Name: Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Aprenda a isolar células de Müller primárias da retina de camundongo usando enucleação, dissecação e cultura em meio específico. Este método permite estudar o papel dessas células gliais em doenças retinianas.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute (NEI), The National Eye Institute (NEI) fundo R01 EY029751-04. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sylvia B. Smith, pois este protocolo foi modificado com base em seu protocolo de isolamento de células de Müller.

Todos os experimentos com animais estavam em conformidade com a declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram feitos seguindo nosso protocolo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pelas políticas da Universidade de Oakland (número de protocolo 2022-1160)
1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Preparar a solução de olho de células de Müller suplementando o meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, pormenores na tabela de materiais) com penicilina/estreptomicina na diluição de 1:1000. Por exemplo, para 10 mL de DMEM, adicione 10 μL de penicilina/estreptomicina. NOTA: Este é um meio simples e sem soro preparado. Além disso, aqueça o meio completo em banho-maria a 37 °C antes de usá-lo para o trabalho de cultura de células.</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento primário completo de células de Müller suplementando o DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS, inativado pelo calor) e 1% de penicilina/estreptomicina. Por exemplo (500 mL de meio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Prepare uma solução de tripsina-EDTA a 0,05% com colagenase IV a uma concentração de 200 U / mL (a tripsina-EDTA é usada para dissolver a quantidade calculada de pó de colagenase IV para atingir a concentração necessária).</li>
</ol>2. Enucleação
<ol><li>Eutanasiar eticamente o camundongo usando a inalação de CO2 seguindo as diretrizes da IACUC.<ol><li>Resumidamente, coloque o(s) animal(is) na câmara de CO2 para introduzir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 30-70% da câmara vol/min com CO2 para atingir o objetivo de inconsciência rápida dentro de 2-3 min com o mínimo de sofrimento para os camundongos.</li>
		<li>Como os camundongos são jovens (~ 10 dias), realize a luxação cervical como método secundário para garantir a eutanásia adequada.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois de esterilizar a área de trabalho com etanol a 70%, coloque o mouse em uma almofada estéril.</li>
	<li>Extraia os olhos colocando os braços da pinça na parte de trás do olho, puxando suavemente da área orbital e enucleando os olhos aplicando pressão com uma pinça estilo 5/45 na área orbital para causar proptose. NOTA: Esterilize as ferramentas de dissecção com etanol a 70% seguido de solução salina tampão fosfato antes da dissecção.</li>
	<li>Certifique-se de que o nervo óptico ainda esteja conectado ao olho, enucleando o olho lentamente. Certifique-se de puxar o nervo óptico (visualmente identificado como um cordão branco) atrás do olho. NOTA: Esta etapa não precisa ser realizada ao microscópio e pode ser realizada em uma bancada esterilizada.</li>
</ol>3. Tratamento dos olhos enucleados
<ol><li>Cubra um tubo de centrífuga de 15 mL com papel alumínio e encha o tubo com 10 mL da solução de olho de células de Müller.</li>
	<li>Coloque os olhos dissecados no tubo de 15 ml contendo a solução ocular de células de Müller e deixe-os repousar durante a noite, ou cerca de 18 h, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 18 h, decantar a solução para os olhos e enxaguar brevemente os olhos com 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) aquecida (37 °C).</li>
	<li>Transvasar o PBS e deslocar os olhos para uma placa de Petri de 100 mm contendo 10 ml de solução de tripsina. (preparado na etapa 1.3). NOTA: A tripsina é usada em todo o olho enucleado, atuando como um agente dissociativo para facilitar a separação celular das camadas da retina durante a dissecção. A retina dissecada tem muitas células, incluindo células RPE, que são pegajosas e mais propensas a contaminar a cultura de células de Müller14. O exame microscópico demonstrou claramente que, após 5 dias de isolamento (durante a primeira troca de meio), as células do EPR se desprenderam da placa e morreram13. O meio utilizado para isolamento de EPR é o DMEM/F-12, com composição diferente do DMEM (utilizado no isolamento de células de Müller), contendo piruvato de sódio e baixo teor de glicose.</li>
	<li>Coloque o prato em uma incubadora e incube por 1,5 a 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, transfira os olhos para uma placa de Petri de 60 mm contendo cerca de 5 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: Este procedimento deve ser realizado dentro do ambiente estéril da capela de cultura. Portanto, é essencial esterilizar completamente as superfícies do exaustor com álcool 70%, juntamente com todas as ferramentas e o microscópio de dissecação. Vale ressaltar que o vídeo foi gravado fora do capô para melhor visibilidade e demonstração mais clara.
<ol><li>Coloque um pequeno pedaço de tecido esterilizado de laboratório no prato para ajudar a estabilizar os olhos durante a dissecção. Coloque os olhos sob um microscópio de dissecação para iniciar a dissecção. NOTA: O uso de tecido de laboratório facilita a manobra dos olhos em um prato cheio de líquido (meio completo), garantindo uma dissecção precisa.</li>
	<li>Use uma tesoura Vannas e uma pinça estilo M5S para remover o tecido conjuntivo, os músculos extraoculares e o nervo óptico.<ol><li>Segure o olho com uma pinça estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata com uma tesoura Vannas ou uma agulha de seringa. NOTA: Existe uma linha circular azul clara entre a parte anterior e posterior do olho chamada ora serrata, que pode ser usada como um ponto de referência para uma direção precisa durante a dissecção.</li>
		<li>Segure a incisão com uma pinça estilo M5S e puxe ou rasgue a córnea da parte posterior do olho. Puxe em pequenos incrementos para garantir que a integridade da retina permaneça intacta. NOTA: Essas etapas são para remover a parte anterior do olho (córnea, íris e cristalino) da parte posterior da ocular (retinas neurais e pigmentadas).</li>
		<li>Para manter a integridade das camadas da retina, puxe suavemente e remova o epitélio pigmentado da retina da retina neural. A retina neural deve estar livre de manchas pretas para garantir a pureza do isolamento o máximo possível, pois a camada de EPR geralmente é pegajosa e presa à retina neuronal.</li>
		<li>Corte a retina neural dissecada em pequenos pedaços antes de coletá-la em uma placa para garantir uma distribuição homogênea das células na placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar as retinas neurais em um frasco T25 contendo 4 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.</li>
	<li>Por fim, colocar o balão numa incubadora e incubar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>5. Cultura de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Não mova o frasco por 3-5 dias para promover o crescimento celular.</li>
	<li>Troque a mídia após o quinto dia e a cada dois dias até que as células estejam 90% confluentes.</li>
</ol>6. Passagem de células gliais primárias de Müller
<ol><li>Aspirar o meio de cultura de células de Müller, seguido de 2 ml de lavagem em PBS, e aspirar o PBS. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (1x), ou o suficiente para cobrir a placa.</li>
	<li>Incube por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que as células estejam separadas da placa sob o microscópio. Em seguida, recolha a suspensão celular e adicione 4 ml de meios de crescimento primários completos de células de Müller pré-aquecidos (37 °C) (preparados no passo 1.2) ao tubo de recolha.</li>
	<li>Centrifugue por 7 min a 300 x g. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller. Como o número de células pode variar de acordo com o número de olhos dissecados, é melhor contar as células antes da semeadura e incubação. A densidade de semeadura recomendada é de 3,0 x 106 células em um balão T75. NOTA: As células podem ser passadas até 4-5 vezes. No entanto, os resultados mais consistentes do experimento são encontrados após 1-2 passagens.</li>
</ol>7. Imunofluorescência
NOTA: Use o protocolo de imunofluorescência para corar e validar a especificidade das células de Müller. Aqui está uma breve visão geral do protocolo de imunofluorescência. Esta etapa é realizada após a primeira passagem12.
<ol><li>Semeie as células em uma lâmina de câmara de cultura celular (30.000 células por poço para uma lâmina de câmara de 8 poços).</li>
	<li>Cultivar as células isoladas durante 24-48 h num meio de cultura de células Müller completo (preparado no passo 1.2) a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire o meio e lave a lâmina da câmara com 250-300 μL de 1x PBS em cada poço quando as células estiverem 80-90% confluentes.</li>
	<li>Fixe a lâmina por 10 a 15 min em 250-300 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço, seguido de lavagem com PBS / TX-100 (5 min cada / 3x).</li>
	<li>Adicionar tampão de bloqueio durante 1 h a 37 °C (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aspirar a solução de bloqueio e, em seguida, adicionar os anticorpos primários específicos para as células de Müller para confirmar a pureza das células isoladas utilizando glutamina sintetase e vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando uma concentração de anticorpos de 1:100-1:200 em tampão de bloqueio num volume de 150-200 μL/lâmina). Lave a lâmina com PBS/TX-100 lavagens (5 e 10 min cada). NOTA: Esses anticorpos foram escolhidos por serem características para identificar células de Müller e garantir o sucesso e a pureza da cultura de células de Müller.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário (com uma concentração de anticorpos variando de 1:1000 em tampão de bloqueio em 150-200 μL / lâmina) e incube por 1 h a 37 ° C. Em seguida, lave com PBS / Triton X-100, três vezes (5-10 min cada).</li>
	<li>Aplique uma gota de meio de montagem DAPI para rotular os núcleos antes de cobrir a lâmina com uma lamínula. Evite bolhas de ar ao colocar a lamínula.</li>
	<li>Use um microscópio fluorescente para verificar a lâmina e capturar imagens (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: As células estão localizadas com DAPI em ex/em 359/461 com ampliação de 10x para localizar células; maior ampliação pode capturar células. Outros comprimentos de onda dependeriam da cor escolhida. Cor verde (GFP) - ex/em 488/510. Cor vermelha (Cy3) - ex / em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
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<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
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<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relevantes para o conteúdo deste artigo.

O isolamento do epitélio pigmentado primário da retina (EPR) de camundongos foi previamente documentado por nosso laboratório. Este manuscrito descreve um protocolo de demonstração detalhado para o isolamento primário de células de Müller. Este procedimento envolve enucleação, tratamento, dissecação, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células de Müller isoladas de olhos de camundongos. Baseia-se em um protocolo previamente bem-sucedido encontrado em publicações anteriores e em nosso protocolo modificado que u...

As células de Müller (MCs) são as principais e mais abundantes células gliais encontradas no tecido retiniano. Eles são os principais atores no fornecimento de integridade estrutural e funções metabólicas dentro da retina1. A estrutura estratégica dos MCs está espalhada por toda a espessura da retina, fornecendo suporte à retina. Além de suas propriedades semelhantes a andaimes, eles têm funções metabólicas para os neurônios da retina, fornecendo-lhes substratos energéticos, incluindo glicose e lactato. Essas funções são cruciais para manter a função neuronal saudável. Foi relatado que MCs prejudicados contribuem para várias doenças da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética e glaucoma 2,3. Os MCs podem ser fontes celulares endógenas para terapia regenerativa na retina1. Eles também compreendem uma porção significativa da retina, e fortes evidências sugerem que, em várias espécies, essas células podem ser estimuladas a substituir os neurônios ausentes2. Eles colaboram beneficamente com os neurônios, e os pés finais das células de Müller com ramificações cônicas desembainham densamente os vasos sanguíneos e conectam os componentes neurais da retina. Para manter o desenvolvimento neuronal e a plasticidade neuronal, as células de Müller atuam como um substrato macio para os neurônios, protegendo-os de traumas mecânicos3. Além disso, em circunstâncias patológicas, as células de Müller podem se diferenciar em progenitores neurais ou células-tronco que replicam ou regeneram os fotorreceptores e neurônios perdidos 2,3,4. As células de Müller mantêm as características das células-tronco da retina, incluindo diferentes níveis de potencial de auto-renovação e diferenciação 5,6. A célula glial de Müller tem uma linhagem retiniana significativa que produz fatores neurotróficos, capta e recicla neurotransmissores, tampona espacialmente os íons e mantém a barreira hemato-retiniana para manter a retina em homeostase 7,8,9. Isso destaca o potencial das células de Müller como uma ferramenta promissora em terapias baseadas em células para o tratamento de doenças relacionadas à degeneração da retina. As células de Müller são a glia primária distribuída por toda a retina, conectando-se a neurônios e vasos sanguíneos. Eles desempenham um papel protetor crucial, fornecendo suporte estrutural e metabólico essencial para manter a viabilidade e estabilidade das células da retina. Infelizmente, muito poucos protocolos são encontrados na literatura para isolamento primário de células de Müller da retina10,11.
Apresentamos uma abordagem aprimorada para isolar e cultivar de forma confiável células primárias de Müller de camundongo. Este protocolo foi usado em nosso grupo para isolar células de Müller de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem e camundongos transgênicos12,13. Camundongos com idade entre 5 e 11 dias, sem preferência sexual, são utilizados para este protocolo. As células foram passadas até 4 vezes; no entanto, em P4 eles param de aderir ao frasco e torna-se difícil cultivar uma cultura saudável. A cultura é frequentemente contaminada com células epiteliais pigmentadas da retina (RPE), portanto, as células devem ser passadas pelo menos uma vez antes de realizar qualquer experimento adicional na linha celular. A passagem permite um maior isolamento de contaminantes. Portanto, o protocolo apresentado oferece uma maneira rápida e eficaz de isolar células de Müller de camundongos, que podem ser usadas como uma plataforma confiável para pesquisar alvos terapêuticos e avaliar possíveis tratamentos para doenças da retina14.

<table><tbody><tr><td>Copo : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduada Descartáveis :3.2mL Estéril</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media para desenvolver M&uuml; células de Ller</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Para meio de cultura celular completo</td></tr><tr><td>Muller Glutamina sintase</td><td>Sinalização celular</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td> Seringa Luer-Lok <td>34155</td><td></td>da <td>Kimberly-Clark</td></tr><tr><td>com agulha anexada 21 G x 1 1/2 pol., estéril, uso único, 3 mL</td><td>B-D</td><td></td><td></td>309577</tr><tr><td>Tubo de Micro Centrífuga: 2 mL</td><td>Caneta Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Para M&uuml completo; meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer salino (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td></tr><tr><td>Pinças de Ação Positiva AP, Estilo 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Iris Standard Reta 11.5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall St8</td><td>Microscópio</td><td>ThermoScientific 75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305</td> Lâmina Cirúrgica <td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>, #11, Aço Inoxidável</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Suspensão 60mm x 15mm Estilo</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Tecidos: 100x20mm estilo</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Tornado: 15mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Tornado: 50mL</td><td>Pinças Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>5MS, 8.2cm, Retas, 0.09x0.05mm Pontas</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Positive Action Style 5, Biológicas, Dumostar, Acabamento Polido, 110 mm OAL</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads, Moderado: 23" X 36"</td><td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas - 2.5mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células primárias de müller glial da retina de camundongo

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

A principal célula de suporte da retina é a célula glial de Müller da retina. Eles cobrem toda a superfície da retina e estão próximos dos vasos sanguíneos da retina e dos neurônios da retina. Devido ao seu crescimento, as células de Müller realizam várias tarefas cruciais em uma retina saudável, incluindo a captação e reciclagem de neurotransmissores, compostos de ácido retinóico e íons (como potássio K + ). Além de regular o fluxo sanguíneo e manter a barreira hemato-retiniana, eles também regulam o metabolismo e o fornecimento de nutrientes para a retina. Um procedimento estabelecido para isolar células primárias de Müller de camundongo é apresentado neste manuscrito. Para entender melhor os processos moleculares subjacentes envolvidos nos vários modelos de camundongos de distúrbios oculares, o isolamento de células de Müller é uma excelente abordagem. Este manuscrito descreve um procedimento detalhado para o isolamento de células de Müller de camundongos. Da enucleação à semeadura, todo o processo dura cerca de algumas horas. Por 5-7 dias após a semeadura, o meio não deve ser alterado para permitir que as células isoladas cresçam sem impedimentos. A caracterização celular usando morfologia e marcadores imunofluorescentes distintos vem a seguir no processo. As passagens máximas para as células são de 3 a 4 vezes.

Validação da especificidade, pureza e função de barreira de células de Müller isoladas Para confirmar a viabilidade, morfologia e qualidades distintivas das células de Müller isoladas, as células foram examinadas ao microscópio óptico. As imagens P0 e P1 foram registradas (Figura 1A). Para verificar a contaminação das células de Müller isoladas com células RPE e confirmar sua pureza, a coloração por imunofluorescência (IF) foi realizada usando anticorpos específicos para ...

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Este vídeo demonstra a cultura de células gliais de Müller (MG) isoladas de retinas de camundongos. As retinas são dissociadas em uma suspensão unicelular usando enzimas digestivas. As células são então cultivadas em um meio com um fator de crescimento que promove a proliferação de células MG e a mortalidade celular neuronal. As células neuronais mortas são removidas durante a passagem e as células MG são cultivadas para análise posterior.

Estabelecendo uma cultura de células gliais de Müller obtida de retinas de camundongos

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Aqui, descrevemos o isolamento de células gliais-entérico da submucosa intestinal-usando sequencial incubação do EDTA para quelato cátions divalentes e, em seguida, incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos. Chapeamento da suspensão de células resultante na poli-D-lisina e laminina resulta em uma cultura altamente enriquecida de células gliais submucosas para análise funcional.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar células primárias de Müller retinianas de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais. O procedimento inclui enucleação dos globos oculares, dissecção do tecido retiniano, extração e identificação de células e considerações importantes para a cultura de células subsequente.

Isolamento e cultura de células Müller primárias da retina de ratos Sprague-Dawley (SD)

Aprenda a isolar células de Müller primárias da retina de camundongo usando enucleação, dissecação e cultura em meio específico. Este método permite estudar o papel dessas células gliais em doenças retinianas.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

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