Um fluxo de trabalho para a avaliação quantitativa dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos da casca de Populus trichocarpa

[Apresentador] Um fluxo de trabalho para a avaliação quantitativa dos microbiomas bacterianos endofíticos e epitéticos da casca de Populus trichocarpa. Aqui, projetamos e testamos um fluxo de trabalho detalhado para estudar o microbioma que coloniza os tecidos internos ou as superfícies da casca de Populus trichocarpa. Este fluxo de trabalho descreve em detalhes a amostragem dos microbiomas endofíticos e epítemáticos da casca de Populus trichocarpa, o processamento dos materiais coletados, a extração de DNA genômico, a amplificação por PCR das regiões-alvo, a preparação de bibliotecas de DNA e o sequenciamento dos microbiomas bacterianos endofíticos e epitéticos por meio da tecnologia de sequenciamento de última geração. Também fornecemos um breve procedimento analítico para os dados de sequenciamento obtidos. Este fluxo de trabalho comprovado fornecerá uma abordagem eficaz para investigar empiricamente as comunidades de microbioma endofítico e epitético da casca de Populus trichocarpa e outras espécies florestais. Cultive mudas de Populus trichocarpa de três meses em uma câmara de crescimento, corte os segmentos de caule de 10 centímetros de comprimento de Populus trichocarpa de dois a 12 centímetros acima da superfície do solo esterilizado usando um podador esterilizado. Coloque os segmentos de caule em uma placa de Petri quadrada esterilizada. Limpe repetidamente a epiderme do caule na placa de Petri quadrada esterilizada usando algodão estéril com 0,1%. Tween 20. Armazene cada pedaço de algodão contendo microorganismos, amostras epítéticas em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mililitro a 80 graus centígrados negativos. Depois de limpar a superfície do caule, corte a casca com um bisturi estéril, retire a casca e coloque-a em uma placa de Petri quadrada. Corte a casca descascada do caule em segmentos de aproximadamente um centímetro com um bisturi estéril. Esterilize as superfícies dos segmentos embebendo em álcool a 70% por dois minutos e, em seguida, mergulhe os segmentos em hipoclorito de sódio com 0,1%, Tween 80 por cinco minutos. Por fim, esterilize os segmentos em álcool 70% por 30 segundos. Em seguida, lave todas as amostras três vezes com água destilada estéril e coloque-as em uma bancada limpa para secagem ao ar. Armazene cada amostra endofítica da casca do caule esterilizada em um tubo de centrífuga estéril de dois mililitros a menos 80 graus centígrados. Coloque as seções da casca do caule em tubos duros estéreis de cinco mililitros e adicione três esferas de aço esterilizadas em cada tubo. Congelar os tubos rígidos que contêm as amostras em azoto líquido durante 10 minutos. Esmague as amostras de casca por cinco minutos com um batedor de contas. Em seguida, congele o tubo rígido novamente em nitrogênio líquido por um minuto e repita a etapa de batida do cordão por cinco minutos. Adicione a casca do caule trichocarpa trichocarpa e as comunidades bacterianas epítéticas aderidas ao algodão, 0,25 gramas cada, a cada um dos tubos de contas e, em seguida, adicione 60 microlitros da solução C1 fornecida por um kit comercial e suavemente misturada por inversão. Em seguida, homogeneizar as amostras endofíticas e epítéticas usando um batedor de esferas em quatro corridas de um minuto. Após cada corrida, coloque as amostras no gelo por 30 segundos. Centrifugue os tubos a 10.000 vezes a gravidade por um minuto, extraia as amostras endofíticas e epitéticas usando um kit seguindo as instruções do fabricante, adicione 30 microlitros de solução C6 ao centro da membrana do filtro branco e incube a 25 graus centígrados por cinco minutos. Centrifugue a 10.000 vezes a gravidade à temperatura ambiente por um minuto. Medir as concentrações do DNA genômico extraído de amostras epítéticas e endofíticas usando um espectrofotômetro de micro volume. Dilua cada amostra de DNA com ddH2O estéril a dois nanogramas por microlitro para obter o molde de DNA para amplificação por PCR. Amplificar a região V5 a V7 do gene bacteriano 16S rRNA usando o primer direto 799F e o primer reverso 1193R. Enquanto isso, amplifice a região V4 do gene bacteriano 16S rRNA usando o primer direto 5115F e o primer reverso 806R. Misture bem cada amostra e centrifugue para eliminar bolhas. Realize a amplificação da região V5 a V7 ou V4 dos genes bacterianos 16S rRNA em um termociclador. Carregue cinco litros de microlitros de cada amostra Amplicon em um gel de agarose a 1% e realize eletroforese a 120 volts por 30 minutos. View o gel sob luzes UV para validar a amplificação de PCR bem-sucedida. Para cada amostra, misturar três réplicas dos produtos de amplificação por PCR num tubo de PCR. Determine a concentração dos produtos amplificados usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Meça a fluorescência usando um leitor de microplacas. Trace uma curva de DNA padrão e use-a para calcular as concentrações de DNA dos produtos amplificados. De acordo com a concentração medida, misture os produtos de PCR obtidos das amostras endofíticas ou epífitas da casca de Populus trichocarpa em igual concentração para construir a biblioteca Amplicon. Conduza a eletroforese em gel de agarose usando aparelho de eletroforese. Prepare brevemente um gel de agarose a 1,3%, 1,3 gramas de pó de agarose em 100 mililitros de tampão TAE de uma vez. Remova os pentes após a solidificação do gel e coloque o gel em um tanque de eletroforese com tampão TAE uma vez. Em seguida, adicione uma unidade de volume de seis vezes o buffer de carregamento laranja a cinco unidades de volume de cada produto de PCR com 100 microlitros da escada carregados em cada poço. Adicione 30 microlitros da escada de DNA a um poço. Depois de conectar os fios positivo e negativo, execute a eletroforese de 80 volts por 50 minutos. Extirpar fragmentos de ADN do gel de agarose com um bisturi limpo e afiado. Pese a fatia de gel e transfira-a para um tubo incolor. Adicione tampão para mergulhar a fatia de gel. Realize a extração de gel usando o kit de extração de gel seguindo as instruções do fabricante. Determine a concentração da biblioteca Amplicon purificada em um fluorímetro usando um kit comercial seguindo o protocolo do fabricante para perfis de sequenciamento. Leia tubos de ensaio padrão e de amostra usando um fluorímetro e confirme a qualidade da biblioteca visualizando uma única banda. Analise e anote as sequências do gene 16S rRNA usando o CHAM II. Faça anotações taxonômicas usando o Silver Database de acordo com as sequências de referência. Visualize esses resultados usando o pacote ggplot2 em R. Foi obtido DNA genômico de alta qualidade dos microbiomas bacterianos endofíticos e epitéticos da casca de Populus trichocarpa. A amplificação por PCR de todas as 12 amostras produziu bandas fortes únicas com o tamanho correto. A biblioteca Amplicon foi construída com um único pico que atendeu aos requisitos de pré-sequenciamento. Para os microbiomas endofíticos, leituras de alta qualidade foram obtidas usando os pares de primers 799F / 1193R e 515F / 806R, respectivamente. O par de primers 799F / 1193R produziu significativamente menos leituras de plantas amplificadas. O número de ASVs do microbioma epítético da casca de Populus trichocarpa foi significativamente maior quando se utilizou o 799F/1193R em comparação com os primers 515F/806R. O índice de Shannon foi estimado como menor na comunidade bacteriana epífita da casca do que na comunidade bacteriana endofítica usando o par de primers 799F / 1193R. As características taxonômicas das comunidades bacterianas nas porções endofíticas e epífitas da casca de Populus trichocarpa foram exploradas usando o par de primers 799F / 1193R. Um fluxo de trabalho confiável e eficiente, desde a coleta de amostras até a análise de dados, foi construído para quantificar a composição e a diversidade dos microbiomas bacterianos endofíticos e epítemáticos da casca de Populus trichocarpa. Nosso protocolo pode servir como um caminho para o estudo do microbioma da casca de espécies de plantas lenhosas, permitindo uma melhor compreensão das características das comunidades bacterianas que habitam outras plantas lenhosas.