Name: Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a quantificar a ingestão alimentar em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana em cultura líquida. Este método permite estudar a relação entre comportamento alimentar e longevidade em nematoides.

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Queremos agradecer a Xiaolan Ye, pois este protocolo foi desenvolvido como resultado de uma observação que ela fez originalmente. Agradecemos a todos os membros anteriores e atuais do Petrascheck Lab por sua ajuda no desenvolvimento e otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pela R21 AG080376 (para M.P.). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa do NIH (P40 OD010440).

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do ensaio de depuração bacteriana. Esboço gráfico das principais seções do protocolo (de cima para baixo): Preparação de bactérias, sincronização da população de vermes, semeadura em placas de 96 poços, esterilização de vermes, adição de medicamentos, medição de OD600 no dia 1 e no dia 4. Uma descrição detalhada dessas etapas específicas é indicada à esquerda de cada representação. Abreviaturas: OD = densidade óptica; FUdR = fluorodesoxiuridina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparação de bactérias
NOTA: Esta seção detalha a preparação das bactérias alimentares usadas neste ensaio. A cepa específica de E. coli usada no ensaio é chamada de OP50. OP50 é a cepa mais utilizada para alimentar C. elegans. A cepa OP50 usada é resistente à carbenicilina/ampicilina, o que evita a contaminação cruzada da cultura do verme com outras bactérias9.
<ol><li>Prepare o OP50 com 4-5 dias de antecedência e irradie o raio-x um dia antes do uso. Certifique-se de que todos os materiais que encontram OP50 sejam estéreis29,30.</li>
	<li>Dia -8: Quarta-feira (semana 1):<ol><li>Prepare o pré-inóculo inoculando 5 mL de LB com 100 μg / mL de ampicilina e 0,1 μg / mL de anfotericina B e uma única colônia OP50 e incube por aproximadamente 6 h a 37 ° C em um agitador bacteriano. Inocular cedo para permitir crescimento suficiente para que a cultura fique turva.</li>
		<li>Quando a cultura estiver turva, diluir a cultura pré-inóculo de OP50 em 1:2.000 em 250 mL de TB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Incubar a cultura durante a noite num agitador bacteriano durante 17-19 h a 37 °C. NOTA: A cultura não deve crescer mais de 19 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia -7: Quinta-feira (semana 1)<ol><li>Após a incubação de 17-19 h, transfira a cultura líquida OP50 para um tubo de centrifugação estéril e centrifugue por 15 min a 3.100 × g em uma centrífuga de mesa a 4 °C.</li>
		<li>Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento OP50 com água estéril e centrifugar novamente. Repita esta lavagem 2x.</li>
		<li>Após a segunda lavagem, rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet OP50 em água estéril até um volume de 50 ml e transferi-lo para um tubo cónico de 50 ml previamente pesado. Pulverizar o OP50 por centrifugação durante 20 min a 3.100 × g numa centrífuga de mesa a 4 °C.</li>
		<li>Após a terceira lavagem, remova cuidadosamente todo o sobrenadante restante, garantindo que não haja água no tubo. Calcule o peso do pellet subtraindo o peso do tubo de centrifugação vazio do peso do tubo de centrifugação com o pellet. NOTA: Os pesos dos pellets geralmente variam de 3 a 3,5 g.</li>
		<li>Ressuspenda completamente o pellet OP50 no tampão S-complete até uma concentração de 100 mg/mL, garantindo que não haja aglomerados.</li>
		<li>Certifique-se de que a concentração de OP50 a 100 mg / mL corresponda a 2 × 1010 bactérias / mL. Se a relação entre a densidade óptica e o número de bactérias por mL for conhecida, determinar espectrofotometricamente a concentração bacteriana por mL. Se necessário, use tampão S-completo para ajustar a concentração da solução de alimentação OP50 para 2 × 1010 bactérias / mL.</li>
		<li>Teste o OP50 em uma placa de ágar para determinar se ele foi contaminado.</li>
		<li>Conservar o OP50 suspenso em tampão S-completo a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="4"><li>Dia -3: Segunda-feira (semana 2)<ol><li>Mate as bactérias por meio de irradiação de raios-X para evitar o crescimento bacteriano durante o ensaio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de cultura de minhoca síncrona
NOTA: Esta seção discute a preparação de uma população de worms síncrona. Todos os materiais que entram em contato com as populações de vermes são estéreis. Todas as placas são mantidas a 20 °C, salvo indicação em contrário.
<ol><li>Dia -6: Sexta-feira (semana 1), 16h00<ol><li>Transfira os animais para um prato fresco.<ol><li>Pegue uma placa NGM na qual a maior parte da população de vermes consiste em larvas L1 famintas. NOTA: Uma população mista também produzirá resultados. O uso de vermes L1 que morreram de fome por muito tempo pode afetar o comportamento alimentar nas gerações atuais ou futuras, pois a fome pode deixar marcas epigenéticas por pelo menos três gerações.</li>
			<li>Lave os vermes com no máximo 1 mL de água estéril. Alíquota ~ 300 μL da população de vermes lavados em placas NGM semeadas com OP50 concentrado (~ 300 mg / mL). Deixe as placas secarem sob um secador de placas ou um bico de Bunsen. Incubar as placas a 20°C até que grande parte da população contenha adultos grávidas (segunda-feira). NOTA: Este período de tempo é otimizado para uma população de vermes N2 do tipo selvagem e pode variar de cepa para cepa. Vermes com atrasos no desenvolvimento devem ser levados em consideração e ser divididos mais cedo e/ou semeados mais cedo para que todas as cepas testadas atinjam a idade adulta simultaneamente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dia -3: Segunda-feira (semana 2) 10h00<ol><li>Estabelecendo uma população síncrona CUIDADO! O alvejante é corrosivo para a pele e os olhos. O manuseio requer luvas e óculos de segurança.<ol><li>Colete as minhocas lavando-as da placa com até 10 mL de água estéril. Transfira esta solução de verme/água para um tubo cônico de 15 mL.</li>
			<li>Lave as minhocas por pia de gravidade na bancada por aproximadamente 4 min (por outro lado, lave por centrifugação por 2 min em uma centrífuga de mesa a 310 × g.</li>
			<li>Descarte o sobrenadante por aspiração usando uma pequena ponta e adicione até 15 mL de água estéril. Repita 3x.</li>
			<li>Remova o sobrenadante e adicione 5 mL de uma solução de alvejante/NaOH recém-preparada (1,8 mL de alvejante doméstico, 0,5 mL de NaOH 10 N, 7,7 mL de dH2O).</li>
			<li>Incube por 5 min em temperatura ambiente ou até que os vermes se abram. Vortex suavemente a cada minuto por pelo menos 10 s. Monitore o progresso sob o microscópio de dissecação. NOTA: O tempo necessário para abrir os vermes pode variar de cepa para cepa. Deixar os vermes na solução de alvejante por muito tempo pode resultar em ovos inviáveis.</li>
			<li>Adicione tampão M9 para neutralizar a reação quando todos os adultos se abrirem ou se dissolverem (o volume final será de 15 mL) e centrifugue por 2 min a 1.300 × g.</li>
			<li>Lave os ovos 3x com 13 mL de tampão M9.</li>
			<li>Lave os ovos uma vez com 10 mL de tampão S-completo, centrifugando por 2 min a 1.300 × g.</li>
			<li>Aspire o sobrenadante, adicione 10 mL de S-complete e transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 15 mL. Gire suavemente o tubo em temperatura ambiente durante a noite em um nutador ou dispositivo similar.</li>
			<li>Opcional: Se houver carcaças adultas após a centrifugação final em tampão S-completo, filtre a solução de verme através de um filtro de células de 40 μm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dia -2: Terça-feira (semana 2), 13h00<ol><li>Semeando os animais em pratos<ol><li>Usando um escopo de dissecação, verifique se os vermes eclodiram. Determinar a concentração de vermes no tampão S-completo contando a população de vermes em gotas de 10 μL usando um escopo de dissecação; Conte 5-10 gotas para cada amostra. Se a concentração de vermes em cada gota de 10 μL exceder 30 vermes por gota, diluir o estoque total com S-completo para uma densidade de vermes mais baixa por gota para facilitar a contagem.</li>
			<li>Semeie a mistura líquida de vermes em cada poço de uma placa de 96 poços a um volume de 120 μL da seguinte forma (concentrações finais): 60 vermes / mL em S-completo, 50 μg / mL de carbenicilina, 0,1 μg / mL de anfotericina e 6 mg / mL de OP50 preparado na seção 1. NOTA: O volume total a ser preparado depende do número de placas (~12 mL por placa de 96 poços). Deve haver 6-12 vermes em cada poço. Alternativamente, uma citometria de fluxo de partículas grandes, como o COPAS FP da Union Biometrica, pode ser usada para classificar com precisão 10 minhocas em cada poço (consulte a seção de efeito de aglomeração).</li>
			<li>Inclua também uma mistura líquida sem vermes : 50 μg/mL de carbenicilina, 0,1 μg/mL de anfotericina e 6 mg/mL de OP50 preparados na seção 1.</li>
			<li>Coloque 120 μL da mistura sem vermes na linha H da placa de 96 poços, que é usada para determinar os valores de autólise, conforme mencionado anteriormente. Coloque 120 μL por poço da mistura com minhocas nas fileiras A-G. NOTA: Certifique-se de que os vermes sejam mantidos em suspensão durante a pipetagem (consulte a Figura 2A, B). Usamos placas transparentes de 96 poços com fundo plano. Nosso layout de placa divide a placa para produzir 4 ou 6 condições nas quais cada par de colunas será um tratamento medicamentoso ou cepa de verme diferente, e a linha inferior servirá como um controle "sem vermes" (Figura 2A, B).</li>
			<li>Para evitar contaminação e evaporação, sele a placa com um selador de fita. Incubar as placas durante cerca de 65 h a 20 °C até que os animais se transformem em vermes L4.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dia 0: Quinta-feira (semana 2) antes do meio-dia.<ol><li>Esterilização da população de vermes através da adição de Fluorodesoxiuridina (FUdR).<ol><li>Adicionar 30 μL de uma solução-mãe de FUdR 0,6 mM para esterilizar os animais em cada poço. Sele novamente a placa usando seladores de fita e agite as placas por 20 min em um agitador de placas de microtitulação a 800 rpm. Placas de retorno para a incubadora a 20 °C. NOTA: Nesta etapa, a concentração final de OP50 é reduzida de 6 mg / mL para 5 mg / mL (1 × 109 bactérias / mL), e cada poço tem um volume final de 150 μL. É crucial adicionar FUdR ao estágio L4 antes que os animais atinjam a idade adulta.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dia 1: Sexta-feira (semana 2)<ol><li>Adicione drogas à cultura.<ol><li>Às 9:00 da manhã, confirme se a maioria dos animais está grávida e cada poço contém vários ovos. Se necessário, adicione quaisquer medicamentos à concentração desejada (veja a discussão).</li>
			<li>Após adicionar o medicamento, sele as placas com selador de fita e agite as placas por 20 min a 800 rpm em um agitador de placas. NOTA: A agitação garante que todos os aglomerados bacterianos sejam dissolvidos sem tocar no selador. Tanto os aglomerados bacterianos quanto o líquido no selador distorcerão a leitura do OD600 . Se houver gotas de líquido no selador, gire-o brevemente por 10-20 s a 310 × g. Agite novamente na coqueteleira por 5 min e meça.</li>
			<li>Após 20 min de agitação no agitador de placas de microtitulação, retire a tampa e o lacre e meça o OD600 em um leitor de placas; esta é a medição do Dia 1 OD600 . Selar e devolver as placas a uma incubadora a 20 °C. NOTA: Como as bactérias se instalam rapidamente, a leitura deve ocorrer dentro de 10 minutos após agitar as placas.</li>
			<li>Use um microscópio invertido para verificar a população de vermes em busca de sinais de contaminação ou toxicidade se um medicamento tiver sido adicionado. Retorne as placas para a incubadora a 20 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dia 4: Segunda-feira (semana 3)<ol><li>Faça a leitura do Dia 4 OD600 .<ol><li>Repita o procedimento de leitura do Dia 1 (etapa 2.5.1.3) para obter o valor OD600 do Dia 4. Antes da medição do OD600, agite as placas por 20 min a 800 rpm no agitador de placas de microtitulação.</li>
			<li>Em um microscópio invertido, com idealmente uma objetiva de 2x, conte a população de vermes em cada poço e registre-a em uma planilha. Retorne as placas para a incubadora a 20 °C após a contagem. NOTA: Veja uma amostra de nossa folha de pontuação fornecida em Material Suplementar.</li>
			<li>Após a leitura do Dia 4 , as medições da ingestão de alimentos estão completas. Se necessário, guarde essas placas para análise da vida útil. NOTA: Este protocolo é compatível com Solis e Petrascheck31.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>
3. Análise dos dados relativos à ingestão alimentar
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig2_v1.jpg"> Figura 2: Projeto e análise. (A, B) Possíveis projetos de placas para 4 e 6 condições com os poços de controle "sem sem-fim" na linha H. Esses poços são necessários para determinar a taxa de autólise. Em cada placa, inclua sempre uma população de controle N2 não tratada como referência. (C) Dados amostrais coletados na planilha fornecida com o número de vermes (caixa verde), as duas medidas OD600 nos dias 1 e 4 (caixas laranja), os valores de autólise (caixa azul) e a avaliação usando a fórmula (2) ((OD600 -selflysis)/X0) na caixa vermelha. O exemplo específico mostrado aqui usa o design da placa mostrado em (B). Abreviaturas: OD = densidade óptica; X0 = número de vermes por poço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig2large_v1.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: Esta seção descreve como os dados de ingestão de alimentos da seção 2 deste protocolo são analisados. Os primeiros valores a serem calculados são os valores de controle de autólise . As bactérias se lisam com o tempo no líquido, mesmo na ausência de vermes. Esse valor de autólise também pode ser afetado por muitos produtos químicos e precisa ser controlado, pois é relativamente grande em comparação com a ingestão de alimentos de um verme. Conforme descrito na etapa 2.3.1.4 e mostrado no layout da placa na Figura 2A, B, a linha H contém a mesma solução, excluindo os vermes. Em nossa configuração de placas mostrada na Figura 2B, existem 14 poços por condição com dois respectivos poços de controle de autólise (linha H, "sem vermes").
<ol><li>Calcule os valores de controle de selflysis para os poços de controle sem vermes em cada condição usando a equação (1). Para cada grupo de poços replicados, certifique-se de que haja pelo menos dois poços de controle sem vermes , conforme mencionado na etapa 2.3.1.4. Use a média de todos os poços de controle sem vermes para o valor de autólise para um grupo replicado. Selfysis = média(OD600 Dia 1 - OD600 Dia 4) (1) NOTA: Para a configuração da placa mostrada na Figura 2B, calcularíamos seis valores de autólise , um para cada um dos seis grupos, calculando a média dos dois poços de controle de autólise na linha H.</li>
	<li>Calcule a ingestão de alimentos por verme usando a equação <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66422/66422equation2v2.jpg">     (2). NOTA: Fórmula usada na planilha (caixa vermelha, Figura 2C) com X0 sendo o número de vermes por poço.</li>
	<li>Depois que a ingestão de alimentos por verme for determinada para cada poço, calcule as médias e o desvio padrão para toda a condição. NOTA: Para a configuração da placa mostrada na Figura 2B, 14 poços replicados por condição são suficientes para comparações estatísticas.</li>
	<li>Normalize cada condição para sua respectiva população de controle N2 não tratada. Indique a mudança na alimentação como uma mudança de dobra ou porcentagem de alimentação de N2. NOTA: A normalização é feita porque os valores absolutos de OD600/X0 da equação (2) podem variar entre experimentos realizados em dias diferentes.</li>
</ol>

Ensaio de alto rendimento para medir a ingestão de alimentos e a expectativa de vida de Caenorhabditis elegans

<ol><li>Taormina, G., Mirisola, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+mammals+and+simple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in mammals and simple model organisms.</a> Biomed Res Int. 2014, 308690(2014).</li>
<li>Cunningham, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amp-activated+kinase+links+serotonergic+signaling+to+glutamate+release+for+regulation+of+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C.</a> elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).</li>
<li>You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2C+cgmp%2C+and+tgf-beta+signals+regulate+food+intake+and+quiescence+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans%3A+A+model+for+satiety.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C.</a> elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+nonautonomy+of+C.+elegans+daf-2+function+in+the+regulation+of+diapause+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span.</a> Cell. 95 (2), 199-210 (1998).</li>
<li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+control+of+lipid+metabolism%3A+Lessons+from+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C.</a> elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).</li>
<li>Calculli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+regulation+of+mitochondria+by+germline+proteostasis+prevents+protein+aggregation+in+the+soma+of%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of.</a> elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O protocolo apresentado mede a depuração bacteriana como uma leitura da ingestão alimentar de C. elegans em placas de microtitulação de 96 poços. As curvas dose-resposta na seção de resultados representativos mostram que o ensaio mede quantitativamente a ingestão de alimentos, uma noção que foi confirmada independentemente usando bactérias marcadas com isótopos11. Usando este ensaio, testamos com sucesso medicamentos aprovados pela FDA, como antipsicóticos, com efeitos colaterais metabólicos humanos conhecidos e mostramos que esses medicamentos aumentaram a alimentação em C. elegans10,26. O ensaio é útil para estudar a genética ou farmacologia da alimentação e adiciona uma nova ferramenta para a pesquisa de C. elegans para estudar o metabolismo. Este ensaio fornece um método de baixo custo para estudar a alimentação de maneira escalável e econômica, o que não é possível na maioria dos outros organismos. Nosso trabalho com medicamentos aprovados pela FDA mostra que muitos efeitos colaterais observados em pacientes humanos também são observados em C. elegans, revelando conservação evolutiva 24,26,32.
O ensaio é limitado pela concentração de bactérias que podem ser medidas dentro da faixa linear da medição OD600 . Como resultado, o número de vermes e a faixa de concentrações bacterianas que podem ser analisadas são limitados. Muitos vermes afetarão o OD600 consumindo as bactérias muito rapidamente, portanto, "comendo" a concentração bacteriana do OD600 linear. Em nossa experiência, a variabilidade na preparação bacteriana é o parâmetro crítico que faz com que os resultados variem de um experimento para outro. Tentamos, sem sucesso, congelar grandes lotes de bactérias ou usar bactérias liofilizadas. Nesses casos, a taxa de autólise tornou-se muito alta ou as bactérias eram de uma qualidade que retardou o desenvolvimento de C. elegans . No entanto, nossos testes não foram exaustivos e esse problema pode ser solucionável.
Em geral, a taxa de autólise das bactérias é a mais difícil de controlar e pode causar uma variabilidade considerável. Descobrimos que alguns medicamentos podem aumentar a taxa de autólise a níveis que o ensaio não pôde determinar com segurança a ingestão de alimentos. Como a taxa de autólise aumenta com o tempo no ensaio, não medimos a ingestão de alimentos além do dia 5 da idade adulta. Nessa idade, as bactérias estão ~ 10 dias em cultura. Para medir a ingestão de alimentos após o 5º dia da idade adulta, as bactérias velhas devem ser lavadas e substituídas por novas.
O ensaio apresentado é uma extensão do nosso ensaio de vida útil baseado em placas de microtitulação de 96 poços31. Essa combinação permite medir a expectativa de vida e a ingestão de alimentos na mesma população. Embora o ensaio de depuração bacteriana aqui apresentado não permita determinar a ingestão de alimentos ao longo de toda a vida de C. elegans devido à autólise bacteriana, ele fornece dados sólidos para os primeiros quatro dias da idade adulta, o momento com maior ingestão de alimentos. Especialmente para a descoberta de medicamentos de moléculas pequenas, o controle da ingestão de alimentos é essencial. Em resumo, prevemos que o ensaio apresentado será útil para a comunidade de C. elegans e expandirá o conjunto de ferramentas para estudar o metabolismo ou controlá-lo no contexto de estudos de envelhecimento e expectativa de vida.
Planeamento: 
Antes de planejar a medição da ingestão de alimentos, algumas considerações devem ser feitas.
Matando as bactérias:
Matamos bactérias por irradiação com raios-X em um tubo cônico de 50 mL (900 Gray por 4 h definido em 160,0 kV e 25,0 mA). Usamos o RS2000 da Rad Source para a irradiação. Dependendo do equipamento, o tempo específico e a dose de radiação podem variar de instalação para instalação. A morte completa da bactéria precisa ser determinada por plaqueamento da bactéria após a irradiação para detectar sobreviventes pelo crescimento. É essencial matar todas as bactérias para evitar o crescimento durante o ensaio, pois isso causará uma subestimação da alimentação ou mesmo valores negativos de alimentação. É importante ressaltar que as bactérias devem ser mortas para que C. elegans ainda as coma. Em nossa experiência, existem três maneiras de matar grandes quantidades de bactérias de forma confiável: (i) irradiação por raios-X, (ii) por raios-γ e (iii) adição de formaldeído29,30. As taxas de autólise entre esses três métodos são comparáveis, com um coeficiente de variação de 8% entre as taxas de autólise para os experimentos mostrados na Figura 3B. Os métodos que não funcionaram de forma confiável em nossas mãos foram irradiação UV, coquetéis antibióticos, inativação por calor e azida sódica. Esses métodos não conseguem matar completamente as bactérias (UV e antibióticos), produzem bactérias que C. elegans não come (calor) ou alteram a ingestão de alimentos (azida sódica).
Número de réplicas: 
Em nossa experiência, as mudanças de dobra na alimentação são geralmente pequenas em comparação com a variação observada. Assim, medir as mudanças na ingestão de alimentos requer vários poços replicados. A Figura 2A, B mostra placas de 96 poços projetadas para quatro ou seis condições diferentes, com 21 ou 14 poços replicados e dois poços de controle de autólise sem vermes. Dada a grande variabilidade e as mudanças relativamente pequenas a serem esperadas, mudanças de 0,5 a 2,5 vezes na alimentação tendem a ser os limites inferior e superior. Recomendamos 14 a 21 poços replicados para cada condição e pelo menos dois poços de controle de autólise, descritos a seguir. Essas repetições são suficientes para gerar curvas quantitativas de dose-resposta para drogas que alteram a alimentação11,26.
Controles de autólise: 
O OD600 mede o número de partículas em uma solução, principalmente independente do tamanho da partícula. No entanto, as bactérias mortas se lisarão, perdendo sua natureza de partícula. Chamamos isso de selflysis, que acontece independentemente na presença de vermes e reduz as medições de OD600 sem que os vermes comam. A autólise acontece durante o ensaio e precisa ser medida independentemente em pelo menos dois poços por condição. Esses poços recebem o mesmo tratamento que os outros dentro da mesma condição, exceto que não contêm vermes. Descobrimos que muitos medicamentos também podem alterar a taxa de autólise. Assim, cada condição necessita de poços de controle de autólise independentes com sua respectiva concentração. A Figura 2 mostra uma configuração de placa para quatro ou seis condições com todos os poços de controle de autólise na parte inferior da placa na linha H.
N2 população de referência: 
Também observamos que a quantidade absoluta de bactérias consumidas pode flutuar entre os experimentos, provavelmente relacionada à qualidade das bactérias. Apesar de nossos melhores esforços para prepará-los exatamente da mesma maneira todas as vezes, há flutuações. Por exemplo, as bactérias podem ser colhidas enquanto estão em um estado de divisão durante a fase de crescimento logarítmico e, portanto, ser muito maiores em tamanho do que as bactérias colhidas na fase estacionária. Portanto, essas diferenças simples no tamanho da bactéria podem levar a mudanças no número de bactérias consumidas e diferentes valores de OD600 , uma vez que as medições de OD600 não distinguem entre tamanhos. Por esse motivo, sempre incluímos uma população de animais de controle N2 não tratados que servem como valor de referência, definido como 1 ou 100%, para determinar se os grupos experimentais comem mais ou menos do que o controle N2. Essa prática permite comparações entre experimentos, mesmo que os valores de OD600 variem.
Intervalos de tempo: 
O uso de valores OD600 para medir a ingestão de alimentos requer que a concentração bacteriana diminua de forma mensurável. Como o volume da cultura é muito maior do que o dos vermes, eles devem comer uma quantidade significativa de bactérias para fazer uma diferença detectável. Permanecer na faixa linear para valores de OD600 requer que a concentração bacteriana permaneça entre ~ 1 mg / mL e 10 mg / mL, de modo que uma quantidade considerável de bactérias deve desaparecer para detectá-la. Os vermes comem mais do final do L4 ao dia 4 da idade adulta por causa da produção de ovos. Assim, esse intervalo é ideal. Intervalos mais curtos, como 24 h, podem ser medidos11, mas isso é consideravelmente mais difícil e precisa de ~ 40 poços por condição. Outra opção para medir a ingestão alimentar das larvas é dobrar o número de animais por poço. No entanto, o problema com essa abordagem é que muitos vermes começarão a afetar as leituras do OD600 quando crescerem.
Soluções de estoque para medicamentos a serem testados: 
Se drogas como a serotonina forem testadas quanto à sua capacidade de modular a alimentação, considere o seguinte ao preparar soluções de estoque. Geralmente preparamos um estoque de 50x para medicamentos solúveis em água e adicionamos 3 μL a cada poço (1:50), mas outras concentrações de estoque (100x, 300x) também funcionam. No entanto, se os medicamentos forem diluídos em solventes diferentes da água (por exemplo, DMSO), a concentração final não deve exceder 0,5%. Os solventes rapidamente se tornam prejudiciais ao C. elegans. Assim, as soluções de estoque de medicamentos dissolvidos em solventes orgânicos, como o DMSO, devem ser 300x ou mais.
Pontuação de vermes vivos e mortos: 
A determinação de animais vivos e mortos é baseada no movimento do verme. A luz forte, especialmente a luz azul, é usada porque faz com que os animais se movam. Além disso, pontuar o número de animais por poço revelará se há excesso de mortes. O excesso de mortes pode ocorrer com substâncias tóxicas ou altas concentrações (>0,5%) de vários solventes, incluindo DMSO. Geralmente, deve haver menos de 1:100 (1%) animais mortos. As placas podem ser agitadas por 30 s a 800 rpm no agitador de placas de microtitulação se a comida assentar e a população se tornar difícil de contar. Ignore poços com machos ou mais de 16 vermes (ver problemas).
Problemas potenciais:
Agitação inadequada: 
Em um meio líquido, as bactérias podem facilmente se aglomerar e se estabelecer no fundo dos poços. Em nossa experiência, agitar por menos de 20 minutos pode não conseguir quebrar os aglomerados bacterianos e ressuspendê-los, causando medições imprecisas de OD600 . As medições de OD600 na presença de aglomerados bacterianos subestimarão a concentração bacteriana. Configurações excessivas do agitador podem fazer com que o líquido fique preso ao selador. Uma vez que o selador é removido para a leitura OD600 , o líquido preso ao selador resultará em uma leitura OD600 mais baixa. Se houver líquido no selador, gire rapidamente a placa em velocidade baixa (500-1.000 rpm) e agite novamente por 5 min. Além disso, certifique-se, conforme indicado para as leituras no Dia 1 e no Dia 4, de ler dentro de 10 minutos após agitar as placas para evitar que as bactérias se acalmem.
Diferentes valores absolutos de ingestão alimentar entre experimentos: 
Apesar de nossos melhores esforços para padronizar as preparações bacterianas, elas geralmente diferem de maneiras que afetam a ingestão de alimentos em vermes. Por exemplo, devido ao seu estado de divisão, as bactérias diferem em tamanho com base no fato de terem sido colhidas no crescimento logarítmico ou na fase estacionária, com as bactérias logarítmicas sendo maiores. Devido às medições do OD600 não distinguirem entre os tamanhos, as diferenças no tamanho bacteriano devido à fase em que a bactéria foi colhida podem levar às diferenças aparentes observadas na ingestão alimentar basal entre as preparações bacterianas. A melhor maneira de comparar entre experimentos é sempre incluir uma população de controle N2 não tratada e normalizar os resultados para essa população N2.
Efeitos de aglomeração: 
A concentração bacteriana neste protocolo é suficiente para manter o OD600 na faixa linear para 2-16 vermes por poço por ~ 72 h. Dependendo do medicamento de interesse, um poço contendo mais de 16 vermes pode esgotar a concentração bacteriana antes da segunda medição. Também descobrimos que poços com um animal tendem a não ser confiáveis. O fator de lise supera o que um único verme come. Assim, pequenos erros na determinação do fator de lise afetam desproporcionalmente os poços com menos vermes.
Recomendamos excluir poços das análises estatísticas se uma das condições abaixo for atendida. Há machos no poço (não temos dados comparando a ingestão de alimentos entre machos e hermafroditas); há menos de 2 vermes no poço ou mais de 16 vermes no poço; vermes estão mortos na segunda leitura; ou se houver progênie nos poços porque o FUdR falhou. O FUdR é sensível ao calor e é inativado mesmo por temperaturas tão baixas quanto 37 °C. Sempre descongele o FUdR em água em temperatura ambiente.
Valores negativos de ingestão alimentar:
Os valores de ingestão de alimentos são ocasionalmente negativos, sugerindo mais alimentos no Dia 4 do que no Dia 1. Valores negativos de ingestão alimentar podem indicar um dos seguintes fatores: alta taxa de autólise , possivelmente causada por uma adição de fármaco que atua sobre a bactéria, ou valores negativos de ingestão alimentar, o que pode sugerir que o poço está contaminado e algo diferente de vermes está crescendo. As taxas de autólise também aumentam à medida que as bactérias envelhecem; portanto, recomendamos o uso de bactérias com no máximo uma semana. Um medicamento que precipita com o tempo foi adicionado, afetando o valor OD600 . Agitação insuficiente no Dia 1 pode levar a uma leitura de OD600 mais baixa devido a aglomerados bacterianos. Os vermes sofreram estresse hipóxico. Isso ocorre quando a relação superfície-ar não é suficiente para permitir a troca de oxigênio. Use a placa específica de 96 poços nos materiais e não exceda 150 μL (120 μL + 30 μL de FUdR) por poço. A distância entre a superfície do poço e o fundo onde vivem os vermes determina a concentração de oxigênio.
Limitações:
Este ensaio é limitado à cultura líquida. Os comportamentos alimentares observados em pratos sólidos, como entrar e sair de gramados de alimentos, não podem ser avaliados com o ensaio.

Caenorhabditis elegans tem sido amplamente utilizado na pesquisa do envelhecimento.  Tem sido um modelo poderoso para estudar a genética subjacente à longevidade mediada pelo metabolismo induzida por restrição alimentar, atividade mitocondrial reduzida ou sinalização de insulina reduzida. 1,2,3,4,5,6,7. No entanto, medir a alimentação no contexto da longevidade tem se mostrado difícil para C. elegans devido ao pequeno tamanho do animal 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
A alimentação é um comportamento biológico fundamental necessário para a sobrevivência, e sua regulação rígida está no centro da manutenção da saúde metabólica, reprodução e envelhecimento. O comportamento alimentar é controlado por múltiplas vias de sinalização tanto no sistema nervoso quanto na periferia e, portanto, só pode ser estudado in vivo 16,17,18,19. A alimentação representa o primeiro de três pilares: (i) ingestão de energia, (ii) armazenamento de energia e (iii) gasto de energia que governa a homeostase energética de um organismo. A alimentação em C. elegans foi investigada principalmente pela medição do bombeamento faríngeo, definido pela taxa de contrações da faringe. Essa abordagem forneceu informações cruciais sobre o comportamento alimentar de C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; no entanto, o bombeamento faríngeo, especialmente medido em curtos intervalos de minutos, não está necessariamente correlacionado com a ingestão de alimentos.
A ingestão de alimentos não é determinada apenas pela taxa de bombeamento faríngeo, mas também por parâmetros como duração e frequência das sessões de alimentação e a densidade das bactérias alimentares. Um animal pode ter um bombeamento faríngeo muito alto, mas a duração de suas sessões de alimentação pode ser menor, compensando o aumento da taxa. Outro fator de confusão é a eficiência pela qual o bombeamento pode ou não ingerir e triturar bactérias. Um exemplo extremo de desacoplamento da ingestão de alimentos do bombeamento faríngeo é a adição de serotonina sem a presença de qualquer alimento (bactéria). Na presença de serotonina exógena, os animais bombeiam em alta taxa, mas sem a presença de bactérias, a alta taxa de bombeamento não leva à ingestão de alimentos 2,6,13,22,23.
O método de depuração bacteriana apresentado aqui mede a ingestão de alimentos das populações de vermes em poços individuais como o declínio das concentrações bacterianas ao longo do tempo (Figura 1). Essa abordagem é semelhante àquelas utilizadas em outras espécies, onde o desaparecimento de alimentos representa uma medida da ingestão alimentar 10,11,24,25,26,27,28. Na publicação original, validamos esse método de medição da ingestão alimentar alimentando C. elegans com bactérias marcadas com isótopos 15N11. Medições subsequentes por espectrometria de massa mostraram que a medição do desaparecimento de bactérias se correlacionou fortemente com a ocorrência de marcação de isótopos, revelando a absorção real da bactéria no animal11. Assim, estamos confiantes de que o ensaio de depuração bacteriana representa a ingestão de alimentos na maioria das circunstâncias. O objetivo do ensaio não é substituir o ensaio de bombeamento faríngeo, mas adicionar à caixa de ferramentas de ensaios para estudar a alimentação e o metabolismo em C. elegans e como isso se relaciona com o envelhecimento e a longevidade.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>RPI</td><td>A40030-0.1</td><td>solvente: EtOH</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Científico</td><td>BP176025</td><td>Solvente: Água</td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD Biociências</td><td>211677</td><td>uso para fazer placas NGM</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Fisher Científico</td><td>46-100-RG</td><td>Solvente: Água</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Fisher Científico</td><td>22363547</td><td>40 &micro; m para remover adultos</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>MP Biomédicos</td><td>02101380-CF</td><td>5 mg/mL estoque</td></tr><tr><td>Difco, ágar, bacteriológico</td><td>BD Biociências</td><td>214510</td><td>uso para fazer placas NGM</td></tr><tr><td>Fluorodesoxiuridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0503</td><td>para esterilizar vermes em L4</td></tr><tr><td>Caldo de Luria</td><td>RPI</td><td>L24045-1000.0</td><td>cápsula aberta, misture com 1 L de água, autoclave</td></tr><tr><td>Amortecedor M9</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis em temperatura ambiente Para preparar 1 L: &nbsp; 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) &nbsp; 5 g de NaCl (FW: 58), 0,25 g de MgSO4*7H2O (FW: 246) &nbsp; autoclave</td></tr><tr><td>Seladora de microplacas</td><td>Fisher Científico</td><td>236707</td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Falcão</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Tecano</td><td>30016056</td><td>Use lente de filtro de 600 nm</td></tr><tr><td>Citrato de potássio, 1 M, pH 6</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis em temperatura ambiente Para preparar 1 L: 268,8 g Citrato de potássio tribásico monohidratado (FW: 324) 26,3 g ácido cítrico monohidratado (FW: 210) 900 mL de dH2O pH a 6 usando autoclave 5 M KOH &nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio, 1 M, pH 6&nbsp;</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis em temperatura ambiente Para preparar 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O &nbsp; pH até 6 usando autoclave 5 M KOH </td></tr><tr><td>S-Basal</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis em temperatura ambiente Para preparar 1 L: 5,9 g de NaCl (FW: 58) &nbsp; 50 mL de fosfato de potássio 1 M (pH 6) adicionar 900 mL de dH2O autoclave, esfriar a 55 &graus; C</td></tr><tr><td>S-Completo</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis à temperatura ambiente Para preparar 1 L: Adicionar a 1 L de S-basal (resfriado a 55 &graus; C ou RT) &nbsp; 10 mL de citrato de potássio 1 M &nbsp; pH 6, 10 mL de soluções de metais traços &nbsp; 3 mL de 1 M CaCl2 3 mL de 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>Cloridrato de serotonina</td><td>Thermo Científico</td><td>AAB2126309</td><td>usado em 5 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td>para fazer buffers e placas NGM</td></tr><tr><td>Caldo fantástico</td><td>Thermo Científico</td><td>J75856-A1</td><td>12,5 g em 250 mL de água, autoclave</td></tr><tr><td>Agitador de chapa de titulação</td><td>Thermo Científico</td><td>88880023</td><td>agitado a 800 rpm, depende do agitador</td></tr><tr><td>Solução de Metais Traços&nbsp;</td><td>Preparado em laboratório</td><td></td><td>Armazenar em condições estéreis à temperatura ambiente Para preparar 1 L: 1,86 g Na2EDTA (FW: 372,24) 0,69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) &nbsp; 0,20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0,29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) &nbsp; 0,016 g de CuSO4 (FW: 158) autoclave envolto em papel alumínio para manter no escuro</td></tr></tbody></table>

quantificando a ingestão de alimentos em caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

A alimentação é um processo biológico essencial para o crescimento, reprodução e sobrevivência de um organismo. Este ensaio tem como objetivo medir a ingestão alimentar de Caenorhabditis elegans (C. elegans), um parâmetro importante no estudo da genética do envelhecimento ou metabolismo. Na maioria das espécies, a alimentação é determinada medindo a diferença entre a quantidade de alimento fornecida e a quantidade restante após um determinado intervalo de tempo. O método aqui apresentado utiliza a mesma estratégia para determinar a alimentação de C. elegans. Ele mede a quantidade de bactérias, a fonte de alimento de C. elegans, eliminadas em 72 h. Este método usa placas de microtitulação de 96 poços e permitiu a triagem de centenas de medicamentos por sua capacidade de modular a ingestão de alimentos a uma velocidade e profundidade não possíveis em outros modelos animais. A força deste ensaio é que ele permite medir a alimentação e a expectativa de vida simultaneamente e mede diretamente o desaparecimento de alimentos e, portanto, é baseado nos mesmos princípios usados para outros organismos, facilitando a comparação de espécie para espécie.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> Figura 3: Dados representativos. (A) O gráfico mostra as curvas dose-resposta da mudança de dobra na ingestão de alimentos em função da concentração de serotonina. Todos os dados mostram ingestão alimentar basal não estimulada normalizada para alimentação basal N2. Observe que os animais daf-16 (mu86) comem mais do que o tipo selvagem N2 quando nenhuma serotonina foi adicionada, mas mostram uma faixa embotada em sua capacidade de controlar a alimentação. (B) O gráfico mostra um gráfico de violino de mudança de dobra na ingestão de alimentos de vermes tratados com 50 μM do antipsicótico Loxapina, mas alimentados com bactérias mortas por raios-X, raios-γ ou paraformaldeído (C) O gráfico mostra um gráfico de violino de mudança de dobra na ingestão de alimentos de diferentes mutantes com seus genótipos indicados no eixo x. Esses dados sugerem que os mutantes exc-4 e cgr-1 comem menos, enquanto os mutantes srp-6 comem mais. Os asteriscos representam ** p &lt; 0,001, **** p &lt; 0,0001 conforme determinado por ANOVA e Brown-Forsythe-Welch, post-hoc corrigido para levar em conta o teste de múltiplas hipóteses. As barras de erro mostram ±S.E.M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 1 destaca o fluxo de trabalho geral desse protocolo. Ele ilustra todo o processo, desde a fabricação da bactéria até a aquisição da leitura do OD600 no dia 1 e no dia 4. Além disso, o infográfico faz referência às etapas específicas dos métodos que estão sendo usados. A Figura 2A, B mostra dois possíveis layouts de placas experimentais, incluindo poços de controle "sem vermes" na linha H, necessários para calcular as taxas de autólise descritas na seção de discussão. Na experiência de nosso laboratório, é necessário que uma das condições seja o controle de N2 não tratado para levar em conta a variabilidade da ingestão bacteriana de vermes observada entre os experimentos (ver discussão: Planejamento [população de referência N2]).
A Figura 2C é um exemplo da planilha usada para analisar os dados gerados neste protocolo. Ele destaca a contagem de vermes em verde, a selflysis em azul, o dia 1 OD600 e o dia 4 OD600 em laranja, e a ingestão de alimentos por verme em vermelho. Além disso, cada poço é rastreado quanto à cepa, medicamento, concentração, data do experimento e outros tratamentos adicionados. Mais informações sobre as equações específicas usadas podem ser encontradas na seção 3 do protocolo. No geral, essas planilhas (modelo fornecido como Materiais Suplementares) fornecem coleta e análise de dados eficientes desse protocolo.
A Figura 3A mostra resultados representativos para uma curva dose-resposta de como a serotonina modula a alimentação em mutantes N2 e daf-16 usando este protocolo. Neste experimento, a mudança de dobra da ingestão basal de alimentos (primeiro ponto na curva) foi calculada em cinco doses crescentes de serotonina. Como esses resultados destacam, a cepa N2 é capaz de comer demais de maneira dependente da dose. No entanto, para o mutante daf-16 (mu86), embora a alimentação basal seja maior que N2, o mutante não pode responder à serotonina da mesma maneira dependente da dose que a cepa N2. Este protocolo permite determinar o comportamento alimentar entre duas linhagens onde a concentração de serotonina foi o fator variável para gerar curvas dose-resposta. A Figura 3B mostra a ingestão alimentar de vermes tratados com o antipsicótico Loxapina, mas alimentados com bactérias mortas por raios-X, raios-γ ou paraformaldeído. Observe que esses experimentos não foram conduzidos em paralelo e que as diferenças não são representativas dos diferentes métodos para matar as bactérias, mas são devidas à variabilidade interexperimental. A Figura 3C mostra a ingestão alimentar de uma série de cepas genéticas, com duas cepas mostrando uma diminuição e uma cepa mostrando um aumento no comportamento alimentar em relação ao N2. Esta aplicação do protocolo permite o teste de um medicamento em uma concentração em diferentes origens genéticas. É adequado para identificar antecedentes genéticos que mostram uma resposta de ingestão de alimentos diferente dos controles N2 do tipo selvagem quando administrados com o mesmo medicamento. Ele pode ser combinado com nosso protocolo de vida útil para rastrear rapidamente a ingestão de alimentos e a vida útil na mesma configuração de prato31.
Material suplementar: Modelos de planilha mostrados na Figura 2C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses materiais.</a>

Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Minha pesquisa se concentra na compreensão das vias transcricionais e metabólicas subjacentes às mudanças induzidas por drogas no comportamento alimentar. Estou trabalhando para identificar medicamentos que reduzem a ingestão de alimentos e prolongam a vida útil, indicativos de ativação de vias saudáveis de jejum. Usando nosso ensaio de depuração bacteriana, identificamos duas vias distintas que modulam a ingestão de alimentos induzida por serotonina e a ingestão de alimentos induzida por antipsicóticos.Agora estou estudando como essas vias se relacionam com a alimentação em mutantes de vida longa. Este protocolo permite que os pesquisadores estudem a relação entre alimentação e longevidade. A taxa de alimentação é geralmente caracterizada por bombeamento faríngeo.No entanto, a taxa de bombeamento em C. elegans não é necessariamente proporcional à quantidade de comida ingerida. Quando adicionado aos ensaios anteriores, este protocolo fornece uma quantidade quantificável de ingestão de alimentos por população de vermes. Nosso ensaio nos permite modular quantitativamente a alimentação usando pequenas moléculas e determinar como a mudança induzida altera a vida útil simultaneamente.

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este vídeo apresenta um método para visualizar e medir a integridade do lúmen intestinal de C. elegans alimentando vermes com dextrana marcada com FITC. O protocolo de exemplo mostra o ensaio feito com vermes tratados com 3,3'-diindolilmetano (DIM) e alimentados com patógenos.

Alimentação com FITC-Dextrano: Um Método para Quantificar a Permeabilidade Intestinal em C. elegans

Fonte: Taylor, M. N., et.al. Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade nas interações Caenorhabditis elegans-bacterianas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a exposição de vermes Caenorhabditis elegans livres de germes e pareados por idade a uma cepa bacteriana para colonização intestinal. Explica a remoção seletiva de bactérias externas e não aderidas, deixando apenas bactérias viáveis aderidas ao epitélio intestinal para quantificação.

Avaliação da colonização bacteriana intestinal em C. elegans livre de germes

Fonte: Le, T. A. N. , et al., Medindo os Efeitos de Bactérias e Produtos Químicos na Permeabilidade Intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a permeabilidade intestinal em C. elegans exposto a Pseudomonas aeruginosa. Comparados aos controles alimentados com Escherichia coli, os vermes tratados com patógenos apresentam maior vazamento de fluoróforos para a cavidade corporal, indicando danos na barreira...

Avaliação da permeabilidade intestinal em C. elegans após exposição bacteriana

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para medir a carga bacteriana de E. coli após a injeção de E. coli no tórax de Drosophila melanogaster.

Medindo a carga bacteriana de E. coli em Drosophila melanogaster após infecção por E. coli

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Um procedimento que permite uma demonstração de aumento robusto de droga que procura, em ratos com restrição de alimentos é descrito. Após o treinamento de auto-administração de heroína, os ratos passam por um período de abstinência, em um ambiente livre de drogas, durante a qual eles são levemente restrição alimentar. Procura de droga é então testada no ambiente associadas à droga.

Um procedimento para estudar o efeito da restrição alimentar prolongada em heroína Buscando em ratos abstinentes

Aprenda a quantificar a ingestão alimentar em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana em cultura líquida. Este método permite estudar a relação entre comportamento alimentar e longevidade em nematoides.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

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