Name: Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a integrar modelos in vitro e in silico para descoberta de medicamentos usando organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Este método combina tecnologia de células-tronco e microfluídica para investigar interações droga-doença.

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Os autores reconhecem o treinamento anterior e as recomendações gerais sobre o início do trabalho com hiPSC e organoides dos Drs. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D'Souza. Eles agradecem à Dra. Chelsey Simmons por sua orientação no uso de sistemas de hidrogel para trabalhos de cultura de células in vitro . Além disso, os autores gostariam de agradecer aos Drs. Christine Rodriguez e Thomas Allison, da STEMCELL Technologies, por sua orientação sobre a cultura hiPSC. Os autores também agradecem à TheWell Bioscience por cobrir os custos de publicação.

Comparação de matriz para geração eficiente de organoides intestinais humanos a partir de iPSCs

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).</li>
<li>Hinz, B., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis%3A+Recent+advances+in+myofibroblast+biology+and+new+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives.</a> F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).</li>
<li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li>
<li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis%3A+A+dynamic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li>
<li>Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+control+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix control of stem cell fate.</a> Cell. 126 (4), 645-647 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Tran, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+extracellular+matrix+directs+trans-differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+and+formation+of+salivary+gland-like+organoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Matrigel+and+gelatin+substrata+for+feeder-free+culture+of+undifferentiated+mouse+embryonic+stem+cells+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing.</a> Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).</li>
<li>Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf</a> (2024).</li>
<li>biotechne R&D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22biotechne+R%26D+Systems%22%5BJournal%5D)">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&D Systems. , (2024).</li>
<li>VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thewellbio.com/video-protocols">https://www.thewellbio.com/video-protocols</a> (2024).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Henderson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+human+embryos+and+embryonic+stem+cells+show+comparable+expression+of+stage-specific+embryonic+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens.</a> Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).</li>
<li>Haruna, N. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dynamic+biophysical+properties+of+a+tunable+hydrogel+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol+Tissue+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture.</a> J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+VitroGel+ORGANOID-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Stewart, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+intestinal+stiffness+and+associations+with+fibrosis+in+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease.</a> PLoS One. 13, e0200377(2018).</li>
<li>Hernandez-Gordillo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+synthetic+matrices+for+in+vitro+culture+of+primary+human+intestinal+enteroids+and+endometrial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids.</a> Biomaterials. 254, 120125(2020).</li>
<li>Broguiere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+epithelial+organoids+in+a+defined+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel.</a> Adv Mater. 30, 1801621(2018).</li>
<li>Barthes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microenvironment+engineering+and+monitoring+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+The+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances.</a> BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

O Dr. John Huang é fundador e CEO da TheWell Bioscience.

Selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e organoides é um passo inicial fundamental ao usar essas plataformas para uma ampla gama de aplicações. Nossos resultados representativos mostram que a Matriz 4-XFO3, em combinação com uma maior concentração de fatores de crescimento, leva a organoides maiores, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides usando esses sistemas. Foi demonstrado anteriormente que as características únicas da matriz extracelular (MEC) estão intimamente entrelaçadas com a identidade das células dentro do órgão12. Como as células sentem forças externas por meio de integrinas e outros receptores, as características mecânicas da MEC influenciam profundamente as células-tronco e, em resposta, as células-tronco podem gerar forças internas12. As interações entre as células-tronco e seu microambiente são fundamentais para iniciar diversas vias de sinalização12. Além disso, foi demonstrado que a ECM pode servir como um reservatório para armazenar e liberar fatores de crescimento e outras moléculas sinalizadoras que afetam o comportamento celular. Portanto, nossos resultados representativos e décadas de pesquisa enfatizam a importância de considerar os aspectos bioquímicos e físicos do microambiente da célula nativa e as propriedades do tecido ao selecionar sistemas de matriz para investigações in vitro 29,30.
Várias etapas e recomendações críticas foram explicadas por meio do protocolo para aconselhar os usuários sobre possíveis problemas e maneiras de evitá-los. No entanto, duas etapas críticas são apresentadas nesses métodos que são fundamentais para a implementação bem-sucedida deste protocolo. Primeiro, a verificação de marcadores específicos associados à população de células-tronco é crucial para determinar o sistema de revestimento ideal para manter a população de células-tronco pronta para uma diferenciação controlada eficiente. Da mesma forma, confirmar a expressão de marcadores associados a cada etapa de diferenciação é essencial para decidir quando prosseguir para o próximo estágio. Este protocolo fornece uma orientação geral sobre o tempo mínimo necessário em cada etapa. No entanto, o tempo ideal em cada estágio varia para diferentes linhagens celulares e condições experimentais (por exemplo, genótipo, rigidez). Portanto, caracterizar vários marcadores específicos de estágio é a melhor abordagem para melhorar a eficiência da geração de hIO.
O segundo passo crítico foi incorporar uma maior concentração de fatores de crescimento ao usar o sistema Matrix 4-XF sem xeno, o que é de extrema importância. Uma limitação frequentemente destacada dos sistemas de biomateriais livres de xeno é a falta de fatores de crescimento31. No entanto, essa fraqueza pode se tornar um ponto forte: controle total dos fatores de crescimento nos sistemas para melhorar a reprodutibilidade. Embora este protocolo descreva o uso de um kit de suplementação de mídia e fator de crescimento disponível comercialmente, a mesma lógica pode ser usada ao fazer a mídia completa internamente com componentes individuais. A proporção específica hidrogel/meio orienta quanto maior deve ser a concentração dos fatores de crescimento; Por exemplo, uma proporção de 2:1 pode exigir uma concentração de 3x de fatores de crescimento para terminar com uma concentração representativa do meio completo padrão usado. O controle total dos fatores de crescimento presentes no sistema é benéfico para responder a perguntas mecanicistas e evitar problemas regulatórios para muitas aplicações.
As etapas de processamento de imagem descritas na etapa 3 são limitadas pela qualidade das imagens e pelo tipo de imagens capturadas. Pode exigir refinamento para atender aos requisitos específicos de cada tipo e qualidade de imagem. No entanto, as etapas gerais do processo e uma amostra do código MATLAB da estrutura básica para análise de tamanho de organoide a partir de imagens de campo claro ajudam a definir um fluxo de trabalho que pode ser otimizado e expandido ainda mais. Além disso, o acesso a um microscópio de campo claro é mais comum do que outros tipos de microscópios. Embora a falta de acesso e familiaridade com o MATLAB possa limitar o uso desse código, as etapas gerais do processo são compatíveis com software de código aberto, como Fiji by Image J. O tamanho do organoide por si só não é uma métrica recomendada para avaliar a maturação; é encorajado a seguir com uma avaliação de marcadores específicos representativos do órgão-alvo; alguns desses marcadores para o tecido intestinal estão incluídos na Tabela 4. A Figura 6 mostra um exemplo de coloração por imunofluorescência de organoides inteiros com a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), que está localizada na superfície externa (basolateral) dos organoides. Enquanto o EpCAM foi visualizado nos organoides cultivados em todos os sistemas ECM, houve diferenças no tamanho desses organoides. Assim, as informações sobre o tamanho do organoide ajudam a otimizar as condições de cultivo. Além disso, em estudos de resposta a medicamentos, o tamanho do organoide serve como uma métrica da resposta ao composto testado; As alterações de dimensão podem reflectir a eficácia ou a toxicidade dos compostos testados. É importante ressaltar que a geração de vários lotes de organoides com tamanho padronizado é um desafio atual no campo, mas é uma métrica importante de reprodutibilidade experimental para que os resultados possam ser comparados em diferentes experimentos ou laboratórios. Ao todo, um fluxo de trabalho automatizado que permite a extração de informações importantes sobre organoides de imagens de campo claro é uma ferramenta benéfica para muitos pesquisadores.
Ambos os sistemas, matrizes derivadas de animais e hidrogéis livres de xeno, têm suas vantagens e desvantagens. A matriz 2-AB levando a menos liberações de esferóides durante o estágio MH do que as outras matrizes derivadas de animais pode resultar de variações de lote para lote, uma característica amplamente conhecida das matrizes derivadas de animais disponíveis comercialmente. É importante observar que a concentração dos sistemas ECM disponíveis comercialmente varia; Por exemplo, os fatores de diluição nas folhas de especificações do produto foram usados para preparar as soluções de revestimento que podem levar a concentrações ligeiramente diferentes no caso das matrizes derivadas de animais. Essas diferenças na concentração de proteínas podem afetar significativamente a diferenciação, levando a variações na eficiência da diferenciação ao usar o mesmo produto de lotes diferentes. Para selecionar entre esses sistemas, considere fatores como objetivos experimentais específicos, considerações éticas e requisitos regulatórios. Por exemplo, em casos de comparação de resultados experimentais in vitro com um modelo animal de camundongo para responder a questões de biologia de tumores e câncer, o uso de matrizes derivadas do camundongo Engelbreth-Holm Swarm EHS pode ser uma ótima escolha. Além disso, como produtos como o Matrigel são usados há décadas, existem muitos protocolos, dados e referências. No entanto, o uso de matrizes livres de xeno bem definidas que permitam a personalização de propriedades físicas e químicas pode ser uma opção mais adequada quando a questão de pesquisa está associada a doenças ou terapias humanas. Além disso, a maioria dos sistemas de hidrogel sem xeno são projetados para atender aos padrões regulatórios, o que os torna uma escolha adequada para pesquisas que exigem conformidade com boas práticas de fabricação (GMP) ou outras diretrizes regulatórias.
Em resumo, enquanto as matrizes derivadas de animais têm sido amplamente utilizadas para manutenção de iPSC e geração de organoides devido à sua biocompatibilidade, os sistemas de hidrogel sem xeno oferecem vantagens em termos de reprodutibilidade, custo-benefício, conformidade regulatória e considerações éticas. A escolha entre os dois depende das necessidades específicas da pesquisa ou aplicação clínica. Os sistemas de hidrogel sem xeno estão ganhando popularidade como uma alternativa mais versátil e sustentável que pode apoiar a utilização de organoides e sistemas microfisiológicos para a lista pré-clínica de candidatos terapêuticos. Esta aplicação pode melhorar significativamente o desenvolvimento inicial de medicamentos e ajudar a enfrentar os desafios atuais de tradução clínica na indústria farmacêutica.

A matriz extracelular (MEC) é um componente dinâmico e multifuncional dos tecidos que desempenha um papel central na regulação do comportamento e desenvolvimento celular. Como uma rede complexa, fornece suporte estrutural, ligantes adesivos celulares1 e armazenamento de fatores de crescimento e citocinas que regulam a sinalização celular. Por exemplo, durante a cicatrização de feridas, a MEC serve como um andaime para células migratórias e como um reservatório de fatores de crescimento envolvidos no reparo tecidual2. Da mesma forma, a desregulação na MEC pode levar a um aumento na gravidade de várias doenças, como fibrose e câncer 3,4. Durante o desenvolvimento embrionário, a MEC orienta a morfogênese do tecido. Por exemplo, no desenvolvimento do coração, os componentes da ECM desempenham um papel na criação da arquitetura e função corretas do tecido cardíaco5. Mais de uma década de pesquisa mostrou que a rigidez do microambiente por si só 6,7 pode controlar a especificação da linhagem de células-tronco. Portanto, não é surpreendente que, durante a diferenciação celular in vitro, a ECM influencie o destino das células-tronco, fornecendo sinais para diferenciação.
Os organoides podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Começar com uma linha iPSC devidamente caracterizada é necessário para gerar organoides com sucesso. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC e a geração de organoides. Além disso, pesquisas recentes enfatizaram a importância da composição da matriz extracelular (MEC), interações entre as células e a MEC8, bem como pistas mecânicas e geométricas 9,10,11 no contexto da expansão e diferenciação de organoides12. O avanço da tecnologia organoide, melhorando a reprodutibilidade, envolverá a incorporação de pistas físicas e químicas específicas do tecido.
Os organoides visam recapitular o tecido nativo dentro de um microambiente fisiologicamente semelhante. A escolha de um sistema de ECM que imite de perto a ECM do tecido nativo é crucial para alcançar relevância fisiológica em relação ao comportamento, função e resposta celular a estímulos13. A escolha dos componentes da ECM pode influenciar a diferenciação de células-tronco em tipos específicos de células dentro do organoide. Diferentes proteínas ECM e suas combinações podem fornecer pistas que orientam o destino celular14. Por exemplo, estudos mostraram que o uso de componentes específicos da ECM pode promover a diferenciação de células-tronco intestinais em tipos de células intestinais maduras, resultando em organoides intestinais fisiologicamente relevantes15. Embora os organoides sejam uma ferramenta valiosa durante a modelagem de doenças e testes de drogas, a seleção de um sistema de ECM apropriado é fundamental para esta aplicação. Um sistema de ECM apropriado pode aumentar a precisão da modelagem da doença, criando um microambiente que se assemelha ao tecido afetado16. Além disso, a ECM específica do tecido pode ajudar a gerar organoides que recapitulam melhor os fenótipos associados à doença e as respostas aos medicamentos17. A otimização do sistema ECM usado na diferenciação de organoides é fundamental para alcançar os resultados de diferenciação desejados.
Sistemas de membrana basal disponíveis comercialmente derivados de fontes animais de ECM (por exemplo, Matrigel, Cultrex) e hidrogel livre de xeno (por exemplo, VitroGel) são amplamente utilizados em pesquisas de iPSC e organoides. As empresas que os comercializam e os pesquisadores que os utilizam estabeleceram muitas instruções para seus produtos e aplicações específicas ao longo dos anos. Muitas dessas instruções serviram de guia para a geração desse protocolo. Além disso, os benefícios e contratempos associados às suas propriedades intrínsecas têm sido observados individualmente por muitos 18,19,20,21. No entanto, não existe um fluxo de trabalho sistemático para orientar a seleção de sistemas ideais para o trabalho com iPSC e organoides. Aqui, é fornecido um fluxo de trabalho para avaliar sistematicamente a equivalência de sistemas ECM de várias fontes para iPSC e trabalho com organoides. Este é um estudo comparativo da manutenção de duas diferentes linhagens de iPSC humanas (hiPSC) e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) e VitroGel (Matriz 4-XF). Para a cultura de organoides, foram utilizadas quatro versões da matriz VitroGel sem xeno, previamente otimizadas para cultura de organoides: ORGANOIDE 1 (Matriz 4-O1), ORGANOIDE 2 (Matriz 4-O2), ORGANOIDE 3 (Matriz 4-O3), ORGANOIDE 4 (Matriz 4-O4). Além disso, foram utilizadas matrizes de origem animal otimizadas para organoides: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) e Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Foram utilizados meios de cultura de células-tronco disponíveis comercialmente (mTeSR Plus) e kit de diferenciação de organoides (kit organoide intestinal STEMdiff). Este protocolo combina as instruções individuais dos fabricantes dos produtos com experiências de laboratório para orientar o leitor em direção a uma otimização bem-sucedida do ECM para seu trabalho específico de iPSC e organoide. Em conjunto, este protocolo e os resultados representativos enfatizam a importância de selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e diferenciação de organoides.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 poços (tratada com cultura, estéril)</td> <td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; Banho-maria C</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Enxágue Anti-aderência</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de segurança biológica (BSC)</td> <td>Labconco&nbsp;</td><td>Microscópio de</td> Campo Claro Logic <td></td></tr><tr><td></td><td>Echo Rebel</td><td>REB-01-E2</td><td></td></tr><tr><td>BXS0116</td><td>ATCC</td><td>ACS-1030</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga com controle de temperatura (4 &deg; C capacidades)</td> <td>ThermoScientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 15 mL, estéreis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 50 mL, estéreis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, Tipo 2</td><td>Bio-techne</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>3434-010-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sem Ca++ e Mg++)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexLivre de LDEV, qualificado para hESC Reduzir o Fator</td><td>de Crescimento Gibco&nbsp;</td><td>A14133-02</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Guava Muse Cell Analyzer ou outro equipamento de citometria de fluxo (opcional)</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Heralcell Vios Incubadora de cultura de células (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51033775</tr><tr><td>JMP Software</td><td>SAS Institute</td><td>JMP 16</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Membrana de Pouso Reduzida por Fator de Crescimento Matrigel (TFG) Livre de LDEV Corning</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matriz Matrigel Alta Concentração (HC), Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Livre de LDEV</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>354263</tr><tr><td>mTeSR Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta placa de 24 poços tratada com superfície</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)</td><td>BD Pharmingen</td><td>566841</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-human CDX2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>563428</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-humano FOXA2</td><td>BD Pharmingen</td><td>561589</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-humano SSEA4&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561565</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>SCTi003-A</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0510</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (10 mL)&nbsp;</td>Pipetas sorológicas <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>(5 mL)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Meio de Crescimento de Organoide Intestinal</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5145</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Kit de Organoide Intestinal STEMCELL</td><td>Technologies</td><td>5140</td><td></td></tr><tr><td>Vitrogel Hydrogel Matrix</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM01</td><td></td></tr><tr><td>VitroGel ORGANOID Discovery Kit</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM04-K</td><td></td></tr></tbody></table>

estudo comparativo de matrizes de membrana basal para manutenção de células-tronco humanas e geração de organoides intestinais

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crítico no comportamento e desenvolvimento celular. Organoides gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) estão no centro das atenções de muitas áreas de pesquisa. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC. A incorporação da ECM disponível comercialmente na cultura de células-tronco fornece pistas físicas e químicas benéficas para a manutenção celular. Os produtos de membrana basal comercialmente disponíveis de origem animal são compostos de proteínas ECM e fatores de crescimento que suportam a manutenção celular. Como a ECM possui propriedades específicas do tecido que podem modular o destino celular, matrizes livres de xeno são usadas para transmitir a tradução para estudos clínicos. Embora as matrizes comercialmente disponíveis sejam amplamente utilizadas no trabalho com hiPSC e organoides, a equivalência dessas matrizes ainda não foi avaliada. Aqui, foi realizado um estudo comparativo da manutenção de hiPSC e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Embora as colônias não tivessem uma forma perfeitamente redonda, houve uma diferenciação espontânea mínima, com mais de 85% das células expressando o marcador de células-tronco SSEA-4. A Matrix 4-XF levou à formação de aglomerados redondos 3D. Além disso, o aumento da concentração de suplemento e fatores de crescimento no meio usado para fazer a solução de hidrogel Matrix 4-XF melhorou a expressão de hiPSC de SSEA-4 em 1,3 vezes. A diferenciação do hiPSC mantido pela Matrix 2-AB levou a menos liberações de esferóides durante o estágio médio / intestino grosso em comparação com as outras membranas basais derivadas de animais. Em comparação com outras, a matriz organoide livre de xeno (Matriz 4-O3) leva a uma IO maior e mais madura, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides. Em conjunto, os resultados sugerem que variações na composição de diferentes matrizes afetam os estágios de diferenciação de IO. Este estudo aumenta a conscientização sobre as diferenças nas matrizes disponíveis comercialmente e fornece um guia para a otimização da matriz durante o trabalho de iPSC e IO.

Seguindo este protocolo, membranas basais disponíveis comercialmente e um sistema de hidrogel livre de xeno foram utilizados com sucesso para cultivar células hiPSC e diferenciá-las em hIO. O principal objetivo desses experimentos foi avaliar sistematicamente a equivalência de matrizes de várias fontes para o trabalho de hiPSC e hIO. A primeira seção deste protocolo enfocou a manutenção e caracterização de uma cultura de iPSC saudável que produz uma geração eficiente de organoides intestinais. O processo de revestimento da cultura com matrizes de origem animal Matrix 1-AB, Matrix 2-AB e Matrix 3-AB foi descrito e comparado com um sistema de hidrogel livre de xeno Matrix 4-XF.
Conforme mostrado na Figura 3A, os hiPSCs BXS 0116 (derivados de CD34+) apresentam morfologia comparável quando cultivados nas três matrizes derivadas de animais. No entanto, a comparação da linhagem celular BXS 0116 com SCTi003-A (derivada de PBMC) cultivada em poços revestidos com Matriz 1-AB enfatiza que as diferenças intrínsecas entre as linhagens celulares (mostradas na Tabela 6) podem levar a variações em relação à proliferação, diferenciação e morfologia celular. Por exemplo, enquanto levou 3 dias para gerar DE para as linhagens celulares SCTi003-A, levou 5 dias para a linha BXS0116. Além disso, como mostrado na Figura 3B-C, a cultura de hiPSCs em sistemas de hidrogel Matrix 4-XF leva à formação de colônias em uma colônia 3D parcialmente incorporada que é drasticamente diferente da morfologia plana da cultura de hiPSC em placas revestidas com Matrix 1-AB ou sistemas equivalentes. Além disso, um dos principais aspectos a serem observados nesses experimentos é que a criação de um sistema de hidrogel livre de xeno usando fatores de crescimento 3x pode melhorar consideravelmente a viabilidade celular e a expressão de marcadores de células-tronco. Ao todo, as culturas de hiPSC em matrizes derivadas de animais e Matrix 4-XF livre de xeno feitas com concentração de fatores de crescimento 3x levaram a uma expressão equivalente de SSEA-4 (marcador de células-tronco)22; no entanto, o sistema de hidrogel promove a formação de colônias 3D parcialmente incorporadas.
A segunda seção deste protocolo se concentra na diferenciação de hiPSCs para gerar hIO. Aqui, um kit comercialmente disponível desenvolvido com base em Spence et al.23 foi usado para diferenciar em endoderma definida (DE), depois intestino médio / intestino posterior (MH) e, finalmente, coletar esferóides para amadurecer em IO (Figura 4C). Para uma geração eficiente de IO, é crucial examinar se a cultura hiPSC tem diferenciação espontânea mínima antes de iniciar o protocolo de diferenciação. Conforme mostrado na Figura 4A, quanto menor a expressão de marcadores de células-tronco, como SSEA-4, ao iniciar a diferenciação DE, menos eficiente será o processo em todos os estágios (ou seja, menor expressão de marcadores MH) e subsequente baixa geração de hIO. A utilização de um dispositivo compacto de citometria de fluxo de bancada facilitou o acesso rápido aos resultados da citometria de fluxo e a decisão sobre a qualidade da diferenciação antes de passar para o próximo estágio. Uma observação peculiar foi que o hiPSC mantido pela Matrix 2-AB resultou em menos liberações de esferóides durante o estágio de intestino médio / intestino grosso em comparação com os outros sistemas derivados de animais. Outro aspecto importante a ser observado é que, como as colônias de hiPSC mantidas na Matriz 4-XF já tinham uma estrutura 3D no início da diferenciação, esses sistemas levaram a esferóides maiores.
Os esferoides foram incorporados na Matrix 1-ABO, Matrix 3-ABO e Matrix 4-XFO1- Matrix 4-XFO4 e foram amadurecidos em hIO usando um kit. Após a maturação dos esferoides por 7 dias, eles foram passados e incorporados em seus respectivos sistemas de matrizes. O crescimento do organoide em cada sistema foi rastreado por 7 dias a partir de imagens de campo claro. Enquanto a cultura começou com organoides de tamanho relativamente semelhante, após 5 dias, o tamanho do hIO variou em função da matriz na qual eles foram incorporados (Figura 5). Dos quatro Matrix 4-XFO, a formulação que resultou em organoides maiores foi o Matrix 4-XFO3. Os sistemas Matrix 4-XFO são formulados com diferentes ligantes e propriedades mecânicas para atender a uma variedade de aplicações24. Especificamente, a rigidez25 do Matrix 4-XFO3 está mais próxima da rigidez do intestino humano26 do que as outras formulações do Matrix 4-XFO, o que apóia descobertas recentes sobre o papel das propriedades mecânicas da ECM na expansão do organoide12,27,28. Nossos resultados representativos indicam que a Matriz 1-ABO e a Matriz 3-ABO facilitam igualmente o crescimento e a expansão dos organoides intestinais.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig03.jpg"> Figura 3: Seleção do sistema de matriz para manutenção do iPSC. (A) Imagens representativas de duas linhagens celulares cultivadas em revestimento de utensílios de cultura com os três diferentes sistemas de matriz derivada de animais. (B) Imagens representativas comparando o uso de Matrix 4-XF com suplementação de fator de crescimento 1x vs. 3x mostram que o aumento da suplementação de fator de crescimento melhora a viabilidade do hiPSC no hidrogel Matrix 4-XF. (C) A comparação da citometria de fluxo da expressão de SSEA-4 da Matriz 1-AB, Matriz 3-AB, Matriz 4-XF (3X) mostra expressão equivalente, enquanto a Matriz 4-XF (1X) levou a uma menor expressão de SSEA-4. As barras representam ± DP médio de n = 5; ANOVA de duas vias e teste post-hoc com método não paramétrico de Wilcoxon foi usado para teste de significância. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig04.jpg"> Figura 4: Diferenciando iPSC em endoderma definida (DE) e intestino médio / intestino grosso (MH). (A) Imagens representativas da diferenciação de iPSC em DE começando com diferentes níveis de marcador SSEA4 destacam a importância de iniciar a diferenciação com uma população de hiPSC com alta expressão de marcadores de células-tronco. As setas vermelhas apontam para áreas de diferenciação espontânea antes de iniciar a DE. (B) Exemplo de análise de citometria de fluxo da expressão do marcador de células-tronco SSEA4 antes de iniciar a diferenciação e do marcador DE FOXA2 após 3 dias de diferenciação DE para uma diferenciação DE ruim (esquerda) e uma boa diferenciação (direita). Cada gráfico representa a análise de células extraídas de 1; Para análise estatística, recomenda-se calcular a média dos resultados de pelo menos 3 execuções de citometria de fluxo. (C) Imagens representativas da diferenciação de iPSC em hIO em todas as matrizes estudadas. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig05.jpg"> Figura 5: Seleção do sistema de matriz para incorporação de esferóides e maturação de hIO. (A) Imagens de amostra de maturação de hIO incorporadas na Matriz 4-XFO 1-4. O módulo de elasticidade dos sistemas Matrix 4-XFO é de cerca de 50-300 Pa, com o mais alto para Matrix 4-XFO3 &gt; Matrix 4-XFO4 &gt; Matrix 4-XFO2 &gt; Matrix 4-XFO1. A rigidez da Matrix 1-ABO e da Matrix 3-ABO varia de 440 a 800 Pa, dependendo do lote. (B) Imagens de amostra da maturação de hIO foram incorporadas na Matriz 1-ABO, Matriz 3-ABO e Matriz 4-XFO3 no dia da incorporação (Dia 0) e após 1 semana de cultura (Dia 7). (C) Dados mostrando a comparação de tamanho de hIO amadurecido nos diferentes sistemas de matriz. As barras representam ± DP médio de n = 7; ANOVA de duas vias e teste post-hoc com método não paramétrico de Wilcoxon foi usado para teste de significância. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig06.jpg"> Figura 6: Imagens representativas de imunofluorescência de organoides intestinais cultivados nas diferentes matrizes confirmam a população de células epiteliais. Os organoides intestinais inteiros cultivados nas diferentes matrizes foram fixados e corados com molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) (verde) e contracorados para núcleos celulares DAPI (azul). Todos os organoides apresentam células positivas para EpCAM, confirmando a população de células epiteliais localizadas na superfície externa dos organoides. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Tabela 1: Resumo da preparação, armazenamento e diluição de alíquotas de matrizes usadas para revestir utensílios de cultura usados para iPSC. * Para um fator de diluição preciso, verifique o fator de diluição recomendado e/ou as concentrações de proteína no Certificado de Análise de cada lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%201_Summary%20of%20aliquot%20preparation_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Tabela de referência do volume de soluções de revestimento por área de superfície de material de cultura e mTeSR Plus Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%202_Volume%20of%20coating%20solutions_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Tabela de referência do volume de soluções precursoras Matrix 4-XF por área de superfície de material de cultura e meio completo de células-tronco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%203_Reference%20table%20of%20the%20volume%20of%20Matrix4-XF_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 4: Lista de marcadores comuns recomendados para caracterizar hiPSC e hIO durante o processo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%204_List%20of%20common%20markers_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 5: Resumo dos meios necessários durante a diferenciação de hiPSC em organoides intestinais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%205_Summary%20of%20media%20needed%20during%20hiPSC_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 6: Detalhes específicos sobre as duas linhagens de hiPSC usadas neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%206_iPSC%20lines%20information_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo suplementar 1: Código geral do MATLAB para modificar de acordo com o tipo de imagem específico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Code%20image%20Processing_RE.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Os organoides tornaram-se ferramentas valiosas para a modelagem de doenças. A matriz extracelular (MEC) orienta o destino da célula durante a geração de organoides, e o uso de um sistema que se assemelha ao tecido nativo pode melhorar a precisão do modelo. Este estudo compara a geração de organoides intestinais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em ECM derivada de animais e hidrogéis livres de xeno.

Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

Nossa pesquisa visa integrar modelos in vitro e in silico para informar a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos nos estágios iniciais de desenvolvimento. Em poucas palavras, combinamos tecnologia de células-tronco, organoides e microfluídica para investigar interações de doenças medicamentosas, integridade da membrana e prever a absorção e o metabolismo de medicamentos. Em nosso campo, as tecnologias de ponta incluem modelos fisiológicos baseados em silício em combinação com sistemas avançados in vitro, como sistemas microfisiológicos, como órgãos em um chip e organoides.Além disso, a bioimpressão 3D está sendo explorada para maximizar a escalabilidade desses modelos in vitro mais complexos. Os desafios experimentais atuais incluem o aprimoramento dos microambientes teciduais e a fidelidade fisiológica desses modelos in vitro, minimizando a variabilidade experimental e otimizando as capacidades de alto rendimento. Além disso, estabelecer protocolos padronizados que estejam em conformidade com os padrões regulatórios para o desenvolvimento de medicamentos.Com o objetivo de diminuir a variabilidade experimental, mimetizar melhor o microambiente tecidual e aderir às diretrizes regulatórias para o desenvolvimento de medicamentos humanos, este protocolo descreve a otimização da geração de um organoide e a manutenção desse sistema organoide usando um sistema de hidrogel livre de células com composição de controle e propriedades mecânicas de controle. Estamos interessados em desenvolver sistemas microfisiológicos para modelar em populações especiais, não bem representadas em ensaios clínicos, como por exemplo, pessoas que vivem com síndrome de Down. Nosso laboratório também está trabalhando para trazer novas abordagens de tratamento baseadas em imuno-oncologia para novos ambientes em cânceres gastrointestinais e de pulmão.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

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