de saída, o pulmão esquerdo não infla, indicando clamp hilar bem-sucedido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig04.jpg"> Figura 4: Liberação do pinça hilar esquerda e fechamento do tórax esquerdo. (A) Com o nó corrediço liberado, o pulmão esquerdo é reinflado. (B) Fechamento da costela com uma mordida logo acima da4ª costela e (C) uma mordida logo acima da6ª costela. (D-E) Peito fechado com um ponto amarrado no final da inspiração. (F) Fechamento da pele com pontos interrompidos (após fechamento da camada muscular com ponto corrido). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig05.jpg"> Figura 5: Laparotomia, toracotomia bilateral em concha e coleta de sangue arterial. (A) Camundongo ajustado para a posição supina. (B) Incisão na pele feita sobre a linha média do abdômen. (C) Laparotomia estendendo-se do xifóide ao púbis, com extensão esquerda e direita ao longo da costela mais inferior. (D-E) Abertura do diafragma para entrar na cavidade torácica, com extensão da incisão do diafragma à esquerda e à direita ao longo da costela inferior (linha pontilhada). (F) Toracotomia bilateral em concha com incisões nas linhas axilares anteriores (linha pontilhada) em direção ao ápice do tórax. (G) Lobo acessório do pulmão direito que se estende para o tórax esquerdo posterior à veia cava inferior. (H) Lobo acessório mobilizado e devolvido ao tórax direito. (I) Aspiração de sangue arterial do ventrículo esquerdo (inserção: diferencial de cor entre os ventrículos direito e esquerdo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig06.jpg"> Figura 6: Injeção intravenosa na veia cava inferior. (A) Rotação visceral medial direita para expor a veia cava inferior (VCI). (B) Injeção de solução em IVC. (C) Aplicar pressão sobre a VCI para obter hemostasia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig07.jpg"> Figura 7: Resultados representativos de oxigenação pulmonar, histologia e extravasamento de neutrófilos após pinça hilar esquerda. (A) Pressão parcial de oxigênio no sangue arterial de um camundongo C57BL/6 submetido a toracotomia simulada vs. pinça hilar. Os resultados são apresentados como média ± EPM, n=6-7. Valores de p calculados pelo teste U de Mann-Whitney. **p &lt;0,01. (B) Coloração H &amp; E de seção pulmonar fixada em formalina e embebida em parafina de um camundongo C57BL / 6 que foi submetido a toracotomia simulada vs. pinça hilar. A barra de escala representa 250 μm. (C) Figura representativa da distribuição de neutrófilos intravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) vs. extravasculares (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) Ly6G+ em um camundongo C57BL/6 após clamp hilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Introdutor para tubo endotraqueal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/Supplemental_Figure_1_updated.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O protocolo descreve um método viável, confiável e reprodutível de pinçamento hilar pulmonar esquerdo que pode ser usado para estudar a lesão de isquemia-reperfusão pulmonar em modelos de camundongos.

Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

Ischemia reperfusion injury (IRI) during lung transplantation is a major risk factor for post-transplant complications, including primary graft ...

Estamos interessados em estudar os efeitos da lesão de isquemia-reperfusão nos resultados após o transplante de pulmão com o objetivo de entender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes. Os neutrófilos que entram no pulmão contribuem para a lesão de isquemia-reperfusão, ou IRI. Descobrimos recentemente que as células B fazem com que os neutrófilos entrem no pulmão e desempenham um papel no recrutamento de neutrófilos após o IRI.O transplante de pulmão esquerdo no camundongo é tecnicamente desafiador e requer treinamento dedicado em tempo integral ao longo de vários meses para alcançar resultados consistentes. Além disso, introduz alergenicidade e trauma anastomótico cirúrgico. Assim, precisamos de uma técnica mais acessível que possa isolar o estudo da lesão de isquemia-reperfusão.Usando nosso modelo de grampo hilar, descobrimos que as células B entram no pulmão logo após a lesão de isquemia-reperfusão e recrutam monócitos clássicos em um receptor de células B de maneira dependente de TLR4. Em última análise, isso resulta em aumento do extravasamento de neutrófilos para o pulmão. Nosso protocolo envolve ligadura reversível do hilo pulmonar esquerdo com nó corrediço.A natureza flexível e discreta da sutura permite o fechamento do tórax, o que é útil para estudar períodos mais longos de isquemia quente, pois o fechamento do tórax minimiza as perdas de calor e fluidos insensíveis no camundongo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O trauma cirúrgico induz uma resposta inflamatória. As citocinas e ligandos endógenos são conhecidos para modular o tamanho do enfarte do miocárdio após isquemia e reperfusão. Apresentamos um modelo modificado fechado de tórax murino de isquemia e reperfusão utilizando pesos pendurados para minimizar os efeitos de toracotomia.

Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Um modelo de braçadeira hilar fígado de rato original foi desenvolvido para estudar o impacto das moléculas farmacológicas no melhoramento da lesão por isquemia-reperfusão. Este modelo inclui canulação direta da oferta de portal para o segmento fígado isquêmico através de um ramo da veia portal, permitindo a entrega hepática direta.

Método de entrega directa segmentos intra-hepática Usando um modelo de rato Liver Hilar Grampo

Nisto nós descrevemos um procedimento cirúrgico que mostra como conseguir a ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerdo-anterior nos ratos. Este modelo é de grande relevância para investigar a fisiopatologia do infarto do miocárdio e os processos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

O modelo de isperfusão de isquessões miocárdicas de coração de rato é melhorado usando um retrátil auto-fabricado, tubo de cloreto de polivinil e um método único de nó. Os resultados de eletrocardiograma, cloreto de tripheniltetrazolium e coloração histológica, e os resultados de análise de sobrevivência percentual mostraram que o grupo modelo melhorado tem maior sucesso e taxas de sobrevivência do que o grupo modelo já existente.

Modelo de roedor melhorado de Isquemia do Miocárdio e Lesão de Reperfusão

Um modelo cirúrgico de camundongo para criar lesão de reperfusão (RI) de isquemia pulmonar esquerda, mantendo a ventilação e evitando a hipóxia.

Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada

Apresenta-se aqui um procedimento cirúrgico para ligadura permanente da artéria coronária esquerda em camundongos. Este modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia e a resposta inflamatória associada após o infarto do miocárdio.

Laqueadura da Artéria Coronária Esquerda: Um Modelo Murino Cirúrgico de Infarto do Miocárdio

Este estudo descreve um modelo de lesão pulmonar aguda após isquemia-reperfusão visceral durante pinçamento cruzado da aorta supracelíaca por laparotomia em ratos. Permite a investigação dos efeitos clínicos e biológicos do pinçamento aórtico, bem como o impacto da isquemia-reperfusão nos órgãos subjacentes e lesões pulmonares remotas.

Um modelo de lesão pulmonar aguda após isquemia-reperfusão visceral por pinçamento cruzado aórtico supracelíaco em ratos

Descrevemos modelos de lesão renal por isquemia e reperfusão induzida moderada e grave em que os ratos submetidos a clampeamento do pedículo renal unilateral seguido de nefrectomia contralateral simultânea ou tardia, respectivamente. Estes modelos consistentemente dar origem a uma disfunção renal e fibrose pós-lesão, mas a gravidade da lesão e sobrevivência dependem de fundo, idade e equipamento cirúrgico mouse.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Aprenda o modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo em camundongos para estudar lesão de isquemia-reperfusão pulmonar. Este método reprodutível permite investigar os mecanismos celulares envolvendo neutrófilos e células B.

Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

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