Name: Isolamento rápido de oócitos estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprenda a isolar rapidamente oócitos estágio I em peixe-zebra livres de células da granulosa. Este método modificado utiliza tampão de detecção mais suave para minimizar danos celulares e facilitar pesquisas precisas em genômica e epigenética.

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<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento aprimorado para obter oócitos de peixe-zebra estágio I livres de células da granulosa

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
<li>Yan, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+soma+controls+ovarian+follicle+proliferation+through+Gsdf+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish.</a> Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solução de dissociação celular de Kinger</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td><td>A solução de dissociação celular de Kinger pode ser armazenada de forma estável a -20 &deg; C após a embalagem e pode ser usado após o descongelamento a baixa temperatura (4 &deg; C). Pode ser usado diretamente para dissociar ovários de peixe-zebra. A temperatura ideal é de 28,5 & C, por aproximadamente 2-3 horas. A duração pode ser ajustada de acordo com as condições específicas de dissociação, encurtadas ou estendidas (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).</td></tr><tr><td>Filtros de células (100 &mu; m )</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Agulha capilar de vidro</td><td>/</td><td>/</td><td>Embotada por queima com isqueiro</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yesen</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de baixa adsorção (10 &mu; l)</td> <td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 meio médio (com L-glutamina)</td><td>Hyclone</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>/</td><td>/</td><td>Água gelada é usada para sacrificar peixe-zebra</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>Peixes juvenis</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash; 6 semanas pós-fertilização, comprimento padrão [SL] de 10&ndash; Prato de plástico de 15 mm</td></tr><tr><td>(35 mm)</td> <td>SORFA</td><td>230101</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos (6 poços)</td> Tesoura de mola <td>SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento rápido de oócitos estágio i em peixe-zebra desprovido de células da granulosa

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

A Figura 1 ilustra a morfologia ovariana observada em peixes-zebra adultos e juvenis, apresentando oócitos em diferentes estágios de desenvolvimento para servir de referência. A Figura 1A fornece uma representação gráfica da morfologia e tamanho do oócito em cada estágio de desenvolvimento, começando com o estágio primário de crescimento (estágio I) e terminando com o óvulo ovulado (estágio V). As Figuras 1Ai-v ilustram os diâmetros correspondentes aos estágios I a V dos oócitos. A Figura 1B (painel esquerdo) exibe imagens ovarianas em peixes juvenis (6 wpf com SL = 1,5 cm). Notavelmente, o ovário juvenil exibe uma aparência lobular distinta, caracterizada principalmente por uma abundância de oócitos transparentes em estágio I, acompanhados por uma população menor de oócitos em estágio II. Essa prevalência de oócitos em estágio I facilita muito sua observação e recuperação. O painel direito mostra a morfologia do ovário de peixes adultos (6 meses), onde podem ser observados oócitos em vários estágios de desenvolvimento. No entanto, oócitos opacos em estágio avançado (estágio II-III) são predominantes no ovário.
A Figura 2 ilustra os processos representativos desde a dissecção até a obtenção de oócitos limpos em estágio I. A Figura 3 apresenta os oócitos estádio I obtidos pelo método de referência e pelo método modificado. Após a coloração de Hoechst, os núcleos das células do oócito e da granulosa exibiram fluorescência azul sob luz ultravioleta. Nas imagens obtidas pelo método de referência (Figura 3A), a superfície dos oócitos era densamente circundada por numerosos núcleos de células da granulosa corados. Em contraste, os oócitos do estágio I separados pelo método modificado (Figura 3B) exibem exposição e limpeza completas, sem coloração dos núcleos das células da granulosa presentes.
Nossos achados demonstraram a eficácia do método proposto para isolar oócitos em estágio I. O processo de desenvolvimento de oócitos em peixes teleósteos exibe várias características comuns7. Para avaliar sua aplicabilidade entre espécies, análises adicionais foram realizadas em outras espécies de peixes. As botias fêmeas foram adquiridas em um mercado local e os oócitos em estágio inicial (diâmetro &lt;100 μm) foram isolados seguindo o mesmo procedimento. A composição ovariana da botia também exibiu uma mistura de oócitos em múltiplos estágios de desenvolvimento, caracterizada por uma notável semelhança na morfologia e tamanho do oócito com a do peixe-zebra durante o mesmo estágio. Conforme ilustrado na Figura 4A, os ovários de fêmeas adultas foram dominados por oócitos tardios opacos intercalados com oócitos precoces transparentes. Uma monocamada clara de células da granulosa foi observada na superfície dos oócitos. Consistente com nossas observações em peixe-zebra, os oócitos de botia medindo menos de 100 μm de diâmetro corresponderam ao estágio anterior ao estágio de diplóteno. A Figura 4B mostra os oócitos de botia (Misgurnus anguillicaudatus) obtidos pelo método modificado. Em comparação com os ovários de peixe-zebra, os ovários de botia de lagoa são mais difíceis de dissociar. Após 6-7 h de digestão, mais oócitos em estágio inicial se dissociam. No entanto, essa abordagem ajustada produziu os oócitos limpos e nus desejados. O peixe-zebra pertence à família Cyprinidae, enquanto as botias são classificadas na família Cobitidae. Essas duas famílias exibem uma relação taxonômica distante, mas seu estágio de desenvolvimento ovariano e morfologia são notavelmente semelhantes, indicando que esse método geralmente pode ser utilizado para analisar oócitos de várias espécies de peixes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg"> Figura 1: Imagens representativas de ovários e oócitos de peixe-zebra em diferentes estágios. (A) Morfologia e tamanho dos oócitos em cada estágio de desenvolvimento (St). i-v representa as imagens e o diâmetro dos oócitos do estágio I ao V. Barra de escala = 200 μm. (B) Morfologia ovariana do peixe-zebra adulto e juvenil. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg"> Figura 2: Imagens representativas do procedimento de isolamento, desde a dissecção até a aquisição de oócitos limpos em estágio I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg"> Figura 3: Oócitos de estágio I obtidos pelos dois métodos. (A) Oócitos de estágio (St) I isolados pelo método referenciado. (B) Oócitos de estágio I isolados pelo método modificado. Os núcleos das células do oócito e da granulosa foram corados com Hoechst e excitados com luz UV. Barras de escala = 100 μm. BF = campo claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg"> Figura 4: Oócitos em estágio inicial de botia de lagoa obtidos pelo método modificado. (A) Imagens representativas de ovário e oócitos de botia de lagoa. I, II representam os ovários de botias de lagoa sob diferentes ampliações, e III-IV representa os oócitos em estágio inicial de botias. Barras de escala: i (500 μm); ii (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Oócitos em estágio inicial isolados de botia de lagoa. Os oócitos e núcleos das células da granulosa foram corados com Hoechst e excitados com luz UV. Barras de escala = 100 μm. BF = campo claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Isolamento rápido de oócitos estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em&gt; Drosophila</em&gt; Folículo Isolamento

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