Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

Em nosso laboratório, desenvolvemos novas tecnologias de medição para biologia em nanoescala. Particularmente, nos concentramos no desenvolvimento de microscopia de força atômica de alta velocidade para estudar processos biológicos dinâmicos em escala nanométrica. E para isso, desenvolvemos recentemente um novo modo de imagem, que chamamos de Photothermal Off Resonance Tapping, ou PORT.

Neste modo, estamos usando um laser de acionamento dedicado para acionar os cantilevers muito controlados em alta velocidade, o que nos permite obter os dados e até duas ordens de magnitude mais rápido do que com o rosqueamento convencional fora da ressonância. O padrão de ouro no AFM de alta velocidade é a imagem latente ressonante da modalidade. Neste modo, o cantilever é acionado nesta frequência de ressonância, o que significa que a posição do cantilever não pode ser controlada, apenas sua amplitude de oscilação.

Para AFM de velocidade normal, os modos de ressonância são cada vez mais comuns. No entanto, a frequência de atuação é limitada aqui, o que torna esses modos de imagem bastante lentos. Ao usar um laser secundário para acionar o cantilever, podemos obter frequências de atuação mais altas, o que significa velocidades de imagem mais altas.

Essa abordagem nos permite manter as vantagens associadas a outros modos de equipe fora da ressonância, o que significa que podemos otimizar o equilíbrio entre a sensibilidade e a velocidade da imagem. Estamos limitados na velocidade de imagem pelo retrato mais alto. Se quisermos aumentar o retrato, precisamos aumentar a potência do laser para manter a mesma amplitude de atuação.

Isso pode levar a um controle de força deficiente e danos à amostra. Aumentar a largura de banda dos cantilevers, reduzindo seu tamanho e melhorando a eficiência de absorção do laser, nos permitirá atingir taxas de porta mais altas, garantindo a liberação adequada da amostra. Esse avanço facilitará taxas de imagem mais rápidas, o que é crucial para examinar as complexidades da dinâmica de montagem.

Para começar, limpe e prepare os balanços. Monte os cantilevers em um suporte compatível com o sistema de microscopia eletrônica de varredura ou SEM. Em seguida, aqueça o gás precursor a ser usado no sistema de injeção de gás para fazer crescer a nova ponta.

Quando o vácuo atingir abaixo de 10 elevado a menos cinco milibares, purgue a linha de injeção de gás 10 vezes por dois segundos cada para remover qualquer ar residual da linha do bico. Use o SEM para localizar a extremidade do cantilever. Incline o suporte em um ângulo para alinhar o cantilever corretamente para imagens de microscopia de força atômica.

Ajuste a posição e o foco do SEM para uma visão clara da ponta do cantilever onde a ponta nano de carbono será cultivada. Em seguida, defina os parâmetros de deposição no software para aumentar a nova ponta. Inicie o processo de deposição para aumentar a ponta com uma radiação do feixe de elétrons na ponta do cantilever enquanto injeta o gás precursor e pare a injeção de gás assim que a deposição estiver concluída.

Realize imagens SEM pós-crescimento para avaliar a qualidade e as características da ponta recém-crescida, incluindo seu raio e comprimento. Remova o suporte da câmara SEM. Para começar, prepare um microscópio de força atômica de alta velocidade.

Use uma pinça para colocar um cantilever ultracurto sob o clipe de mola no suporte do cantilever. Usando uma seringa, adicione 50 microlitros de líquido pela porta esquerda de acesso ao fluido. Em seguida, use três botões na cabeça do AFM para alinhar o laser de leitura no cantilever.

Observe a sombra do cantilever em um papel branco enquanto maximiza a soma. Em seguida, centralize o ponto do laser no fotodiodo usando os dois botões dedicados. Em seguida, marque a caixa de excitação habilitada na excitação VI para ligar e alinhar o laser de acionamento, acionando e oscilando o cantilever.

Exibir os sinais de excitação e deflexão do cantilever em um osciloscópio. Use o método de sombra e maximize a amplitude de oscilação com os botões de ajuste do laser de acionamento. Para ajustar a amplitude de oscilação do cantilever na porta, adicione uma tensão CC ao circuito de controle de diodo laser na caixa de configuração em excitação VI e insira a entrada CA pico a pico para o circuito de controle de diodo laser.

Para obter curvas de interação, defina o VI do controlador Z para o modo de contato e clique em Iniciar para se aproximar da superfície da amostra. Uma vez atingida a superfície, execute uma curva de força versus distância na rampa VI para calibração da sensibilidade de deflexão do cantilever. Clique em retirar para retrair o Z piezo da superfície onde a ponta não pode alcançar.

Após a retração completa, mude para o modo de porta no controlador Z VI e ligue o laser de excitação na excitação VI. Curvas de interação claras foram obtidas subtraindo a oscilação livre da oscilação de contato, crucial para imagens não destrutivas de amostras biológicas. A uma taxa de porta de 100 kilohertz, uma boa qualidade de imagem foi alcançada.

No entanto, à medida que a frequência de excitação se aproximava da ressonância cantilever, o controle de feedback se deteriorava, levando a curvas de interação obscurecidas e qualidade de imagem degradada. Para começar, prepare uma solução 10 milimolar de acetato de magnésio. Usando uma seringa Hamilton, injete 50 microlitros da solução no canal fluídico do suporte cantilever, criando uma gota de líquido que engloba o cantilever.

Defina o tamanho da varredura no VI de varredura para 800 por 800 nanômetros e a taxa de linha para 100 hertz. Para digitalizar a superfície, clique na seta do quadro para verificar a qualidade. Após a digitalização, clique em retirar no VI do controlador Z para retrair o cantilever da superfície.

Usando uma seringa Hamilton, remova a solução tampão do suporte cantilever. Em seguida, prepare uma solução de DNA diluído em estrela de três pontos e injete 50 microlitros dessa solução no suporte cantilever. Realize imagens com uma área de 800 por 800 nanômetros a uma taxa de linha padrão de 100 hertz.

Após a varredura inicial, ajuste o tamanho e a velocidade da imagem e digitalize o VI para os valores especificados para aquisição de dados adicional Mantenha a entrada para o ponto de ajuste na caixa de ponto de ajuste do VI do controlador Z no nível mais baixo necessário para um rastreamento preciso durante todo o processo de imagem. Repita isso para todas as áreas de amostra necessárias. Usando este protocolo, a montagem em tempo real de motivos de estrelas de três pontos de DNA em ilhas estáveis foi observada por AFM de porta de alta velocidade.

Imagens nítidas foram obtidas em taxas de linha de 100 e 200 hertz para uma taxa de porta de 100 kilohertz. No entanto, velocidades de imagem mais altas sem aumentar as taxas de porta reduziram a qualidade da imagem devido a mudanças rápidas na topografia. Os resultados de imagem da estrela de três pontos de DNA para a entrada CA pico a pico mais baixa mostraram estruturas intactas, enquanto a entrada CA pico a pico mais alta resultou em danos observáveis à amostra devido a forças mais altas.

Da mesma forma, a entrada de deslocamento CC mais baixa revelou estruturas intactas, enquanto a entrada de deslocamento CC mais alta causou danos estruturais.