Name: Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a estudar a evolução de microrganismos termofílicos usando Sulfolobus acidocaldarius em experimentos controlados. Este protocolo de alta vazão com termomixers permite analisar respostas evolutivas em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de evolução experimental para adaptação termófila utilizando termomixers de baixo custo

<ol><li>Nisbet, E. G., Sleep, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+habitat+and+nature+of+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The habitat and nature of early life.</a> Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).</li>
<li>Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Beagle+in+a+bottle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li>
<li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li>
<li>McDonald, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+experimental+evolution+-+a+proving+ground+for+evolutionary+theory+and+a+tool+for+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery.</a> EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).</li>
<li>Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design%2C+population+dynamics%2C+and+diversity+in+microbial+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).</li>
<li>McCarthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+limits+of+thermoacidophily+in+the+archaeon+Sulfolobus+solfataricus+by+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution.</a> Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+question+of+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea.</a> Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).</li>
<li>Whitaker, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+through+the+lens+of+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mineral+Geochem%22%5BJournal%5D)">Population dynamics through the lens of extreme environments.</a> Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ss-LrpB%2C+a+novel+Lrp-like+regulator+of+Sulfolobus+solfataricus+P2%2C+binds+cooperatively+to+three+conserved+targets+in+its+own+control+region%3A+Ss-LrpB-operator+interactions+for+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation.</a> Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).</li>
<li>Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus+-+A+potential+key+organism+in+future+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology.</a> Front Microbiol. 8, 2474(2017).</li>
<li>Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+Bioprospecting+extremophiles+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Inst+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology.</a> J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Sulfolobus+acidocaldarius%2C+a+model+organism+of+the+Crenarchaeota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota.</a> J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).</li>
<li>Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+Sulfolobus+acidocaldarius+in+a+controlled+bioreactor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).</li>
<li>Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heat+shock+response+for+the+thermoacidophilic+model+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophiles+and+the+problem+of+DNA+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophiles and the problem of DNA instability.</a> Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%3A+Persistent+gaps+and+other+reasons+to+focus+on+the+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork.</a> Archaea. 2015, 942605(2015).</li>
<li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+dangerous+missense%3A+Thermophiles+display+especially+low+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates.</a> PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).</li>
<li>Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fidelity+under+harsh+conditions%3A+Analysis+of+spontaneous+mutation+in+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+genetic+tool+box+for+the+Crenarchaeote+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius.</a> Front Microbiol. 3, 214(2012).</li>
<li>Suzuki, S., Kurosawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+gene+encoding+restriction+endonuclease+SuaI+and+development+of+a+host-vector+system+for+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).</li>
<li>Baes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+translational+dynamics+underlying+heat+shock+response+in+the+thermophilic+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> mBio. 14 (5), e0359322(2023).</li>
<li>González, A. G., Pérez Y Terrón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+extremophilic+microorganisms+in+biogeochemical+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22GSC+Adv+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles.</a> GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).</li>
<li>Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus%3A+A+new+genus+of+sulfur-oxidizing+bacteria+living+at+low+pH+and+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Mikrobiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature.</a> Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).</li>
<li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+experimental+evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+divergence+during+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Nat%22%5BJournal%5D)">Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations.</a> Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li>
<li>Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms">https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms</a> (2018).</li>
<li>Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+population+bottlenecks+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution.</a> Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).</li>
<li>Bernander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+Sulfolobus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of Sulfolobus.</a> Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+and+the+fate+of+beneficial+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li>
<li>Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+sfGFP+variants+with+improved+and+reliable+functionality+in+industrially+important+thermophilic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria.</a> Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).</li>
<li>Visone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+protein+imaging+in+thermophilic+archaea+by+exploiting+a+novel+protein+tag%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag.</a> PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).</li>
<li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; filtros de membrana acionados por seringa m</td><td>StarLab</td><td>E4780-1226</td><td>Para componentes de meios de esterilização de filtros que não podem ser autoclavados.</td></tr><tr><td>1 &mu; L loops de inoculação</td><td>Greiner</td><td>731161, 731165 ou 731101</td><td>Para inocular culturas. Outros loops podem ser usados.</td></tr><tr><td>1000 &mu; Ponteiras de pipeta L</td><td>StarLab</td><td>S1111-6811</td><td>Outras ponteiras de pipeta podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 mL</td><td>StarLab</td><td>S1620-2700</td><td>Para cultura S. acidocaldarius em termomixers.</td></tr><tr><td>200 &mu; Ponteiras de pipeta L</td><td>StarLab</td><td>S1111-0816</td><td>Outras ponteiras de pipeta podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 50 mL com fundo cônico</td><td>Corning</td><td>430828 ou 430829</td><td>Outros tubos podem ser usados. Verifique o desempenho a 75 ° C. Tubos com tampas de vedação de plugue podem não permitir aeração suficiente; Verifique antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de 50 mL</td><td>BD plastipak</td><td>300865</td><td>Para uso com filtros acionados por seringa.</td></tr><tr><td>Placas de microtitulação de 96 poços (não tratadas, fundo plano)</td> <td>Nunc</td><td>260860</td><td>Para medir OD a 600 nm em espectrofotômetro.</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal de largura ajustável</td><td>Pipet-Lite</td><td>LA8-300XLS</td><td>Opcional, mas economiza tempo na transferência entre microcentrífuga e placas de 96 poços.</td></tr><tr><td>Sulfato de amónio ((NH4)2SO4)</td><td>Millipore</td><td>168355</td><td>Para solução de reserva de Brock I.</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Priorclave</td><td>B60-SMART ou SV100-BASE</td><td>Outras autoclaves também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Membrana de vedação permeável a gás Breathe-EASY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>Corte à medida para uso em tubos de microcentrífuga perfurados. Se substituir outros memrbanes permeáveis a gás, certifique-se de que o desempenho seja adequado a 75 & C</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Para solução de estoque Brock I.</td></tr><tr><td>CELLSTAR Placas de seis poços (suspensão/não tratadas)</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>As placas de seis poços de outros fabricantes provavelmente podem ser substituídas. Verifique o desempenho em altas temperaturas.</td></tr><tr><td>Sulfato de cobalto (II) heptahidratado (CoSO4&middot; 7H2O)</td><td>Supelco</td><td>1025560100</td><td>Para solução de estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Cloreto de cobre (II) di-hidratado (CuCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td>Para solução estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose anidra (C6H12O6)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11462858</td><td>Outros açúcares pentose e hexose também podem ser usados (por exemplo, D-xilose, D-arabinose). A glicose não é uma fonte de carbono preferida para S. acidocaldarius (SV Albers, comunicação pessoal)</td></tr><tr><td>Água bidestilada (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101.1000</td><td>Gelrite (goma gelana) é usada no lugar do ágar para fazer meios sólidos devido ao seu maior ponto de fusão.</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidro de 100 mm</td><td>Marca</td><td>BR455742</td><td>As placas de Petri de vidro são usadas porque a maioria das placas de Petri de poliestireno padrão de 90 mm se deformam a 75 &graus; C (dependente da marca). Alternativamente, podem ser utilizadas placas de seis poços, uma vez que não se deformam a altas temperaturas.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>New Brunswick</td><td>Innnova 42R</td><td>Outras incubadoras também podem ser usadas. Verifique a temperatura de operação do equipamento antes da compra/uso, pois muitas incubadoras não são capazes de temperaturas superiores a 65 ° C.</td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl3&middot; 6H2O)</td><td>Supelco</td><td>103943</td><td>Para Solução Estoque de Fe</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (sal de Epsom) (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Para solução estoque de Brock I.</td></tr><tr><td>Cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MnCl2&middot; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIALM5005-100G</td><td>Para solução estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Mini Tomada Wi-Fi Inteligente, Monitoramento de Energia</td><td>Tapo</td><td>Tapo P110</td><td>Para monitorar o consumo de energia&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Z-Amina A - Hidrolisado enzimático de caseína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0626-500G</td><td>N-Z-Amine-A é usado como fonte de aminoácidos.</td></tr><tr><td>Clipe de papel (ou outro fio resistente)</td> <td>nenhum</td><td>nenhum</td><td>Para perfurar tubos de microcentrífuga de 2 mL.</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio (fosfato monopotássico) (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Para solução estoque Brock I.</td></tr><tr><td>Kit de Purificação de DNA Genômico Promega Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Opcional, para extrair DNA genômico em laboratório</td></tr><tr><td>Molibdato de sódio di-hidratado (Na2MoO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651-100G</td><td>Para solução estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Tetraborato de sódio decahidratado (bórax) (Na2B4O7&middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>Para solução estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>BMG</td><td>SPECTROstar OMEGA</td><td>Para medir OD a 600 nm. Outros espectrofotômetros que podem ler OD a 600 nm podem ser usados.</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (diluído na proporção de 1:1 com água) (H2SO4)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11337588</td><td>Usado para ajustar o pH da solução estoque de Brock II/III para um pH final de 2-3.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>DLab</td><td>HM100-Pro</td><td>Outros thermomixers também podem ser usados; a principal consideração é a capacidade de manter 65&ndash; 75 &deg; Temperaturas C e 400 RPM</td></tr><tr><td>Uracil (C4H4N2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>A deleção de pyrE é um marcador genético comum usado em S. acidocaldarius. As cepas de deleção devem ser suplementadas com uracila para crescimento. A suplementação não é estritamente necessária para a cepa do tipo selvagem DSM639, mas está incluída aqui, pois experimentos futuros podem envolver cepas de deleção.</td></tr><tr><td>Sulfato de vanadil di-hidratado (VOSO4&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204862</td><td>Para solução de estoque de oligoelementos.</td></tr><tr><td>Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>para solução estoque de oligoelementos.</td></tr></tbody></table>

adaptação nos extremos da vida: evolução experimental com o arqueão extremófilo sulfolobus acidocaldarius

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Medições da curva de crescimento As curvas de crescimento para S. acidocaldarius DSM639 são mostradas na Figura 3A. O crescimento foi semelhante quando se comparou a incubação usando termomisturadores com a de incubadoras convencionais. Os parâmetros da taxa média de crescimento foram estimados ajustando-se uma curva logística a cada curva de crescimento replicada e calculando-se a média e o erro padrão. Os tempos até a fase exponencial média no termomixer e na incubadora foram de 27,2 h ± 1,1 h e 31,1 h ± 1,9 h, respectivamente. Os tempos de duplicação iniciais estimados para o termomixer e a incubadora a 75 °C foram de 4,29 h ± 0,28 h e 4,19 h ± 0,44 h, respectivamente, o que é consistente com os valores publicados anteriormente24. A relação entre log10 (OD600nm) e log10 (CFU) foi bem caracterizada por um modelo linear (R2 ajustado = 0,82, F (1,22) = 104, p &lt; 0,00001, inclinação = 1,73 ± 0,17, intercepto = 9,73 ± 0,14). A relação entre OD600nm e UFC é, portanto, dada pela fórmula UFC = 10 (1,73 × log10 (OD600nm) + 9,73). Um OD600nm de 0,3 corresponde, portanto, a aproximadamente 6,7 × 108 UFC/mL (Figura 3B).
Experiência de evolução de temperatura Três condições de temperatura, constante de 75 °C, constante de 65 °C e queda de temperatura (75-65 °C, diminuindo 1 °C a cada duas transferências), foram iniciadas usando sete linhagens independentes derivadas de S. acidocaldarius DSM639. As medições de OD600nm foram feitas após cada transferência durante os 45 dias do experimento (aproximadamente 150 gerações a 75 ° C) e são mostradas na Figura 4. As medições de OD600nm feitas ao longo dos dias são inerentemente barulhentas, pois podem estar sujeitas a diferenças sutis, por exemplo, no período de crescimento, temperatura, etc. No entanto, as medições feitas ao longo dos dias ainda podem ser úteis para avaliar a viabilidade da população, bem como dar uma indicação sobre se o condicionamento físico está melhorando ao longo do tempo. As linhagens da condição constante de 75 ° C aumentaram em OD600nm de uma faixa inicial de 0,125-0,3 para uma faixa de 0,248-0,471 até o final do experimento. Isso sugere que o condicionamento físico melhorou com este tratamento. Em contraste, as linhagens do tratamento constante de 65 ° C exibiram uma queda no OD600nm, de uma faixa inicial de 0,018-0,087 para 0,008-0,04 no ponto de tempo final. Isso sugere que as populações não foram capazes de se adaptar à temperatura constante de 65 ° C, embora o fato de organismos viáveis poderem ser recuperados mostre que as populações não foram eliminadas por diluições sucessivas, sugerindo algum grau de adaptação. Finalmente, as populações no tratamento de queda de temperatura aumentaram da faixa inicial de600 nm de diâmetro externo de 0,099-0,279 para 0,3-0,39 em Tx6 (correspondendo a 288 h e 73 ° C neste tratamento), seguido por uma diminuição constante para uma faixa de 0,003-0,024 no ponto de tempo final.
Ensaios de crescimento/aptidão Ensaios de aptidão foram realizados para cada população descendente após os experimentos de evolução. O OD600nm foi testado após 48 h de crescimento para todas as sete linhagens independentes, seguido pelo ajuste de modelos lineares em R para cada temperatura de ensaio, com 'ambiente de seleção' como efeito principal e 'replicar/termomisturador' como efeito de bloco. O crescimento da cepa ancestral foi usado como nível de referência para contrastes de tratamento. Os dados são mostrados na Figura 5.
Quando testado a 75 ° C, houve em média aumentos significativos na aptidão em relação à cepa ancestral para linhagens dos tratamentos constantes de 75 ° C (teste t: t210 = 3,64, p = 0,0003) e constantes de 65 ° C (teste t: t210 = 2,8, p = 0,005), mas não do tratamento de queda de temperatura (teste t: t210 = −0,87, p=0,38). Quando testadas a 65 °C, em média, as linhagens de todos os tratamentos apresentaram um aumento na aptidão (linhagens constantes de 75 °C; teste t: t210 = 4,68, p &lt; 0,0001, linhagens constantes de 65 ° C; teste t: t210,=4,24, p&lt;0,0001, linhagens de queda de temperatura; teste t: t210 = 3,15, p = 0,002). No entanto, para ambas as temperaturas do ensaio, houve diferenças consideráveis entre as linhagens em sua aptidão (Figura 5). Algumas linhagens não diferiam consideravelmente da linhagem ancestral ou diminuíram em aptidão; Isso foi particularmente evidente para linhagens do tratamento de queda de temperatura.
Vale a pena notar que a relação entre OD600nm e UFC/mL pode ter mudado durante o experimento de evolução. Isso pode ser avaliado determinando parâmetros de crescimento para linhagens evoluídas (seguindo as etapas 3.1-3.10).
Resultados do sequenciamento do genoma completo A análise do genoma completo foi realizada usando breseq (versão 0.38.1)25 nas sete linhagens da condição constante de 75 ° C usando o genoma de referência de S. acidocaldarius DSM639 (acesso RefSeq NC_007181.1). Uma variedade de mutações foi revelada envolvendo inserções, deleções e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) nos genomas de todas as linhagens descendentes (Tabela 2). Múltiplas inserções e mutações não sinônimas ocorreram em genes codificadores de proteínas, bem como regiões intergênicas que podem influenciar a expressão gênica devido a mudanças de quadro nas regiões promotoras dos genes. Algumas das mutações foram consistentes em várias linhagens descendentes em genes envolvidos em várias funções, como biossíntese da parede celular, transcrição, metabolismo, transporte celular e atividade catalítica (Tabela 2). Entre essas mutações estava uma grande deleção de 54.667 pares de bases em cinco das sete linhagens; Isso foi confirmado por um gráfico de evidência de cobertura ausente para cada população (frequência variando de 93,2% a 100%). A região excluída equivale a uma perda de 53 genes; Os papéis desses genes na adaptação serão investigados em estudos futuros. Algumas diferenças foram observadas entre o isolado usado de DSM639 e a sequência de referência publicada (mostrada na Tabela Suplementar 1).
Consumo de energia da incubadora agitada versus termomixer O consumo de energia de uma incubadora agitada foi comparado a um termomixer usando um plugue inteligente de monitoramento de energia disponível comercialmente em uma faixa de temperaturas de incubação comuns e a temperatura de 75 °C usada aqui. A 75 °C, o termomisturador consumiu aproximadamente 1/40da energia de uma incubadora de agitação tradicional (Figura 6), sugerindo os termomisturadores como um meio potencial de reduzir a pegada de carbono associada à evolução experimental.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig01v2.jpg"> Figura 1: Fluxograma ilustrando o protocolo do experimento de evolução em três tratamentos de temperatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig02v2.jpg"> Figura 2: Fluxograma ilustrando as etapas do protocolo de ensaio de crescimento/aptidão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig03.jpg"> Figura 3: Determinação dos principais parâmetros de crescimento e comparação de dispositivos de incubação para S. acidocaldarius DSM639. Três culturas replicadas foram cultivadas a 75 °C em 7 tubos separados. A amostragem destrutiva foi usada para medir (A) OD600nm (média ± erro padrão de n = 3 réplicas técnicas; algumas barras de erro são menores do que os símbolos de plotagem); as curvas representam modelos de crescimento logístico ajustados e (B) unidades formadoras de colônias (UFCs); linhas representam modelos de regressão linear log-log ajustados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para densidades ópticas (OD600nm) obtidas durante experimentos de evolução. Densidades ópticas de linhagens independentes medidas durante os experimentos de evolução sob três tratamentos de temperatura (constante 65 ° C, constante 75 ° C, queda 75 ° C-65 ° C) conduzidos ao longo de aproximadamente 150 gerações. As curvas retratam as suavizações de Loess ao longo do tempo para cada linhagem independente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos para ensaios de crescimento. Ensaios de crescimento para linhagens independentes derivadas de S. acidocaldarius DSM639 após experimentos de evolução de temperatura (constante 65 ° C, constante 75 ° C, queda 75 ° C-65 ° C) em comparação com a cepa ancestral. Para todas as linhagens, o crescimento foi testado a 65 °C e 75 °C. Os pontos coloridos mostram a média ± o erro padrão das réplicas técnicas (mostrado em cinza, n = 12 para o ancestral e n = 3 para cada linhagem evoluída). A barra cinza denota a média ± erro padrão da aptidão ancestral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig06.jpg"> Figura 6: Consumo de energia de incubadoras tradicionais versus dispositivos termomisturadores. O consumo de energia foi registrado usando um plugue inteligente de monitoramento de energia disponível comercialmente durante 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Receitas de mídia e soluções de estoque necessárias para cultivar S. acidocaldarius. Todos os meios e soluções de estoque devem ser feitos com H2O (ddH2O) e depois esterilizados por autoclavagem ou esterilização por filtro através de um filtro de 0,22 μm, conforme indicado. Consulte a seção 1 do protocolo para obter uma descrição detalhada de como preparar todas as soluções de mídia e estoque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Resultados representativos para o sequenciamento do genoma completo de linhagens descendentes. Mutações encontradas em linhagens descendentes descendentes de S. acidocaldarius DSM639 de tratamento constante a 75 °C. As mutações indicam mudanças em relação ao ancestral direto da linhagem, que possui várias mudanças em relação à sequência de referência para S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutações no ancestral são mostradas na Tabela Suplementar 1). n indica o número de linhagens nas quais uma mutação foi encontrada. → gene no 'quadro de leitura direta'; ← gene no 'quadro de leitura reversa'. †Essas mudanças são relativas a um deslocamento de quadro (A) 10→11 presente no isolado de S. acidocaldarius DSM639 (Tabela Suplementar 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela suplementar 1: Mutações presentes no isolado de S. acidocaldarius DSM639 em relação à sequência de referência (acesso RefSeq NC_007181.1). → gene no 'quadro de leitura direta'; ← gene no 'quadro de leitura reversa'. ‡SACI_RS04020 é anotado como um pseudogene em NC_007181.1, mas a mutação frameshift Δ1 bp observada aqui supostamente restaura sua função, pois com a mutação, ela codifica uma proteína com 100% de identidade ao gene da girase reversa rgy (acesso RefSeq WP_176586667.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Supplementary%20Table-1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...

adaptation-at-extremes-life-experimental-evolution-with-extremophile

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Aqui nós relatamos a geração de Tre recombinase através dirigido evolução, molecular. Tre recombinase reconhece uma seqüência alvo pré-definido dentro das sequências LTR do pró-vírus HIV-1, resultando na excisão e erradicação do provírus de células humanas infectadas. Enquanto ainda em sua infância, dirigido a evolução molecular irá permitir a criação de enzimas personalizadas que servirão como ferramentas de cirurgia e medicina molecular molecular.

Evolução Molecular do Recombinase Tre

Neste protocolo, apresentamos um método para...

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

A luz de xenônio não coerente foi passada através de interferência de banda estreita e filtros de densidade neutra para fornecer luz de comprimento de onda e intensidade variados para células cultivadas. Este protocolo foi usado para avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha / infravermelha próxima na produção de espécies reativas in vitro: nenhum efeito foi observado usando os parâmetros testados.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

Aprenda a estudar a evolução de microrganismos termofílicos usando Sulfolobus acidocaldarius em experimentos controlados. Este protocolo de alta vazão com termomixers permite analisar respostas evolutivas em tempo real.

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Explorar mais vídeos