Name: Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a usar a microscopia de força atômica de alta velocidade com o modo PORT para estudar a auto-montagem de motivos de DNA em três pontas. Este protocolo permite observar interações biomoleculares com resolução nanométrica e velocidade superior.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imagem aprimorada de motivos de estrelas de DNA por microscopia de força atômica de alta velocidade PORT

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
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<li>Fukuda, S., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+high-speed+atomic+force+microscopy+for+imaging+of+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes.</a> Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).</li>
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<li>Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+force+mode%3A+a+new+method+for+the+investigation+of+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties.</a> Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW">https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW</a> (2023).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.appnano.com/product-page/biolever">https://www.appnano.com/product-page/biolever</a> (2023).</li>
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<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>Olympus</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>Descontinuado&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>Unidade de eletroforese</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>termociclador para recozimento</td></tr><tr><td>Configuração personalizada de AFM</td><td>Laboratório para Instrumentação Bio-Nano, Instituto de Bioengenharia Interfaculdade, Escola de Engenharia, Ecole Polytechnique F&eacute; d & eacute; rale Lausanne</td><td></td><td>Obtido através do Laboratório para Instrumentação Bio-Nano</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW Reagents</td><td>A5097</td><td>Em buffer de recozimento</td></tr><tr><td>Medidor de Potência a Laser</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digital Handheld Optical&nbsp; Console do medidor de energia e energia</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação 3AP animada, MP-310</td><td>Major Science</td><td>MP-310 Fonte de</td><td>alimentação de eletroforese</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>Em buffer de recozimento</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>327330010</td><td>Tampão de corrida para eletroforese</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>Em buffer de recozimento</td></tr></tbody></table>

imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da três-ponto-estrela do adn usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

Nesta investigação, o processo dinâmico do conjunto de motivos da ponto-estrela do ADN 3 em ilhas estáveis foi observado com sucesso utilizando as capacidades do AFM do HS-PORTO. Essa técnica nos permitiu capturar a montagem dessas estruturas em tempo real. Na Figura 2A, B, obtemos uma varredura de imagem nítida em taxas de linha de 100 Hz e 200 Hz, respectivamente, para taxa de PORT de 100 kHz (tamanho de varredura de 800 nm por 800 nm). Isso corresponde a 3,9 e 1,95 ciclos de oscilação por pixel, respectivamente. No entanto, a geração de imagens em velocidades mais altas sem aumentos simultâneos na taxa de PORT que permitiriam um mínimo de um ciclo de oscilação por pixel reduzirá drasticamente a qualidade da imagem, como pode ser visto na Figura 2C (0,78 de um ciclo de oscilação por pixel). A velocidade de imagem é limitada pela taxa na qual o cantilever sonda a superfície com controle de força de amostra de ponta apropriado, uma vez que a taxa de mudança de topografia se torna muito rápida para rastrear na taxa de amostragem de superfície.
Além de definir uma taxa de PORT alta o suficiente, é importante que as curvas PORT contenham as informações necessárias para controlar as forças. Especialmente o arrasto hidrodinâmico e a baixa largura de banda de detecção podem obscurecer a força aplicada. A Figura 3 exibe a deflexão do cantilever em diferentes distâncias da superfície da amostra e as taxas de frequência de excitação usando uma média de 4096 curvas para reduzir o ruído. As curvas azuis na Figura 3A (para taxa de PORT de 100 kHz) e na Figura 3D (para taxa de PORT de 500 Hz) representam o movimento do cantilever quando o cantilever está longe da superfície e oscila livremente (sem tocar a superfície durante um ciclo de oscilação). As curvas vermelhas mostram a deflexão do cantilever quando o cantilever oscila próximo à superfície e entra em contato intermitente com a superfície, sondando a amostra. Para obter a curva de interação verdadeira e, portanto, a interação ponta-amostra, subtraímos a curva azul da curva vermelha para obter a Figura 3B,E, respectivamente. Um exemplo de uma curva de interação clara necessária para imagens não destrutivas de amostras biológicas é representado na Figura 3B. Essa configuração leva à boa qualidade de imagem mostrada na Figura 3C, onde a taxa de PORT é de 100 kHz. À medida que aumentamos a frequência de excitação perto da ressonância do cantilever, em algum momento, o controle de feedback se deteriora, mesmo quando o cantilever exibe oscilação de amplitude suficiente para se desprender da superfície após aumentar a potência do laser de excitação ( Figura 3E ). Se a frequência PORT estiver muito próxima da frequência de ressonância do cantilever, a ressonância do cantilever limita a resposta de tempo da dinâmica do cantilever. A flexão em balanço, portanto, não representa mais com precisão a interação ponta-amostra, e a curva de interação que obtemos é obscurecida. Isso leva a uma degradação da qualidade da imagem, conforme exibido na Figura 3F.
Uma curva de interação comprometida em frequências PORT mais altas também pode acontecer devido à eficiência de atuação reduzida em frequências mais altas33, que atualmente é um dos fatores limitantes dos cantiléver AFM comerciais de alta velocidade. Essa diminuição eventualmente atinge um nível limite no roll-off, no qual a imagem adequada é prejudicada: a amplitude de oscilação pode ser insuficiente para se desprender da superfície e a ponta está sempre em contato, danificando as estruturas da amostra. Para neutralizar a diminuição na amplitude causada em taxas de PORT mais altas, exploramos um aumento na potência do laser. Usamos um cabeçote PORT que pode atingir potências de laser mais altas para observar melhor esse efeito. A potência do laser de excitação, que medimos com um medidor de potência, foi dividida em componentes CC e CA. A potência total é controlada ajustando no software a tensão pico a pico (entrada CA pico a pico) e a tensão CC (entrada de deslocamento CC) enviada ao circuito de controle do diodo laser. A Figura 4A exibe a amplitude de oscilação do balanço pico a pico resultante de um aumento da entrada CA pico a pico. Como esperado, a amplitude de oscilação se correlaciona bem com o valor de entrada CA. É importante observar que essas amplitudes pico a pico são maiores do que as normalmente usadas em imagens PORT. Ao obter imagens de amostras frágeis, a amplitude CA é da ordem de 10-30 nm. A Figura 4B exibe a amplitude de oscilação do cantilever pico a pico para entradas de deslocamento CC aumentadas. A amplitude de oscilação pico a pico permanece bastante constante na faixa de tensão de deslocamento CC. Atribuímos as pequenas variações a não linearidades na detecção. A Figura 4C mostra o aumento dos componentes de potência do laser CA e CC resultante do aumento da CA pico a pico. A Figura 4D mostra o aumento dos componentes de potência do laser CA e CC resultante do aumento do deslocamento de entrada CC.
Os efeitos do aumento da entrada CA pico a pico e da entrada de deslocamento CC foram testados separadamente para determinar os respectivos efeitos na potência total e na amplitude de oscilação. Um aumento na potência do laser faz com que a amostra seja interrompida, provavelmente por meio do aumento da temperatura, enquanto um aumento na amplitude de oscilação aumentará a força de impacto na amostra5. Aumentar exclusivamente a entrada CA pico a pico terá menos impacto no aumento total da potência do laser, conforme mostrado na Figura 4C, e aumentará predominantemente a amplitude de oscilação do cantilever (e consequentemente a força de impacto), conforme mostrado na Figura 4A. Aumentar a entrada de deslocamento CC terá um efeito maior no aumento da potência de saída do laser, conforme mostrado na Figura 4D, que aquece a amostra, mas terá um efeito insignificante na amplitude de deflexão, como visto na Figura 4B. Os resultados de imagem estão representados na Figura 4E,F. A Figura 4E mostra o DNA 3PS para a entrada CA pico a pico mais baixa (imagem à esquerda, circulada em azul) e a entrada CA pico a pico mais alta (imagem à direita, circulada em vermelho), o que resulta em danos à amostra presumivelmente por meio das forças mais altas. A Figura 4F exibe DNA 3PS para a entrada de deslocamento CC mais baixa (imagem da esquerda, circulada em azul) e entrada de deslocamento CC mais alta (imagem da direita, circulada em vermelho), onde as estruturas são danificadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg"> 
Figura 1: A configuração do HS-AFM. (A) A cabeça PORT no scanner e na base do AFM, mostrando o (i) botão para ajustar o foco do laser de leitura no cantilever, (ii) botão para ajustar a posição do laser de leitura no cantilever, (iii) botão para ajustar a posição horizontal do laser no fotodiodo, (iv) botão para ajustar a posição vertical do laser no fotodiodo, e (v) botões para ajustar a posição do laser de acionamento fototérmico no cantilever. (B) Um close-up do cantilever na vista da seção transversal da cabeça com o estágio de amostra, onde (vi) é o clipe de mola segurando o cantilever. O canal para injeção de líquido está marcado em vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg"> 
Figura 2: Amostra de DNA 3PS fotografada com AC10 a uma taxa PORT de 100 kHz em diferentes taxas de linha. (A) 100 Hz (3,9 ciclos de oscilação por pixel), (B) 200 Hz (1,95 ciclos de oscilação por pixel) e (C) 500 Hz (0,78 ciclos de oscilação por pixel). As imagens foram tiradas em pontos de ajuste de 350 pN ou menos. Barra de escala 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Deflexão do cantilever, curva de interação e qualidade de imagem nas taxas PORT de 100 KHz e 500 kHz. (A) Deflexão do cantilever (oscilação livre do cantilever próxima, mas sem tocar a superfície em azul, e a oscilação do cantilever quando o cantilever está intermitentemente em contato com a superfície em vermelho), (B) curva de interação e (C) respectiva qualidade de imagem para taxa de PORT de 100 kHz. (D) Deflexão do cantilever (oscilação livre do cantilever próxima, mas sem tocar a superfície em azul, e a oscilação do cantilever quando o cantilever está intermitentemente em contato com a superfície em vermelho), (E) curva de interação e (F) respectiva qualidade de imagem para taxa PORT de 500 kHz. As imagens foram tiradas a uma taxa de linha de 100 Hz. Barra de escala 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg"> 
Figura 4: Efeito da tensão de entrada CA pico a picotensão de entrada de deslocamento DC. Efeito do aumento da tensão de entrada CA pico a pico (A) e (B) tensão de entrada deslocada CC na oscilação pico a pico do cantilever. Efeito do aumento (C) da tensão de entrada CA pico a pico e (D) da tensão de entrada de deslocamento CC na potência do laser CA e CC. Qualidade de imagem mínima (circulada em azul) e máxima (circulada em vermelho) (E) tensão de entrada CA pico a pico e (F) tensão de entrada de deslocamento CC. Ao aumentar a tensão de entrada CA pico a pico, a tensão de entrada de deslocamento CC foi mantida em 600 mV. Ao aumentar a tensão de entrada de deslocamento CC, a tensão de entrada CA pico a pico foi mantida em 200 mV. A integridade da amostra é comprometida para a configuração de alta potência. A taxa de PORT foi mantida em 100 kHz e a taxa de linha em 100 Hz. Barra de escala de 200 nm. Uma curva de força para obter a sensibilidade à deflexão foi feita após a imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Imagem de alta velocidade da microscopia atômica da microscopia da auto-montagem do motivo da Três-Ponto-estrela do ADN usando a torneira fototérmica da fora-ressonância

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

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Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

Imagem de molécula única para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em cortinas de DNA

Neste vídeo, demonstramos a microscopia de força atômica estática para visualizar nucleossomos montados. Esta técnica de imagem de alta resolução permite o estudo da estrutura do nucleossomo.

Microscopia de Força Atômica Estática para Visualizar e Caracterizar Nucleossomos Montados

Neste vídeo, demonstramos técnicas de microscopia de força atômica de lapso de tempo de alta velocidade, AFM, para estudar a dinâmica dos complexos de nucleossomos. À medida que a ponta do AFM varre a superfície do nucleossomo, ela detecta alterações na altura do nucleossomo e registra o desdobramento do DNA ao longo do tempo.

Microscopia de Força Atômica de Lapso de Tempo de Alta Velocidade para Capturar a Dinâmica do Nucleossomo

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Este protocolo demonstra a realização de um ensaio de molécula única para visualização ao vivo do desenrolamento do DNA por CMG helicase. Ele descreve (1) a preparação de um substrato de DNA, (2) a purificação de Drosophila melanogaster CMG helicase marcada com fluorescência, (3) a preparação de uma célula de fluxo microfluídico para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) e (4) o ensaio de desenrolamento de DNA de molécula única.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Aprenda a usar a microscopia de força atômica de alta velocidade com o modo PORT para estudar a auto-montagem de motivos de DNA em três pontas. Este protocolo permite observar interações biomoleculares com resolução nanométrica e velocidade superior.

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