Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína

Propomos um protocolo para a predição computacional de preferências de aminoácidos em interações proteína-proteína mais específicas. Este protocolo pode ser considerado como um primeiro passo no desenho de mediadores dessas interações. Estamos interessados em usar esses mediadores como potenciais inibidores de interações específicas, no tecnólogo em imunologia.

Nosso implementador usado para caracterizar as preferências de aminoácidos entre os locais de ligação específicos é caro e complicado. Nosso protocolo é uma tecnologia com suporte biológico baseada em eficiência e operações em série. Essa estratégia tem o potencial de processar um grande número de sequências de linhas, fornecendo uma diferença completa e consistente de preferências de aminoácidos.

Nosso protocolo oferece um profissional econômico processando um grande número de sequências de DNA preferidas a um mais completo do número normalmente limitado de sequências, processos em abordagens de laboratório na web. Além do desenvolvimento de inibidores de produtos imunológicos, gostaríamos de comparar o desempenho dessa metodologia com outras famílias de produtos. Isso nos permitirá entender melhor a base estrutural da multiespecificidade, não apenas no contexto imunológico, mas também em outras funções celulares, como sinalização e comunicação.

Comece baixando a estrutura do complexo proteína-proteína. Para isso, navegue até a página inicial do banco de dados de proteínas e insira o ID do PDB na caixa de pesquisa principal. Na página principal da estrutura, clique em Baixar arquivos e, em seguida, em Montagem biológica 1 para baixar os arquivos no formato PDB gz.

Abra a estrutura baixada no UCSF Chimera. Navegue até Ferramentas, depois Edição de estrutura e clique em Alterar IDs da cadeia. Renomeie a segunda cadeia inicialmente rotulada como A, para B.Em seguida, clique em Favoritos, seguido de Painel de Modelo.

Selecione o modelo com as duas correntes e clique no botão agrupar/desagrupar para separar cada cadeia em um modelo diferente. Em seguida, selecione os dois modelos e clique no botão copiar/combinar. Insira um novo nome para o modelo combinado.

Marque Fechar modelos de origem e clique em OK. Clique em Selecionar, depois em Cadeia e confirme se as cadeias no dímero agora estão identificadas como A e B.Clique em Arquivo e salve PDB para salvar a estrutura editada como um novo arquivo PDB. Para identificar o segmento alvo na proteína ligante, navegue até o servidor BUDE Alanine Scan. Clique no botão Escolher arquivo em Upload de estrutura e carregue o arquivo PDB salvo.

Na próxima página, verifique se a estrutura foi carregada corretamente e insira um nome para o trabalho no servidor. Defina as cadeias A como um receptor e B como o ligante e clique no botão Iniciar varredura para enviar o trabalho. Quando o trabalho estiver concluído, clique em Mostrar resultados para abrir a página Resultados.

Na lista Resíduo, selecione o trecho de resíduos previsto para interagir melhor com a superfície de vinculação de destino. Usando este protocolo e segmento de aminoácidos, interagindo com a superfície de ligação IRF5, foi previsto. Usando mutagênese computacional de varredura de alanina, um segmento de 13 aminoácidos foi previsto das posições 424 a 436, com o motivo p L x IS começando na arginina 432.

Para começar, prepare a interface do peptídeo proteico para diversificação de sequências. Abra o arquivo PDB no Chimera e certifique-se de que a estrutura das subunidades alvo esteja intacta, sem átomos ou ligações ausentes. Para remover todas as moléculas não essenciais da estrutura, clique em Selecionar, depois em Resíduos e, em seguida, selecione todas as moléculas, exceto os aminoácidos padrão.

Em seguida, clique em Ações seguido de Adams/Bonds e exclua. Em seguida, clique em Favoritos, em Sequência, e depois clique na cadeia considerada como ligante. Corte a cadeia de ligantes para o segmento de interação identificado, excluindo todos os resíduos, exceto aqueles entre as posições selecionadas.

Clique em Arquivo e salve o PDB para salvar a estrutura editada em um arquivo PDB diferente. Copie esse arquivo para um local Linux acessível pelos aplicativos Rosetta. Use o aplicativo fixedbb da Rosetta para realizar um reempacotamento de todas as cadeias laterais de aminoácidos da estrutura de base antes da diversificação da sequência, executando este comando.

Em seguida, renomeie o arquivo PDB repack com um sufixo _ repack usando o comando a seguir. Em seguida, execute pepspec no modo de design para executar a diversificação de sequência usando este comando. Em seguida, gere um pwm usando o gen pepspec pwm.

py incluído na suíte Rosetta. Para executar esse script, use o comando a seguir. Para criar um logotipo de sequência, abra o arquivo com as sequências de peptídeos geradas na etapa anterior com um editor de texto preferido e copie todas as sequências.

Navegue até o servidor WebLogo e cole as sequências na caixa de texto Alinhamento de Sequência Múltipla. Escolha um formato e tamanho desejados do logotipo de acordo com o comprimento de entrada e clique em Criar logotipo. Usando este protocolo, as preferências de aminoácidos foram previstas para o motivo p L x IS conservado na superfície de ligação IRF5.

A posição, a matriz de peso e o logotipo da sequência gerados na diversificação da sequência mostraram preferência pelo glutamato na posição 432 e pela leucina e isoleucina nas posições 433 e 435. As posições 427, 429 e 436, tipicamente ocupadas pela Serina, mostraram maior preferência por aspartato e glutamato, destacando o papel da fosforilação e da dimerização do IRF5. A posição 425 mostrou uma alta preferência pela Serina, sugerindo seu envolvimento na interação proteína-proteína em sua forma não fosforilada.