Name: Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprenda a entrega intratecal de vetores AAV9 em ratos juvenis por injeção na cisterna lombar. Este método permite avaliar a eficácia da terapia gênica para doenças do sistema nervoso central em modelos pediátricos.

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Os autores gostariam de agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman, da UT Southwestern, por uma discussão produtiva sobre o desafio representado por ratos juvenis para injeção intratecal. Este trabalho foi parcialmente apoiado por financiamento da Jaguar Gene Therapy (para JLFK).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC). Ratos Sprague-Dawley (28-30 dias de idade, massa na faixa de cerca de 90-135 g, machos e fêmeas) foram utilizados no presente estudo.
1. Preparação do vetor
<ol><li>Descongele o vetor AAV9 (consulte a Tabela de Materiais) no gelo no início do procedimento.</li>
	<li>Centrifugue brevemente o tubo de microcentrífuga contendo o vetor em uma centrífuga de mesa para garantir que todo o líquido esteja no fundo do tubo.</li>
	<li>Agite suavemente o tubo da microcentrífuga para garantir que a solução esteja bem misturada.</li>
</ol>2. Preparação da gaiola de recuperação
<ol><li>Coloque uma gaiola limpa em um cobertor elétrico (consulte a Tabela de Materiais) de forma que apenas metade da gaiola fique em contato com o cobertor.</li>
	<li>Defina a temperatura da manta para ~37 °C.</li>
</ol>3. Preparação da plataforma cirúrgica
<ol><li>Aqueça uma almofada isotérmica (consulte a Tabela de Materiais) a 39 ° C em um micro-ondas ou banho-maria para que o conteúdo fique líquido.</li>
	<li>Coloque a almofada isotérmica na plataforma cirúrgica e cubra-a com uma almofada de bancada absorvente limpa.</li>
</ol>4. Preparação animal
<ol><li>Anestesiar os ratos com isoflurano em uma caixa transparente (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Iniciar a indução anestésica com isoflurano a 5% e diminuir 1% por minuto até atingir 2%. Mantenha o animal a 2% por mais 3 min.</li>
	<li>Mova a caixa que prende o animal a um exaustor e abra a caixa. NOTA: Isso limita a exposição do cirurgião ao anestésico.</li>
	<li>Remova o cabelo da parte de trás do animal usando uma máquina de cortar cabelo elétrica. NOTA: Alternativamente, um creme depilatório ou navalha manual e creme de barbear podem ser usados.</li>
	<li>Coloque o animal na plataforma cirúrgica com o focinho no cone do nariz da anestesia. NOTA: O animal pode começar a recuperar a consciência enquanto o pelo é removido do local da cirurgia. Se isso acontecer, anestesia-o novamente conforme descrito acima.</li>
	<li>Aplique pomada lubrificante para os olhos em cada olho para evitar o ressecamento das córneas durante o procedimento.</li>
	<li>Desinfetar a área cirúrgica usando três aplicações alternadas de lenços umedecidos de iodopovidona e isopropanol.</li>
	<li>Injete o(s) analgésico(s) por via subcutânea. NOTA: A buprenorfina é geralmente usada na dose de 0,01-0,05 mg / kg, administrada a cada 12 h. Alternativamente, uma forma de liberação lenta deste medicamento pode ser administrada uma vez a 1 mg / kg para fornecer controle adequado da dor por 72 h. Consulte o IACUC da instituição para obter suas diretrizes sobre o controle da dor.</li>
	<li>Injete 100 μL de lidocaína a 1% por via subcutânea acima dos processos espinhosos L2 a L6 para fornecer anestesia local.</li>
	<li>Coloque um rolo de papel toalha ou um tubo de 1,5 cm de diâmetro sob o animal, apenas rostral até os quadris. Isso ajuda a flexionar a coluna, facilitando a inserção da agulha entre as duas lâminas.</li>
	<li>Coloque uma cortina fenestrada (ver Tabela de Materiais) no animal, centralizando a fenestração sobre a coluna lombar.</li>
</ol>5. Expondo a coluna lombar
<ol><li>Confirme a profundidade da anestesia beliscando cada uma das patas do animal e procurando a ausência de uma resposta de retirada.</li>
	<li>Usando uma lâmina de bisturi #11, faça uma incisão de aproximadamente 3 cm de comprimento na pele na linha média de L2 a L6.</li>
	<li>Afrouxe a pele do músculo inserindo uma tesoura cirúrgica curva estéril entre o músculo e a pele e, em seguida, abrindo as pontas.</li>
	<li>Remova a fáscia que cobre os processos espinhosos L2-L5.</li>
</ol>6. Carregamento da seringa
<ol><li>Pipetar 25-35 μL do vector (para atingir a dose desejada) para dentro da tampa de um tubo de microcentrífuga estéril.</li>
	<li>Aspire todo o volume para a seringa de insulina. NOTA: Tome cuidado para não aspirar ar durante este processo.</li>
</ol>7. Realizando a injeção
<ol><li>Identifique os processos espinhosos L5 e L4. NOTA: L6 fica diretamente entre as duas cristas ilíacas e seu processo espinhoso deve ser fácil de identificar por sondagem com um instrumento rombudo. O instrumento pode então ser executado suavemente na parte de trás para encontrar os limites dos processos L5 e L4.</li>
	<li>Coloque uma mão de forma que o polegar descanse suavemente na cauda e na perna do animal. Use um dedo para firmar a seringa.</li>
	<li>Posicione a agulha da seringa de forma que fique à esquerda do processo espinhoso L5 e alinhada com sua extremidade caudal. Posicione a seringa de forma a que fique a cerca de 30° da linha média e 30° acima do plano da mesa. NOTA: Pode ser útil usar um microscópio cirúrgico para identificar melhor os pontos de referência e posicionar a ponta da agulha.</li>
	<li>Avance a agulha da seringa para a frente cerca de 8 mm, por cima da lâmina L5 e depois por baixo da lâmina L4 no autoclismo lombar até atingir o osso. O posicionamento correto resultará em uma contração da perna e/ou cauda que pode ser vista ou sentida pelo polegar apoiado na perna/cauda. Se não houver contração, remova a agulha e tente o procedimento pelo lado esquerdo. Se ainda não houver contração, repita o procedimento entre L4/L3 e L3/L2 conforme necessário.</li>
	<li>Pressione o êmbolo lentamente por cerca de 5 s. NOTA: Pode haver uma contração na perna ou cauda durante a injeção.</li>
	<li>Segure a seringa no lugar por cerca de 30 s depois de pressionar totalmente o êmbolo para permitir que a pressão se equilibre e minimize o refluxo do injetado quando a agulha for retirada.</li>
	<li>Remova lentamente a agulha.</li>
</ol>8. Fechamento da incisão
<ol><li>Aproxime as bordas da incisão.</li>
	<li>Começando em uma extremidade da ferida, use uma sutura 4-0 (consulte a Tabela de Materiais) ou grampos cirúrgicos para fechar a incisão.</li>
</ol>9. Recuperação e monitorização
<ol><li>Coloque o animal na gaiola pré-aquecida.</li>
	<li>Verifique o animal pelo menos a cada 15 minutos até que esteja totalmente deambulatório. NOTA: Isso deve levar entre 15 minutos e 45 minutos.</li>
	<li>Nos próximos três dias, faça verificações de bem-estar pelo menos diariamente. Forneça analgésicos nos primeiros 2 dias após a cirurgia ou conforme exigido pelo IACUC.</li>
	<li>Uma semana após a cirurgia, remova as suturas ou grampos.</li>
</ol>10. Procedimento de acompanhamento
NOTA: Para determinar a precisão da técnica de injeção, injete o corante azul de tripano conforme descrito acima e, em seguida, eutanasiar imediatamente o animal (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) e realizar uma laminectomia para visualizar o resultado.
<ol><li>Enquanto o animal permanecer sob anestesia, eutanasia-o administrando uma dose letal de pentobarbital via injeção intraperitoneal na dose de 150 mg/kg.</li>
	<li>Assim que a respiração e a atividade cardíaca cessarem, abra a cavidade torácica para garantir a morte. Estenda a incisão cirúrgica até as costas até o pescoço.</li>
	<li>Faça uma incisão de 4 cm de comprimento no músculo paralelo à coluna vertebral em ambos os lados dos processos espinhosos, mantendo-se o mais próximo possível dos processos.</li>
	<li>Usando uma pinça fina ou tesoura, remova o músculo entre os processos espinhosos.</li>
	<li>Remova os processos espinhosos de L6 até a coluna torácica inferior usando um rongeur (ver Tabela de Materiais). Evite movimentos de torção, pois isso pode danificar os rongeurs.</li>
	<li>Insira a ponta inferior do rongeur sob a lâmina L5 e remova o osso que cobre a medula espinhal dando várias "mordidas" nele. NOTA: Puxar para trás o processo espinhoso L6 pode facilitar a inserção da ponta do rongeur. Deve-se tomar cuidado para evitar danos à medula espinhal.</li>
	<li>Continue expandindo a laminectomia pelo menos quatro lâminas rostralmente. Inspecione a superfície interna das lâminas em busca de sinais de corante, o que pode indicar uma injeção com falha.</li>
</ol>

Entrega de punção lombar de AAV9 em ratos juvenis para terapia gênica do SNC

<ol><li>Wurster, C., Petri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+spinal+muscular+atrophy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Progress in spinal muscular atrophy research.</a> Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).</li>
<li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+Novel+therapeutic+targets+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development.</a> Pharmaceutics. 15 (2), 685(2023).</li>
<li>Larkin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+FDA-approved+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">First FDA-approved gene therapy for hemophilia.</a> JAMA. 329 (1), 14(2023).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nadofaragene+firadenovec%3A+First+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Nadofaragene firadenovec: First approval.</a> Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).</li>
<li>Taghian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safe+and+reliable+technique+for+CNS+delivery+of+AAV+vectors+in+the+cisterna+magna%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna.</a> Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+delivery+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+9+to+the+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain.</a> Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).</li>
<li>Pellot, J. E., Jesus, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboccipital+puncture.+%5BUpdated+2022+Jul+25%5D%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+%5BInternet%5D%22%5BJournal%5D)">Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25].</a> StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).</li>
<li>Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+lysosomal+storage+in+brains+of+MPS+vii+mice+treated+by+intrathecal+administration+of+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector.</a> Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).</li>
<li>De La Calle, J. L., Paino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+direct+lumbar+puncture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">A procedure for direct lumbar puncture in rats.</a> Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).</li>
<li>O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lot-to-lot+variation+in+adeno-associated+virus+serotype+9+%28AAV9%29+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations.</a> Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).</li>
<li>Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%3A+A+potential+blood-brain+barrier+buster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV9: A potential blood-brain barrier buster.</a> Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).</li>
<li>Hudry, E., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV+gene+transfer+to+the+nervous+system%3A+A+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality.</a> Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).</li>
<li>Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins%2C+helper+dependence%2C+and+seroepidemiology+of+a+new+human+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus.</a> Virology. 134 (1), 64-71 (1984).</li>
<li>Schulz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+neutralizing+anti-aav+antibodies%3A+Detection+and+implications+for+rAAV-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy.</a> Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).</li>
<li>Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+gene+delivery+and+evasion+of+anti-aav-neutralizing+antibodies+by+intrathecal+aav+administration+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates.</a> Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+sma%3A+A+dose-response+study+in+mice+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Hinderer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intrathecal+routes+of+administration+for+adeno-associated+viral+vectors+in+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals.</a> Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).</li>
<li>Wang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+leakage+and+headache+after+lumbar+puncture%3A+A+prospective+non-invasive+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study.</a> Brain. 138, 1492-1498 (2015).</li>
<li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-induced+dorsal+root+ganglion+pathology%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology).</a> Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).</li>
<li>Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+development+in+rodents+and+humans%3A+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+adeno-associated+virus+serotypes+and+delivery+methods+for+cardiac+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).</li>
</ol>

O Dr. Donsante é um inventor de uma patente pendente sobre a administração de vetores AAV9 no LCR.

Uma grande variedade de doenças afeta o SNC. Fornecer uma cópia funcional do gene relevante por meio de um vetor viral é uma estratégia de tratamento atraente para aqueles que são recessivos e monogênicos por natureza, como atrofia muscular espinhal. No entanto, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui a maioria dos vetores de terapia gênica administrados por via intravenosa11. Aqueles que podem cruzar a BHE, como AAV9, devem ser administrados em altas doses para superar a perda vetorial devido à transdução periférica12. A idade também é uma barreira. A exposição ambiental aos vários sorotipos de AAV aumenta com os13 anos de idade e muitas vezes leva à produção de anticorpos que podem neutralizar vetores terapêuticos14. Portanto, a administração intravenosa de vetores de terapia gênica para distúrbios do SNC é geralmente limitada a bebês e não é usada em pacientes diagnosticados mais tarde na vida. 
Para pacientes mais velhos, a injeção direta de vetor no LCR pode produzir ampla transdução no SNC, ignorando tanto a BHE quanto os anticorpos anti-AAV preexistentes15. Uma vez que esta abordagem é direcionada, doses de vetor mais baixas também podem ser usadas. Existem duas abordagens principais no ambiente clínico: (1) punção lombar e (2) injeção nos ventrículos laterais. Este último apresenta mais risco, mas geralmente fornece maior transdução cerebral. A punção lombar é mais segura, mas a transdução é inclinada em direção à medula espinhal. A transdução cerebral pode ser aumentada com a colocação do paciente na posição de Trendelenburg, mas os dados sobre isso são mistos16,17. O uso de cateter para chegar à cisterna magna por punção lombar pode ser uma opção melhor na clínica, mas está em estágio inicial de uso5. Pode haver outros desafios para traduzir as abordagens elaboradas em modelos animais para a clínica, como perda vetorial devido ao vazamento de LCR18 e toxicidade nos gânglios da raiz dorsal19.
A maioria dos estudos de terapias dirigidas ao SNC realizados em roedores usa neonatos ou animais adultos (>60 dias de idade). Os neonatos têm o benefício de um tamanho corporal pequeno, permitindo doses eficazes mais altas, e um sistema imunológico imaturo, evitando as complicações de uma resposta imune contra a terapêutica. No entanto, em termos de desenvolvimento do cérebro, um camundongo ou rato recém-nascido representa melhor um estágio fetal em humanos. Para terapias destinadas a crianças na faixa etária de 5 a 10 anos, o rato juvenil (25 a 35 dias de idade) é um modelo melhor em termos de desenvolvimento neurológico20. Uma vez que não tinha sido previamente descrito um método de injecção intratecal em ratos juvenis e os métodos estabelecidos para ratinhos e ratos adultos se revelaram ineficazes em ratos com esta idade, foi desenvolvida a abordagem acima descrita. Para ser claro, os ratos juvenis não são apenas menores que os adultos, mas também podem diferir na elasticidade da dura-máter que protege a medula espinhal, tornando ineficaz um procedimento que funciona para perfurar essa camada em um rato adulto em um jovem.
Ao aprender a realizar a injeção intratecal em ratos juvenis, é necessário usar um corante (como o azul de tripano) como substituto da terapêutica, e o usuário deve estar altamente confiante em sua capacidade de realizar o procedimento com sucesso e reprodutibilidade antes de iniciar um estudo com uma terapêutica. Tornar-se proficiente na técnica exigirá prática para obter experiência com a sensação da seringa quando a trajetória está no alvo versus fora do alvo. Existem dois erros comuns. Se o ângulo de aproximação for muito raso, a agulha atingirá o topo de uma das lâminas ou a parte de trás da lâmina rostral. Não haverá contração e a distância que a agulha avança será de alguns milímetros a menos de 8 mm. Se o ângulo de abordagem for muito grande, existe o risco de a agulha passar entre as duas lâminas e penetrar na cavidade abdominal. Quando isso acontece, a agulha avança muito mais do que 8 mm. Se isso acontecer, remova a agulha, reposicione e tente novamente. Nas poucas ocasiões em que isso aconteceu, a entrada transitória na cavidade abdominal alguns milímetros antes da retirada e do reposicionamento não causou nenhum dano aparente e duradouro aos animais. 
Verificou-se que observar uma resposta física à colocação da agulha é fundamental para alcançar a reprodutibilidade com alta taxa de sucesso com esse procedimento. Quando não houve resposta, a taxa de sucesso da injeção foi baixa. No entanto, em alguns casos, um animal exigiu tentativas em vários locais para obter uma resposta, e vestígios de corante foram observados em uma ou mais das pegadas de agulha anteriores. Nenhum corante foi observado no espaço epidural, sugerindo que algumas das picadas de agulha anteriores haviam penetrado na dura-máter sem produzir contração da cauda ou da perna. Como o refluxo foi mínimo (semelhante ao observado no trajeto da agulha da injeção), acredita-se que o efeito de picadas de agulha anteriores na eficácia do parto nesses casos foi insignificante. 
Uma vez que se atinge a proficiência na técnica de entrega, um segundo desafio não cirúrgico pode ser encontrado. Especificamente, em ratos adultos (~ 70 dias de idade), a potência dos vetores AAV9 para entrega intratecal na medula espinhal e no cérebro pode variar substancialmente de lote para lote, mesmo quando são gerados pelo mesmo núcleo vetorial. Alguns lotes terão o desempenho esperado, produzindo transdução na substância cinzenta da medula espinhal ao longo de seu comprimento. Outros, porém, não conseguem penetrar na substância cinzenta, transduzindo principalmente os gânglios da raiz dorsal10. A causa dessa variabilidade não é clara, pois os vetores são potentes in vitro e quando injetados diretamente na medula espinhal. Recomenda-se a realização de um estudo-piloto de 3-4 animais com qualquer novo lote de vírus para confirmar que o novo lote tem o desempenho esperado antes de iniciar um grande estudo. A potência pode ser avaliada usando coloração imuno-histoquímica ou imunofluorescência do produto transgênico da proteína ou quantificando a quantidade de mRNA transgênico ou genomas vetoriais usando PCR quantitativo ou ddPCR21. Além das variáveis desconhecidas que distinguem os lotes virais, pequenas diferenças na idade do animal, volume de injeção, velocidade de entrega e concentração do vetor podem causar variabilidade nos resultados. Antes de iniciar um grande estudo, eles podem precisar ser otimizados para cada vírus ou outro agente terapêutico candidato.
Uma vez treinado, um cirurgião experiente pode concluir o procedimento de injeção intratecal de um rato juvenil em cerca de 30 minutos, desde a indução da anestesia até o início do período de recuperação. Isso permite que grandes coortes sejam tratadas em um curto espaço de tempo. A recuperação da cirurgia também é rápida. A maioria dos animais deambula normalmente dentro de 20-30 min. Depois de realizar mais de 200 dessas cirurgias, nenhum efeito adverso desse procedimento foi encontrado. 
Finalmente, minimizar o sofrimento animal e garantir o bem-estar animal durante os procedimentos cirúrgicos são considerações primordiais. Assim, é necessário o uso adequado de anestésicos e analgésicos, e a temperatura corporal deve ser mantida durante o procedimento e até que o animal se recupere totalmente da anestesia. Os órgãos reguladores relevantes e o pessoal veterinário de diferentes instituições podem ter requisitos e recomendações diferentes em relação a esses tópicos. O uso de anestésicos e analgésicos descritos neste procedimento foi desenvolvido em consulta com os veterinários da Universidade Emory e a equipe da IACUC. Os pesquisadores devem trabalhar em estreita colaboração com seus veterinários locais e a IACUC para atingir as metas necessárias.
Existem certas limitações para este procedimento. O método descrito aqui foi desenvolvido para uso em ratos juvenis, e uma miríade de diferenças estruturais e outras diferenças entre humanos e ratos podem limitar a tradução desses procedimentos para humanos. O objetivo de permitir a injeção intratecal lombar de uma terapêutica em ratos juvenis é facilitar o uso do modelo de rato juvenil para testar a eficácia do tratamento terapêutico candidato - mesmo que o modo preciso de entrega precise ser alterado para aplicação em pacientes.

A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outra função benéfica.
Para doenças que afetam o sistema nervoso central (SNC), a entrega do vetor de terapia gênica diretamente ao tecido-alvo é frequentemente desejável. As abordagens não sistêmicas oferecem dois benefícios: minimizam os efeitos colaterais fora do alvo que podem ser causados pela transdução periférica e reduzem muito a quantidade de vetor necessária para atingir níveis adequados de transdução no tecido-alvo5.
Há uma variedade de abordagens para fornecer vetores de terapia gênica ao SNC. A injeção intraparenquimatosa, a injeção de um vetor diretamente na medula espinhal ou no tecido cerebral, pode ser usada para entrega em uma região definida. No entanto, para muitas doenças, a transdução ampla do SNC é desejada. Isso pode ser feito entregando um vetor ao líquido cefalorraquidiano (LCR)5, o fluido que flui dentro e ao redor do cérebro e da medula espinhal. Existem três maneiras principais de fornecer vetores ao LCR. A abordagem mais invasiva é a entrega intracerebroventricular, que envolve a perfuração de um orifício no crânio e o avanço de uma agulha através do cérebro até os ventrículos laterais. Isso produz transdução por todo o cérebro. No entanto, o procedimento pode causar hemorragia intracraniana, e a abordagem geralmente produz apenas transdução limitada da medula espinhal6. A injeção na cisterna magna na base do crânio é menos invasiva, mas traz o risco de danos ao tronco cerebral. Embora frequentemente usada em pesquisas com animais5, a injeção na cisterna magna não é mais usada rotineiramente na clínica7. A punção lombar é a abordagem menos invasiva para acessar o LCR. Isso envolve colocar uma agulha entre duas vértebras lombares e na cisterna lombar.
A punção lombar para entrega do vetor é realizada rotineiramente em ratos e camundongos adultos e em camundongos neonatais 8,9. Os autores deste estudo realizaram recentemente punções lombares em ratos juvenis (28-30 dias de idade) para fornecer vetores do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9). Em ratos adultos, uma agulha de punção lombar neonatal foi colocada verticalmente entre as vértebras L3 e L49. O posicionamento adequado resulta em um movimento da cauda e no LCR fluindo para o reservatório da agulha. Em ratos juvenis, porém, nenhuma dessas leituras pôde ser alcançada. Os autores então tentaram adaptar um procedimento de camundongo adulto usando uma seringa de insulina 27 G inserida em um ângulo entre L5 e L610. Em camundongos adultos, que normalmente são menores que os ratos P28, isso não produz um movimento da cauda, mas a colocação incorreta da agulha é evidente pelo refluxo do injetado. Em ratos juvenis, no entanto, essa abordagem levou uniformemente ao injetado ser administrado por via epidural, provavelmente resultante de diferentes elasticidades entre camundongos adultos e ratos juvenis das camadas de tecido ao redor da medula espinhal. As abordagens por cateter foram avaliadas em seguida. Especificamente, um cateter foi introduzido através de uma incisão na dura-máter da cisterna lombar e até a medula espinhal torácica média; no entanto, essa abordagem levou a um refluxo substancial do injetado de volta para fora do local da incisão durante o parto. As tentativas de colocar o cateter no espaço intratecal por via percutânea com agulha-guia também não tiveram sucesso. Devido à estreiteza da largura interlaminar, o cateter provavelmente atingiria a lâmina rostral e não avançaria.
Aqui, é descrito um método para obter uma entrega de solução bem-sucedida e reprodutível por meio de uma punção lombar no rato juvenil. Essa abordagem pode ser usada para vetores virais e, provavelmente, também para células, produtos farmacêuticos e outras terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>200 &micro; L pontas de pipeta filtradas</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-FL</td><td>Vírus de pipetagem</td></tr><tr><td>AAV9-GFP</td><td>Vector Builder</td><td>P200624-1005ynr</td><td>AAV9 vetor expressando</td></tr><tr><td>sutura absorvível GFP com agulha revestida Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Círculo de corte reverso Tamanho da agulha 4 - 0 Trançado</td><td>McKesson</td><td>J422H</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>Bench pad</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Almofadas Isotérmicas Braintree Scientific, 8'' x 8''Fisher</td> <td>Scientific</td><td>50-195-4664</td><td>Mantém a temperatura corporal</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>McKesson</td><td>1013922</td><td>Analgésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina-ER (1 mg/mL)</td><td>Zoopharma</td><td></td><td>Analgésico de liberação prolongada</td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-365-409</td><td>Remoção</td></tr> <tr><td>de sangueDrapeado, Mouse, Plástico Transparente, 12" x 12", com Fenestração Adesiva</td><td>Steris</td><td>1212CPSTF</td><td>Campo cirúrgico</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps Cobertor</td> Elétrico de <td>Ferramentas Fine Science</td><td>Tools 11251-20</td><td>Almofada</td></tr><tr><td>de</td><td>Aquecimento Extra Longa CVS Health</td><td></td><td></td> CVS Health Series 500</tr><tr><td>Eppendorf Research plus, pipeta de 1 canal, variável, 20; 200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>Pipetting virus</td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14059-11</td><td>Tesoura cirúrgica curva</td></tr><tr>Ferramentas de <td>Ciência Fina</td><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>16121-14</td><td>Laminectomia</td></tr><tr><td>Porta-agulhas Halsey</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>12001-13 Chave de</td><td>agulha</td></tr><tr><td>Seringas de insulina com agulha ultrafina 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td><td></td><td>Seringa</td><td>BD 328431</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>McKesson</td><td>803250</td><td>Toalhetes anestésicos</td></tr><tr><td>de isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td>Desinfecção da pele</td></tr><tr><td>Lidocaína, 1%</td> <td>McKesson</td><td>239935</td><td>Anestesia local</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga: 1,5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-137</td><td>Carregando a seringa</td></tr><tr><td>Iodopovidona</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-118-0481 Cabo de</td><td>bisturi para desinfecção da pele</td></tr><tr><td>- #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td>Suporte de lâmina de bisturi</td></tr><tr><td>Sure-Seal Induction</td> Chamber Caixa de <td>anestesia</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-17</td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica Miltex Carbon Steel No. 11 Estéril Descartável Embalada Individualmente</td><td>McKesson</td><td>4-111</td><td>#11 Lâmina de bisturi</td></tr><tr><td>SYSTANE Pomada para os olhos NIGHTTIME</td><td>Alcon</td><td></td><td>Pomada para os olhos</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td>Injeção</td></tr></tbody></table>

entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

A terapia gênica é uma tecnologia poderosa para fornecer novos genes a um paciente para o tratamento da doença, seja para introduzir um gene funcional, inativar um gene tóxico ou fornecer um gene cujo produto pode modular a biologia da doença. O método de entrega do vetor terapêutico pode assumir várias formas, desde a infusão intravenosa para administração sistêmica até a injeção direta no tecido-alvo. Para distúrbios neurodegenerativos, muitas vezes é desejável inclinar a transdução para o cérebro e/ou medula espinhal. A abordagem menos invasiva para atingir todo o sistema nervoso central envolve a injeção no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que a terapêutica atinja uma grande fração do sistema nervoso central. A abordagem mais segura para administrar um vetor no LCR é a injeção intratecal lombar, onde uma agulha é introduzida na cisterna lombar da medula espinhal. Essa técnica, também conhecida como punção lombar, tem sido amplamente utilizada em roedores neonatais e adultos e em modelos animais de grande porte. Embora a técnica seja semelhante entre espécies e estágios de desenvolvimento, diferenças sutis no tamanho, estrutura e elasticidade dos tecidos ao redor do espaço intratecal requerem acomodações na abordagem. Este artigo descreve um método para realizar punção lombar em ratos juvenis para fornecer um vetor adeno-associado do sorotipo 9. Aqui, 25-35 μL de vetor foram injetados na cisterna lombar, e um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para avaliar o perfil de transdução resultante de cada injeção. Os benefícios e desafios dessa abordagem são discutidos.

Para determinar a precisão da técnica de injeção, um corante, azul de tripano, foi usado como substituto para a terapêutica. Esse corante se liga prontamente às proteínas, por isso geralmente permanece dentro da estrutura na qual foi injetado. Isso significa que o corante pode não prever com precisão a distribuição pós-injeção da terapêutica; é simplesmente usado para revelar a precisão da injeção. Quando introduzido com sucesso na cisterna lombar, o azul de tripano se liga à dura-máter, manchando o perímetro da medula espinhal de azul. No entanto, quando a agulha não consegue penetrar na dura-máter, o corante acaba no espaço epidural. Tanto a dura-máter quanto os tecidos circundantes (a superfície do osso e os ligamentos e músculos que conectam as lâminas) serão corados de azul. Esses padrões são facilmente visíveis a olho nu.
A diferença entre a injeção administrada corretamente e incorretamente é difícil de avaliar se alguém simplesmente fizer um corte transversal através da medula espinhal e da coluna vertebral. Em vez disso, recomenda-se a realização de uma laminectomia usando um par de rongeurs começando na lâmina L5 e movendo-se rostralmente. Deve-se tomar cuidado para não danificar a dura-máter no processo. O uso do microscópio de dissecação facilita esse processo. A Figura 1 fornece exemplos comparativos de injeções bem-sucedidas e injeções apenas parcialmente bem-sucedidas. Com uma injeção bem-sucedida, pouco ou nenhum refluxo ao longo do trajeto da agulha é observado quando a agulha é retirada. Após uma injeção bem-sucedida, a remoção da lâmina para expor a medula espinhal revela azul de tripano dentro da medula espinhal, mas não na superfície do osso (Figura 1A). O corante também é visível no tronco cerebral e no cerebelo após uma injeção bem-sucedida (Figura 1B). Em contraste, uma injeção parcialmente bem-sucedida é evidenciada por um refluxo significativo de corante de volta ao trato da agulha durante o processo de injeção e / ou evidência visível de corante no osso (Figura 1C).
Usando o procedimento acima, 28 μL de um vetor AAV9 expressando proteína fluorescente verde aprimorada (GFP) foram injetados a uma concentração de 3 x 1013 genomas de vetor / mL, para uma dose total de 8,4 x 1011 genomas de vetor / animal. Quatro semanas depois, os animais foram eutanasiados e perfundidos com paraformaldeído a 4%10. O cérebro e a medula espinhal foram então colhidos e preparados para seccionamento congelado. Cortes de 40 μm de espessura foram obtidos e corados para GFP. A Figura 2 fornece exemplos do padrão de transdução obtido com este vetor. A transdução foi geralmente maior na medula espinhal, particularmente na região lombar (Figura 2A-C), provavelmente devido à sua proximidade com o local da injeção. A transdução do cérebro foi alcançada (Figura 2D-F), mas, como esperado, tendeu a ser mais limitada do que a observada na medula espinhal.
Para ilustrar a reprodutibilidade dos resultados alcançados por um único cirurgião experiente usando um único lote de vírus, cortes corados do cerebelo e córtex de cada um dos 15 ratos injetados para este estudo são apresentados na Figura 3 e na Figura 4, respectivamente. Os cortes corados da medula espinhal cervical também são apresentados em 7 desses 15 ratos (Figura 5). É claro que a quantidade de transdução cerebral pode mostrar uma variabilidade ainda maior com diferentes doses, lotes de vetores e cirurgiões10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig01.jpg"> Figura 1: Exposição da medula espinhal após uma injeção do corante. As laminectomias foram realizadas após a injeção de azul de tripano. (A) A medula espinhal é manchada de azul em uma injeção administrada corretamente, e nenhum corante é visto no osso removido durante a laminectomia (setas). (B) O corante também pode ser observado ao redor do tronco cerebral. (C) Em uma injeção em que houve refluxo significativo durante a injeção, há menos corante dentro do cordão e o corante está presente na superfície do osso (setas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig02.jpg"> Figura 2: Exemplos de padrões de transdução alcançados após a administração intratecal de AAV9-GFP. Seções de 40 μm de espessura da medula espinhal cervical, (B) torácica e (C) lombar foram coradas imuno-histoquimicamente para GFP (mancha preta). Altos níveis de transdução de substância cinzenta foram observados em todos os níveis. (D) Em contraste, o cérebro exibe transdução geral mais esparsa. As caixas esquerda e direita são ampliadas em (E) e (F), respectivamente. (E) A maior parte da coloração é observada no cerebelo, principalmente nos neurônios de Purkinje (setas). (F) Neurônios (setas) e astrócitos (pontas de flechas) são transduzidos dentro do córtex cerebral. Barras de escala: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; e (E,F) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig03v2.jpg"> Figura 3: Reprodutibilidade da transdução no cerebelo. Reprodutibilidade da transdução no cerebelo de 15 ratos injetados pelo mesmo cirurgião usando a mesma dose e lote do vírus. Barra de escala: 1 mm. Os números nas imagens indicam os números de identificação do rato ('ninhada'). indivíduo'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig04.jpg"> Figura 4: Reprodutibilidade da transdução no córtex. Reprodutibilidade da transdução no córtex de 15 ratos injetados pelo mesmo cirurgião usando a mesma dose e lote de vírus. Barra de escala: 500 μm. Os números nas imagens indicam os números de identificação do rato ('ninhada'). indivíduo'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig05.jpg"> Figura 5: Reprodutibilidade da transdução na medula espinhal cervical. Reprodutibilidade da transdução na medula espinhal cervical de 7 ratos injetados pelo mesmo cirurgião usando a mesma dose e lote de vírus. Barra de escala: 500 μm. Os números nas imagens indicam os números de identificação do rato ('ninhada'). indivíduo'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de terapias gênicas para doenças que afetam o sistema nervoso central. Em dezembro de 2023, o FDA aprovou terapias genéticas baseadas em AAV para um punhado de lojas genéticas, incluindo atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, distrofia muscular de Duchenne e hemofilia A e B. Muitos outros tratamentos estão sendo investigados em ensaios pré-clínicos e clínicos. A elaboração de intervenções seguras e eficazes para doenças genéticas requer o aproveitamento de uma variedade de abordagens, desde estudos cuidadosos de história natural em pacientes até trabalhos pré-clínicos em cultura de tecidos e modelos animais, e a terapia genética é realmente apenas uma das várias tecnologias usadas para esse fim.Muitos experimentos de terapia gênica usam animais neonatais ou adultos. Poucos avaliam tratamentos em juvenis, embora isso represente uma população significativa de pacientes para doenças genéticas. Portanto, para crianças mais velhas, o tamanho do corpo e o sistema imunológico representam barreiras significativas para a administração intravenosa de terapias genéticas.A administração intratecal pode superar isso, mas precisamos de modelos apropriados para testar essa hipótese. Este procedimento que desenvolvemos nos permitirá avaliar a eficácia dessa abordagem em ratos juvenis.

intrathecal-vector-delivery-juvenile-rats-via-lumbar-cistern

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Smit, R. D., et al. Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor viral duplo usando cirurgia combinada de cérebro e coluna. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a entrega direcionada de vetores virais aos neurônios corticoespinhais em um rato neonatal. O protocolo permite a expressão gênica precisa usando injeções virais anterógradas e retrógradas, facilitando a pesquisa sobre regeneração neural e plasticidade após lesão medular.

Entrega viral direcionada a neurônios corticoespinhais em um rato neonatal para estudar lesão medular

Fonte: Chen, Y., et al. Entrega intratecal de oligonucleotídeos antisense no sistema nervoso central de ratos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a entrega de um composto de teste no líquido cefalorraquidiano (LCR) por meio de um cateter implantado na coluna vertebral lombar de um modelo de rato. O composto circula ao longo do LCR até o cérebro e a medula espinhal, entra nos neurônios e oferece potencial terapêutico.

Entrega intratecal de um composto de teste ao sistema nervoso central de ratos

Fonte: Keefe, K. M., et al. A injeção direta de um vetor lentiviral destaca várias vias motoras na medula espinhal do rato. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a injeção de um vetor viral de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) na medula espinhal de ratos para rastrear as vias neuronais. O vírus possui glicoproteínas para entrada sináptica e um gene codificador de proteína fluorescente. A agulha é inserida na medula espinhal e a suspensão do vírus é administrada a uma taxa...

Uma injeção de vetor viral na medula espinhal de rato para rastreamento neuronal retrógrado

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Este relatório descreve uma técnica simples e rápida de punção intratecal para a transfecção localizada de siRNA na medula espinhal lombar em rato sob anestesia luz de curta duração.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

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Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Aqui, apresentamos um método modificado para cateterismo intratecal em ratos que representa uma abordagem simples, conveniente e confiável para a administração repetitiva de medicamentos intratecais.

Um método modificado para cateterismo intratecal em ratos

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

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