Name: Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda um ensaio fluorescente sem células para confirmar a capacidade de novos compostos em quelar ferro usando a sonda Calcein. Este método barato e quantificável auxilia pesquisadores em oncologia a identificar queladores promissores.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ensaio fluorescente para detecção de novos quelantes de ferro

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Sulfato de ferro amônio (II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>também conhecido como FAS</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Deferiprone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>sem magnésio e cálcio</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 placas de poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>qualquer placa de 96 poços opticamente transparente funcionará</td></tr></tbody></table>

método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Para o método mostrado na etapa 2, este primeiro experimento (Figura 1) estabeleceu a faixa linear do leitor de placas de fluorescência de microtitulação ao detectar emissões fluorescentes de calceína. Nossos resultados representativos mostram uma ampla faixa linear de fluorescência de calceína de 0 a 100 μM. A ANOVA com análise post hoc de LSD demonstra que há diferenças estatisticamente significativas na RFU média para todas as concentrações de calceína quando comparadas a um controle de 0 μM de calceína. Em experimentos posteriores, a calceína 1 μM foi usada (etapas 3 e 4), pois produz diferenças estatisticamente significativas em relação ao controle de 0 μM e está dentro da faixa em que é comumente aplicada às células na forma de calceína AM na citometriade fluxo 13.
Para o método mostrado na etapa 3, demonstramos que quando o ferro na forma de Fe2+ é adicionado em uma faixa de 0-1000 μM (como FAS) a 1 μM de calceína, os íons Fe2+ resultam em uma diminuição linear na fluorescência da calceína (RFU). Isso permite a observação da extinção baseada em Fe2+ da fluorescência da calceína. A calceína, como um quelante de ferro fraco, liga o ferro e isso reduz a saída fluorescente. Na Figura 2, as concentrações de 8,9 μM de FAS e acima mostraram uma diminuição significativa, p&lt;0,001, na fluorescência da calceína quando comparadas a 1 μM de calceína isoladamente. O uso de 8,9 μM de FAS correspondeu a uma redução de 33% na fluorescência da calceína (RFU média). Para experimentação adicional (etapa 4), 10 μM FAS foi usado, pois estava dentro da faixa de extinção fluorescente de calceína.
Para o método mostrado na etapa 4, a competição da calceína pelos íons Fe2+ por um quelante de ferro pode ser observada na Figura 3. O ferro na forma de Fe2+ diminui a fluorescência da calceína do controle de 1 μM e o quelante de ferro deferiprona aumenta essa fluorescência até um pico, liberando a têmpera de ferro da calceína e aumentando a fluorescência (RFU média). A deferiprona (usada como exemplo) em concentrações variando de 0,97-512 μM resultou em aumentos estatisticamente significativos na fluorescência, conforme observado com ANOVA e análise post hoc de LSD (p&lt;0,001). A maior mudança de dobra foi uma mudança de 3 vezes na RFU média a 62,5 μM de quelante quando comparada ao controle de 1 μM de calceína AM e 10 μM de FAS. Acima de 512 μM de deferiprona não houve diferença estatisticamente significativa entre o quelante e o controle de 1 μM de calceína e 10 μM de FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> Figura 1: Concentrações de calceína e fluorescência (RFU) determinadas usando um leitor de placa de microtitulação fluorescente. As concentrações de calceína de 0-100 μM incubadas por 30 min e fluorescência (RFU) determinadas são mostradas aqui. Os dados mostram a média de 8 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p&lt;0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração é comparada com o controle de PBS e 0 μM de calceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> Figura 2: O aumento da concentração de FAS resulta em uma diminuição linear na fluorescência da calceína. A concentração de FAS foi aumentada de 0-1000 μM, o que resultou em uma diminuição linear na fluorescência de 1 μM de calceína após 30 min de incubação em PBS Os dados mostrados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p&lt;0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post hoc LSD (calculada usando prisma de bloco gráfico). A RFU média da calceína de cada concentração de FAS e 1 μM de calceína é comparada com o controle de 1 μM de calceína 0 μM de FAS em PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> Figura 3: Concentrações crescentes de deferiprona. A concentração de deferiprona foi aumentada de 0-1000 μM com incubação de 1 μM de calceína, 10 μM de FAS em PBS. A fluorescência foi medida em um leitor de microplacas multimodal. Os dados apresentados são a média de 5 repetições por experimento e três experimentos independentes, as barras de erro mostram um intervalo de confiança de 95% na média. A significância estatística é denotada por ** onde p&lt;0,001 conforme determinado usando ANOVA e análise post-hoc LSD (calculada usando prisma de bloco de grafismo). A RFU média foi comparada a 1 μM de calceína em PBS com 10 μM de FAS e 0 μM de deferiprona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentração (μm)</td>
			<td>Volume de (estoque de 1 mM)</td>
			<td>Volume de PBS</td>
			<td>Volume total</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>950 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>975 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>990 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999 μL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Preparação do estoque secundário de calceína.

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, descrevemos um método baseado em colorimetria para determinar o teor de ferro não-heme no tecido hepático de camundongos. O sulfonato de batofenantrolina é usado como substrato cromogênico na presença de um agente redutor, que converte o ferro férrico em ferro ferroso quelatável.

Ensaio Colorimétrico à Base de Sulfonato de Batofenantrolina: Um Método Simples e Rápido para Quantificação de Ferro Não-Heme em Tecido Hepático de Camundongo

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Bioensaio de células Caco-2: um método in vitro para medir a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas

Ascorbato desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Descrevemos aqui um meio-débito, ensaio de microplacas específico e de baixo custo para a determinação de ambos ascorbato intra e extracelular em culturas de células.

Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

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Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

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Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.

Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

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