Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

As células de Muller são as principais células gliais da retina. Eles desempenham um papel muito importante para manter os neurônios altamente metabolicamente ativos da retina. Nosso laboratório estabeleceu uma técnica para isolar células de Muller de olhos de camundongos. Esta técnica permitirá estudar o papel das células de Muller em diferentes doenças da retina, entender a patogênese das doenças e também desenvolver alvos terapêuticos.

[Narrador] Eutanasiar eticamente o rato de acordo com os métodos aprovados pela sua instituição. Enuclee os olhos pressionando uma pinça estilo 5/45 na área orbital para induzir a proptose, seguido de extração do olho posicionando os braços das pinças na parte posterior do olho, seguido de puxar suavemente da área orbital. Coloque os olhos em 10 mLs da solução de olho de célula de Muller e deixe-os descansar durante a noite ou por cerca de 18 horas em temperatura ambiente. Após 18 horas, transvase a solução para os olhos, despejando-a para fora do tubo a ser descartado. Lave os olhos com solução salina tamponada com fosfato aquecido ou PBS. Transvase novamente o PBS despejando-o para fora do tubo a ser descartado. Em seguida, coloque os olhos em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mL da solução de tripsina. Coloque o prato em uma incubadora e incube por 1,5 a 2 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após a incubação, transfira os olhos para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo cerca de cinco mLs de meio de crescimento de células de Muller primário completo. Vale ressaltar que o vídeo foi gravado fora do capô para melhor visibilidade e demonstração clara. Para experimentos reais, eles devem ser conduzidos em uma capela de fluxo laminar, conforme mostrado. Coloque os olhos sob um microscópio de dissecação e comece a dissecar. Use uma pinça estilo M5S e uma tesoura Vannas para remover o tecido conjuntivo, os músculos extraoculares e o nervo óptico. Aqui, o nervo óptico é cortado com uma tesoura Vannas. Segure o olho com uma pinça estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata com uma tesoura Vannas ou a agulha de uma seringa. Segure a incisão com duas pinças estilo M5S e comece a puxar ou rasgar a córnea da parte posterior do olho. Puxe em pequenos incrementos para garantir que a integridade da retina permaneça intacta. Aqui está uma demonstração de como remover a córnea da parte posterior da ocular. Assim que o cristalino e a retina neural estiverem expostos, remova a camada pigmentada do olho, que provavelmente tem a íris aderida a ela. Em seguida, remova a retina neural do cristalino. Remova qualquer tecido pigmentado da retina neural para aumentar a pureza do isolamento. Dada a natureza pegajosa da retina neural, será improvável que você remova todo o tecido pigmentado. Colete todas as retinas neurais e rasgue-as em pedaços menores. Coloque as retinas neurais em um frasco T25 contendo quatro mLs de meios de crescimento de células de Muller primários completos. Finalmente, coloque o frasco em uma incubadora e incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2. O painel A mostra uma cultura de células de Muller saudável na passagem zero e na passagem um. A falta de pigmento indica a ausência de células RPE, que é o principal contaminante no isolamento. Isso é reforçado no painel B com RP65, um marcador específico de RP.