Name: Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: Aprenda a isolar mutantes de interação nula usando o ensaio de dois híbridos de levedura. Este método permite estudar interações proteicas críticas para a regulação do ciclo celular em eucariotos.

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Y. Tanaka realizou o aprimoramento técnico do Y2H. Este trabalho é apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 e pelo Institute for Fermentation, Osaka.

1. Construção da biblioteca mutante
<ol><li>Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR4. NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de erro mais alta, como a Taq polimerase, que não possui atividade de revisão. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for longo, uma polimerase de maior fidelidade é necessária para reduzir o número de mutações. As mutações ocorrem a cada poucas centenas de pares de bases após 30 ciclos de amplificação com Taq polimerase4 regular. Nos resultados representativos, uma Taq polimerase diferente foi usada (ver Tabela de Materiais), que tem maior fidelidade do que a Taq polimerase regular, e a taxa de mutação foi de um em 600 pares de bases. Um exemplo das misturas de PCR, os detalhes do primer e as condições de reação são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.</li>
	<li>Quando a PCR estiver concluída, combine todas as alíquotas da reação, confirme se os fragmentos de DNA de interesse foram amplificados usando eletroforese em gel de agarose, etc., e purifique o DNA5.</li>
	<li>Montar o fragmento de ADN gerado no passo 1.2 com o vector Y2H adequado, utilizando uma estratégia de clonagem «sem costuras» (figura 1). NOTA: O sistema de clonagem contínuo, como o conjunto Gibson6, minimiza a contaminação da biblioteca mutante construída por vetores vazios gerados por autoligação . Uma lista de vetores Y2H é fornecida na Tabela 1. Eles podem ser preparados por digestão BamHI antes da montagem. Todos os plasmídeos estão disponíveis no Projeto Nacional de BioRecursos - levedura (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Introduza a mistura de reação gerada na etapa 1.3 em células competentes para Escherichia coli preparadas de acordo com um protocolo de transformação de E. coli altamente eficiente (por exemplo, Inoue et al.7). Espalhe todas as células competentes em várias placas LB (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl e 2% de ágar) contendo antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais). Neste ponto, espalhe uma pequena quantidade (~ 1/100 da reação total) na mesma placa de seleção para calcular o título da biblioteca. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Uma vez que um grande número de colônias de E. coli tenha aparecido, raspe todas as células da superfície da placa usando um laço de plástico descartável. Recupere o DNA do plasmídeo dessas células usando métodos populares, como a lise alcalina8. Ao mesmo tempo, conte o número de colônias que aparecem depois de espalhar pequenas alíquotas da mistura de transformação na placa. Usando esse número, estime o número total de clones independentes na biblioteca. NOTA: Neste ponto, pegue algumas colônias independentes (4-6) que aparecem na placa na qual as pequenas alíquotas da reação de transformação foram espalhadas, cultive-as separadamente e isole os plasmídeos delas para confirmar que praticamente todos os clones carregam os fragmentos de DNA desejados5. Muitos kits comerciais estão disponíveis para isolar plasmídeos de E. coli. O número de colônias que aparecem na placa após espalhar pequenas alíquotas pode ser contado manualmente.</li>
	<li>Meça a concentração do pool de DNA da biblioteca. Normalmente, algumas centenas de nanogramas de DNA de biblioteca são suficientes para obter vários milhares de transformantes na próxima etapa. NOTA: Recomenda-se medir a concentração de DNA usando um corante fluorescente que se liga ao DNA porque a medição de A260 é frequentemente imprecisa.</li>
</ol>2. Transformação de levedura com a biblioteca mutante e réplica de revestimento
<ol><li>Introduza a biblioteca mutante na cepa de levedura hospedeira (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) para o ensaio Y2H usando cerca de 100 ng de DNA. Pré-transforme as células hospedeiras com o plasmídeo 'isca'.<ol><li>Após o procedimento de transformação, suspenda as células de levedura em água estéril e espalhe alíquotas de diferentes quantidades em placas apropriadas (geralmente meio SC sem leucina e triptofano: SC-LW [0,67% de base de nitrogênio de levedura, 2% de glicose, 1,546 g / L de mistura dupla de eliminação SC -Leu -Trp e 2% de ágar, consulte a Tabela de Materiais]). Incubar estas placas durante a noite a 30 °C. NOTA: O protocolo padrão, como o método acetato de lítio-PEG11 com ~ 5 × 106 células de crescimento logaritmicamente, é suficiente para a transformação da levedura. Outro método com alta eficiência de transformação, como a eletroporação, também pode ser usado.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia seguinte, quando aparecerem pequenas colônias, selecione as placas com um número apropriado de células (500-2000) e faça réplicas delas da seguinte maneira.</li>
	<li>Coloque duas folhas de papel de filtro em um bloco de réplica para fazer várias réplicas (o meio é SC-LW e SC-LW contendo canamicina) (consulte a Tabela de Materiais). Incubar a 30 °C durante 1-2 dias. NOTA: A concentração de canamicina (G418) é de 600 μg/mL. Não use veludo para réplicas de chapeamento, pois a resolução das colônias será perdida.</li>
	<li>Depois que as colônias crescerem, compare as placas e escolha os candidatos. Execute um ensaio de cor Y2H (consulte a etapa 3) se lacZ for usado como relator. NOTA: Para o repórter Y2H, lacZ geralmente é melhor em detectar uma interação fraca do que HIS3.</li>
</ol>3. Ensaio de cor Y2H
<ol><li>Coloque uma folha de papel de filtro cortada antecipadamente no tamanho apropriado na placa de réplica preparada usando a etapa 2. Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre o papel de filtro e a placa. NOTA: Use papel de filtro nº 4A ou papel de filtro de grau 50 (consulte a Tabela de Materiais). Qualquer SC-LW ou SC-LW contendo placas de canamicina, que são feitas por réplica de chapeamento, pode ser usada para o ensaio de cor.</li>
	<li>Quando o papel de filtro na placa estiver completamente umedecido (quando a cor do papel de filtro mudar completamente), coloque várias folhas de papel toalha por cima e coloque-o em contato com o papel de filtro para remover o excesso de umidade. Remova a toalha de papel quando ela absorver a água e mudar de cor. Repita esse processo duas ou três vezes.</li>
	<li>Pegue as bordas do papel de filtro com uma pinça, retire-o da placa rapidamente, mergulhe-o em nitrogênio líquido e congele-o. Se o nitrogênio líquido não estiver disponível, coloque o papel de filtro em uma bandeja de plástico com a colônia voltada para cima e coloque-o imediatamente em um freezer (-20 °C a -80 °C) para congelar completamente.</li>
	<li>Retire o papel de filtro congelado e coloque-o, com a colônia voltada para cima, sobre uma toalha de papel seca para descongelar. Imediatamente após o descongelamento, coloque o papel de filtro, com a colônia voltada para cima, em outro papel de filtro que tenha sido colocado em uma bandeja plástica ou recipiente lacrado e embebido em tampão Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl e 1 mM MgSO4, pH 7,0) contendo X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo) e 2-mercaptoetanol9 (ver Tabela de Materiais). Tenha cuidado para não permitir a formação de bolhas de ar entre os papéis de filtro superior e inferior.</li>
	<li>Cubra a bandeja plástica que contém o papel de filtro e coloque-a em um recipiente hermético ou saco plástico. Feche o recipiente hermético ou saco plástico e incube-o a 37 °C até que apareça uma cor azul.</li>
	<li>Quando aparecer uma cor azul, coloque o papel de filtro com a colônia voltada para cima sobre cerca de 500 μL de solução de parada (1 M Na2CO3) colocada em uma bandeja plástica limpa. A solução de parada é absorvida rapidamente; Portanto, remova o filtro imediatamente, coloque-o sobre uma toalha de papel limpa com a colônia voltada para cima e deixe secar.</li>
	<li>Depois que a toalha de papel for substituída e o filtro estiver seco o suficiente, use um scanner ou outro dispositivo para capturar os dados.</li>
</ol>4. Recuperação e confirmação de clones candidatos
<ol><li>Selecione clones candidatos brancos e KanR da placa original da réplica (ou da placa replicada não usada para o ensaio de cores). Os exemplos são mostrados na Figura 1C. Confirmar se os clones candidatos são brancos e KanR , colocando-os novamente como uma pequena mancha em meio SC-LW contendo canamicina e incubando-os a 30 °C durante 1-2 dias. Faça pelo menos duas séries ou faça réplicas no dia seguinte. NOTA: As colônias brancas devem ser selecionadas porque as colônias azuis claras podem reter a interação.</li>
	<li>Uma vez que os clones candidatos tenham crescido bem, repita o ensaio de cor com pelo menos uma placa gerada na etapa 4.1, conforme descrito na etapa 3, e confirme se eles permanecem brancos e não ficam azuis (Figura 2A). NOTA: Ao listrar novamente os candidatos, não transfira grandes quantidades de células. Muitas células tornam impossível distinguir os clones KanR e KanS .</li>
	<li>Pegue os clones que ainda são brancos e KanR gerados na etapa 4.2 a partir dos restos da placa e cultive-os independentemente em 1 mL de meio de seleção (SC-L ou SC-W, dependendo de qual vetor é usado para a construção da biblioteca) durante a noite a 30 ° C.</li>
	<li>Transfira a cultura para um microtubo e colete as células por centrifugação (~ 15.000 × g, por 10-30 segundos à temperatura ambiente). Isole o DNA completo do pellet celular da seguinte forma.</li>
	<li>Suspenda o pellet celular em 400 μL de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) contendo 1 μL de 2-mercaptoetanol e 20 mg / mL de Zymolyase 100T (ver Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 30 min para digerir as paredes celulares. Neste momento, misture delicadamente invertendo o tubo a cada 5-10 min.</li>
	<li>Quando a suspensão celular se tornar opaca ou translúcida, adicione um volume igual de uma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem por vórtice em velocidade moderada por 10-20 s.</li>
	<li>Centrifugue os microtubos em uma microcentrífuga por 5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) e recupere a fase aquosa contendo DNA em um novo microtubo. Adicione 0,8 volume de isopropanol e misture bem invertendo o tubo.</li>
	<li>Deixe o tubo em temperatura ambiente por 2-3 min e depois centrifugue em uma microcentrífuga por 4-5 min em velocidade máxima (~ 15.000 × g, à temperatura ambiente) para precipitar o DNA.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lavar o precipitado com cerca de 500 μL de etanol a 70%. Remover completamente o etanol e secar brevemente o precipitado.</li>
	<li>Adicione 20 μL de tampão TE (10 mM Tris-Cl (8,0) e 1 mM EDTA) ao precipitado, misture brevemente e deixe o tubo durante a noite à temperatura ambiente para dissolver o precipitado. NOTA: Se os usuários estiverem com pressa, mantenha os tubos a 37-50 °C. O precipitado de DNA se dissolverá em algumas horas.</li>
	<li>Assim que o pellet estiver completamente dissolvido, transforme E. coli com uma pequena quantidade dessa solução de DNA. NOTA: Cerca de 0,5 μL de solução de DNA é suficiente se E . coli com alta eficiência de transformação for usada.</li>
	<li>Quando as colônias de E. coli aparecerem, escolha várias colônias independentes, cultive-as e recupere plasmídeos por métodos padrão, como lise alcalina.</li>
	<li>Introduza o DNA do plasmídeo obtido na etapa 4.12 nas células hospedeiras Y2H que abrigam o plasmídeo da isca. Quando os transformantes aparecerem, verifique-os pelo ensaio de cores (eles devem aparecer brancos) e western blotting4 (eles devem expressar uma proteína do tamanho desejado). NOTA: O método pós-alcalino12 é uma maneira fácil e rápida de preparar um extrato de células inteiras a partir de levedura.</li>
	<li>Se os dois critérios acima forem atendidos, determine o local de mutação dos clones por sequenciamento de nucleotídeos4.</li>
</ol>

Estudos de interação biomolecular usando a técnica de dois híbridos de levedura 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H 2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significativa de t...

As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo1. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A proteína de fusão DB-X se liga a uma sequência de reconhecimento do domínio DB; portanto, quando as proteínas X e Y interagem, a proteína de fusão AD-Y se aproxima da sequência de reconhecimento. Consequentemente, a transcrição do gene repórter a jusante da sequência de reconhecimento é ativada. Portanto, a presença ou ausência de atividade do gene repórter pode ser usada para determinar a presença ou ausência da interação proteína-proteína1.
Uma vez identificado um parceiro de interação específico da proteína de interesse, análises adicionais devem ser realizadas para elucidar a função biológica da interação. Para isso, se os mutantes das proteínas que prejudicam ou removem a interação proteína-proteína específica puderem ser isolados, eles servirão como ferramentas poderosas. O sistema Y2H pode ser usado diretamente para isolar esses mutantes rastreando clones de 'interação negativa', começando com o clone de 'interação positiva' do tipo selvagem. Para acelerar esse processo, foram desenvolvidos sistemas Y2H 'reversos' (rY2H) 2,3. Nos sistemas rY2H, as cepas de levedura hospedeiras abrigam genes marcadores contra-selecionáveis como genes repórteres, o que significa que as células de levedura crescem apenas quando as proteínas AD-Y e DB-X não interagem.
Embora os sistemas Y2H e rY2H permitam o isolamento de mutantes negativos para interação, o processo de isolamento dos mutantes é trabalhoso porque nem todos os candidatos obtidos por triagem carregam o tipo desejado de mutações (geralmente mutações missense). O problema mais sério é que uma fração significativa de candidatos abriga frameshift ou mutações sem sentido, e é necessário realizar western blotting para excluir clones indesejados. Para superar esse problema, novos vetores de plasmídeo foram desenvolvidos4. Nesses vetores, KanMX, um marcador de resistência a medicamentos, é posicionado fora do quadro a jusante do domínio DB ou AD. O gene marcador torna-se enquadrado no domínio DB ou AD somente quando o gene de interesse é inserido. Quando uma (s) mutação (ões) aleatória (s) é introduzida (s) no gene de interesse, mutantes indesejáveis, como aqueles com frameshift ou mutações sem sentido, podem ser facilmente eliminados realizando a seleção de resistência a medicamentos, e os candidatos portadores de mutações missense desejáveis podem ser facilmente identificados com a tela Y2H4. Este artigo apresenta um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada de uma proteína de interesse usando essa estratégia.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (8,0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS de 10%</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kishida Chemical Co. Ltd.</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranosídeo (X-Gal)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina de Sódio</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>Médico e Laboratórios Biológicos Co. Ltd.</td><td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA de testículos de salmão</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro para elevador de colônia (Grau 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro para elevador de colônia (No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>01411090</tr><tr><td>Papel de filtro para replica (No.1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>Sulfato G-418</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Kishida Chemical Co., Ltd.</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>acetato de lítio di-hidratado</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 12H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; 2H2O</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>Toalha de papel</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>DNAs de plasmídeo</td><td>o Projeto Nacional de BioRecursos - levedura (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de plasmídeo</td><td>Nippon Genetics Co. Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol # 4.000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC mistura de dupla saída -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonagem sem costura (montagem In-Fusion)</td> <td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerase (GoTaq Green Master Mixes)</td> <td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hidroximetil) aminometano</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>ThermoFisher scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura (YNB)</td> <td>para Zymolyase</td><td>de CYN0210</td><td></td>Médio</tr><tr><td>100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>Rolamento 07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.

Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o método descrito aq...

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Estamos interessados em entender os mecanismos regulatórios do ciclo celular em eucariotos, especialmente a relação entre replicação de DNA, manutenção estável de germes e proliferação celular. A progressão do ciclo celular é regulada por quinases dependentes de ciclina, ou CDKs, em eucariotos. Este é o caso do início da replicação do DNA.Identificamos uma maneira, em substratos de CDKs, de iniciar a replicação do DNA. Para entender a função da proteína de seu interesse, uma comparação do tipo selvagem e do mutante é uma maneira direta e eficaz. Ensaio de dois híbridos de levedura, sendo de detecção simples e melhorará o processo de isolamento de mutantes de interação nula.Isso contribuirá para o avanço da pesquisa na área.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.

Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina

Este vídeo demonstra o ensaio de dois híbridos de levedura para detectar autointerações proteicas específicas. Neste ensaio, a proteína de interesse é marcada em dois domínios de um fator de transcrição que codifica a enzima β-galactosidase. Quando as duas proteínas interagem, isso causa transcrição e tradução para formar a enzima, que é então detectada usando um ensaio bioquímico.

Ensaio de dois híbridos de levedura para determinar a autoassociação de proteínas em células de levedura

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

O cetoconazol se liga e antagoniza a ativação do receptor X do pregnano (PXR). Telas de alto rendimento de leveduras de mutantes PXR definem uma região única para a ligação ao cetoconazol. Este método genético baseado em levedura descobre novas interações de receptores nucleares com ligantes que se associam a locais de ligação de superfície.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de &gt; 1.000 TFs em uma única experiência.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Aprenda a isolar mutantes de interação nula usando o ensaio de dois híbridos de levedura. Este método permite estudar interações proteicas críticas para a regulação do ciclo celular em eucariotos.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

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