Medindo a aprendizagem associativa em quimiotaxia do nematóide Caenorhabditis elegans

Uma das questões mais fascinantes em neurociência é como a memória de aprendizagem emerge da plasticidade dos neurônios. Tanto a plasticidade quanto o aprendizado diminuem com a idade. Mas não está claro por que investigamos os mecanismos responsáveis por esse declínio.

Utilizando os organismos modelo nematoides em neurite elegans. Ficou claro que quase todo comportamento de C. elegans depende do contexto e da experiência, e que eles compartilham mecanismos de aprendizagem associativa e não associativa com outros organismos. Determinantes notavelmente importantes do aprendizado de C. elegans, como a atividade neural e a sinalização de insulina, também estão implicados na regulação dos processos de coceira do cérebro e até mesmo de todo o organismo.

A tecnologia básica é usada no estudo de placas de Petri divididas por quimiotaxia, como por meio de microscópios. Também usamos câmeras com software de rastreamento e câmaras comportamentais personalizadas para rastreamento de trajetórias e imagens de cálcio com microfluídicas para visualizar os mecanismos fisiológicos por trás dos comportamentos observados na placa de Petri. Atualmente, ensaios de quimiotáxia de classificação C. elegans têm sido realizados em placas de gradiente ou de quadrantes.

Placas de gradiente podem ser exigentes porque o gradiente muda ao longo do tempo e, placas de quadrante, elas foram usadas apenas para comparar duas concentrações diferentes de sal. Por isso introduzimos o uso de placas brancas para este ensaio. Queremos entender por que a capacidade de aprender, que depende da plasticidade neural, diminui com a idade.

Nosso objetivo é usar o ensaio quimiotáxico para testar se vias específicas de sinalização são responsáveis por esse declínio. Com base nisso, pretendemos desenvolver tratamentos voltados para esse declínio cognitivo relacionado à idade. Para começar a obter o crescimento do nematoide, placas de parafuso médio alimentadas com escherichia coli viva OP 50.

Adicione Caenorhabditis elegans N dois no prato e mantenha durante a noite a 20 graus Celsius de cabeça para baixo para minimizar a perda de umidade. No dia seguinte, transfira 30 jovens adultos de Caenorhabditis elegans para a placa de crescimento do nematoide. Permita que os animais depositem ovos por aproximadamente oito horas a 20 graus Celsius.

Após a postura cronometrada, remova todos os vermes adultos do prato. Cultive a placa de cabeça para baixo a 20 graus Celsius por três dias. Para o ensaio, seme metade do lote dos grupos desejados de placas de condicionamento com 200 microlitros de OP 50 por placa.

Deixe as placas com sementes secarem durante a noite a 20 graus Celsius em uma incubadora junto com as placas não sementes. Prepare a concentração desejada de solução de cloreto de sódio de um litro em uma garrafa de vidro. Autoclave as garrafas por 15 minutos a 121 graus Celsius.

Depois, deixe as garrafas esfriarem por 30 minutos a 55 graus Celsius em banho-maria. Enquanto isso, rotule a parte inferior da seção do prato da árvore YP com a correspondente concentração de cloreto de sódio e desenhe um círculo de raio de cinco milímetros ao redor do centro da placa onde as paredes se encontram. Coloque cada garrafa uma de cada vez em um agitador magnético aquecido.

Adicione 25 mililitros de uma solução molar de fosfato de potássio a pH seis em cada frasco. Misture bem por dois minutos. Depois, adicione sucencialmente cloreto de cálcio, colesterol e sulfato de magnésio enquanto mexe.

Em seguida, aliquota o meio zero milimolar em um compartimento de uma placa de Petri em Y até que ele alcance o topo da parede interna. E deixe o meio solidificar por aproximadamente cinco minutos. Aliquota o meio de 100 milimolares para o segundo compartimento da placa de Petri em Y até que ele toque a seção solidificada de zero milimolar adjacente a ele.

Depois, use uma ponta de pipeta estéril de 10 microlitros para quebrar a tensão superficial ao longo da parede em Y e conectá-la à seção de cloreto de sódio com zero milimolar. Deixe o meio solidificar por cinco minutos. Aliquota o meio de 50 milimolares no compartimento restante da placa de Petri de Y até que ele toque as seções solidificadas de zero milimolar e 100 milimolares.

Depois, use uma ponta de pipeta estéril de 10 microlitros para quebrar a tensão superficial ao longo da parede em Y e conecte a seção de cloreto de sódio de 50 milimolares às outras duas seções. Depois de deixar o meio solidificar por cinco minutos, guarde os pratos durante a noite a 20 graus Celsius. Para começar, pipetear um mililitro de tampão estéril M nine sobre uma placa de crescimento contendo Caenorhabditis elegans.

Gire a placa suavemente para deslocar as minhocas do gramado bacteriano OP 50 e da barra sem fim, formando uma suspensão. Incline a placa para coletar a suspensão por rosca em um buffer M nine usando uma ponta de pipeta plástica de um mililitro com a parte superior cortada. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Deixe as minhocas se acomodarem no fundo dos tubos da microcentrífuga por aproximadamente 60 segundos, formando um pellet. Depois, remova o sobrenadante usando uma pipeta de um mililitro sem mexer no pellet. Lave o pellet com um mililitro de buffer estéril M nine duas vezes.

Para remover o OP 50 residual. Reese suspende o pellet em 300 microlitros de buffer M nove. Depois da lavagem final.

Gire a suspensão para distribuição uniforme das minhocas e transfira lentamente 50 microlitros de suspensão com verme contendo aproximadamente 200 a 300 minhocas para cada placa de condicionamento. Para pratos com sementes de op 50, deposite a gota de verme longe do gramado bacteriano e deixe-a ser absorvida pelo traje. Mantenha as placas de cabeça para baixo em uma incubadora a 20 graus Celsius por quatro horas.

Após o condicionamento, pipete um mililitro de buffer estéril M nine em uma placa de condicionamento e gire suavemente para deslocar as minhocas formando uma suspensão. Depois, incline a placa para coletar a suspensão de sem-fim usando uma ponta de pipeta plástica de um mililitro e transfira para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Em 60 segundos, as minhocas se acalmam e formam uma bola.

Após remover o sobrenadante, lave as minhocas duas vezes com um mililitro de buffer estéril M 9. Depois, encha o tubo da microcentrífuga com buffer M nine até a marca de um mililitro. Assim que o pellet de minhoca se formar, remova 960 microlitros do sobrenadante sem perturbar o pellet.

Agora gire ou agite o tubo suavemente para resuspender as minhocas. Transfira 20 microlitros dessa suspensão contendo aproximadamente 100 a 150 vermes para o centro de uma placa de ensaio onde os segmentos da parede em Y se encontram. Deixe as minhocas vagarem por 30 minutos a 20 graus Celsius.

Depois, conte o número de minhocas em cada seção da placa de ensaio e conte novamente após 30 minutos. Calcule o índice de quimotáxis por placa em cada momento usando a fórmula especificada. O comportamento do tipo selvagem de Caenorhabditis elegans foi significativamente afetado por condicionamento de quatro horas em placas com diferentes níveis de cloreto de sódio, com ou sem alimento.

Após 30 minutos na placa de ensaio, minhocas condicionadas com altas concentrações de cloreto de sódio e alimento, assim como aquelas condicionadas sem cloreto de sódio e sem alimento, apresentaram um índice de quimiotaxía positivo, indicando preferência por concentrações mais altas de cloreto de sódio. Por outro lado, vermes condicionados com altas concentrações de cloreto de sódio e sem alimento, concentrações médias de cloreto de sódio, e sem alimento e sem cloreto de sódio apresentaram índice de quimiotaxa negativo, indicando preferência por concentrações mais baixas de cloreto de sódio. A Associação de Alimentos por cloreto de sódio persistiu após 60 minutos com o índice de Quimotáxia, frequentemente mudando em vermes condicionados à alimentação, indicando aprendizado associativo dinâmico à medida que os animais atualizam essa associação enquanto circulam e buscam alimento.