Name: Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprenda a dissecar o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) com microscópio para análise histológica e de expressão gênica. Este protocolo melhora a eficiência da extração e a qualidade dos dados de RNA em estudos metabólicos.

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Este trabalho é apoiado pelo NIDDK do NIH sob o número de prêmio R01DK116899, USDA/ARS sob o número de prêmio 3092-51000-064-000D, e um prêmio piloto do Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Os fluxogramas foram produzidos utilizando o BioRender.

Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados em camundongos machos C57BL/6J com idade entre 3 semanas e 3 meses de idade. Antes da dissecção, todos os camundongos foram eutanasiados usando o procedimento aprovado de eutanásia de dióxido de carbono em roedores. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Dissecção de scBAT
<ol><li>Coloque a carcaça do rato na bancada e limpe a tesoura cirúrgica e a pinça de ponta superfina com etanol 70%.</li>
	<li>Borrife o pescoço ventral do rato com etanol a 70% para molhar o pelo e minimizar a contaminação do pelo.</li>
	<li>Fazer uma incisão bilateral, de aproximadamente 1,5 cm, ao longo das clavículas.</li>
	<li>A partir das extremidades da incisão anterior, corte longitudinalmente em direção às orelhas, com aproximadamente 1 cm de comprimento. Isso formará uma incisão quadrada em forma de U ao redor do pescoço (Figura 1A,B). NOTA: scBAT encontra-se na camada intermediária do pescoço. A camada superficial, composta pela pele, tecido adiposo subcutâneo e glândulas salivares, fica exposta durante essa etapa. A camada intermediária, juntamente com a scBAT, contém as veias jugulares e os músculos do pescoço. A camada profunda do pescoço, contendo MTD cervical profunda e veias arteriais e jugulares, é exposta pela remoção do músculo esquelético.</li>
	<li>Coloque o camundongo sob um microscópio dissecante e coloque o pescoço exposto em foco (Figura 1C). NOTA: Este passo adicional aumenta muito a precisão da coleta de tecidos, necessária dado o pequeno tamanho do scBAT.</li>
	<li>Exponha totalmente as glândulas salivares, levantando as secções da pele incisada com pinças.</li>
	<li>Usando tesoura cirúrgica e pinças, desconecte o tecido que conecta as glândulas salivares ao tecido ao redor das clavículas e umas às outras.</li>
	<li>Exponha os depósitos de scBAT levantando as glândulas salivares. Procure a MTD ao longo da veia jugular externa e possivelmente conectada à face inferior das glândulas salivares. Identifique-o pela sua cor alaranjada, que se destaca contra o tecido circundante.</li>
	<li>Segure o tecido adiposo alvo com pinça e descasque-o suavemente para longe das glândulas salivares.</li>
	<li>Uma vez descolado das glândulas salivares, continue a desconectar o scBAT da veia jugular externa e da musculatura do pescoço até que os depósitos de ambos os lados do pescoço possam ser removidos inteiros.</li>
	<li>Inspecionar cada amostra dissecada de scBAT sob o microscópio dissecante (Figura 1D,E), usando pinça para remover qualquer tecido conjuntivo restante.</li>
	<li>Coloque cada amostra num frasco para injetáveis de cintilação de vidro contendo 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e retire o rato do microscópio.</li>
</ol>2. Processamento e coloração de hematoxilina e eosina (H&E) da scBAT (ilustrada na Figura 2A)
<ol><li>Substitua o PBS (passo 1.12) por 10 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% frio e coloque o frasco para injetáveis num nutador, balançando a 4 °C durante a noite para fixar o scBAT. NOTA: A fixação de perfusão pode ser aplicada em camundongos pós-natais, especialmente adultos, quando for necessário processamento adicional para análise imuno-histoquímica.</li>
	<li>No dia seguinte, remova a solução de PFA do frasco para injetáveis com uma pipeta de transferência estéril e substitua-a por 10-15 ml de PBS. Coloque o frasco para injetáveis num nutador e rocha durante 30 minutos à temperatura ambiente. Substitua o PBS por solução salina a 0,85% e continue balançando por mais 30 min à temperatura ambiente. NOTA: A solução salina é solução salina a 0,85% (NaCl) p/v em água tratada com DEPC (livre de RNase). O PBS pode ser substituído pela solução salina nesta e na etapa seguinte.</li>
	<li>Retire o soro fisiológico a 0,85% com uma pipeta de transferência e adicione 10 mL de solução salina a 70% de etanol/solução fisiológica a 0,85% ao frasco para injetáveis. Guarde o frasco para injetáveis num frigorífico a 4 °C durante a noite ou até estar pronto para a incorporação em parafina. NOTA: PBS pode ser usado se 0,85% de soro fisiológico não estiver disponível. scBAT deve ser processado o mais rápido possível para facilitar a secção e melhor morfologia do tecido.</li>
	<li>Antes da incorporação da parafina, desidrate o scBAT através de uma série de trocas de etanol para remover a água do tecido.<ol><li>Para começar, remova o etanol 70% / soro fisiológico 0,85% do frasco para injetáveis com uma pipeta de transferência e adicione 10-15 mL de álcool desidratante a 95%, balançando o frasco para injetáveis em um nutador à temperatura ambiente por 1 h. Repita esta etapa uma vez. NOTA: O etanol pode ser usado no lugar de soluções de álcool desidratante.</li>
		<li>Em seguida, substitua o Álcool Desidratante 95% por 10-15 mL de Álcool Desidratante 100% e continue balançando em um nutador por 1 h. Reabasteça com novo álcool 100% desidratante e continue a balançar por várias horas ou durante a noite, dependendo da quantidade de scBAT no frasco.</li>
	</ol></li>
	<li>Para limpar scBAT para incorporação, adicione 10 mL de tolueno ao frasco para injetáveis e continue balançando em um nutador até que scBAT esteja transparente, aproximadamente 6-8 h. NOTA: A duração do tempo necessário para alcançar uma compensação satisfatória depende do tamanho do scBAT. Recomenda-se começar a limpar imediatamente pela manhã para que a infiltração e incorporação possam ocorrer à tarde.</li>
	<li>Para incorporar scBAT em cera de parafina, remova o tolueno e adicione 10 mL de cera de parafina de infiltração derretida ao frasco para injetáveis. Colocar o frasco para injetáveis num forno a 65 °C durante 1 h. Repita este passo com cera nova. NOTA: Comece a derreter os pellets de cera em um forno durante a noite antes de começar a incorporar para garantir que a cera esteja totalmente líquida.</li>
	<li>Substitua a cera de parafina de infiltração por cera de parafina de incorporação e coloque o frasco para injetáveis à mesma temperatura durante 1 h. Repita esta etapa uma vez. NOTA: O estágio de infiltração pode ser interrompido e continuado mais tarde. Retire o frasco para injetáveis do forno e guarde-o à temperatura ambiente até estar pronto para continuar.</li>
	<li>Incorpore o tecido colocando-o primeiro em um molde de incorporação de tecido, adicione cera de incorporação derretida ao molde e reoriente o tecido sob um estereomicroscópio. Em seguida, coloque um de incorporação em cima da cera e continue a despejar cera de incorporação por cima dela até que esteja cheia e a tampa de incorporação seja presa ao bloco de cera. Transfira o bloco para uma geladeira a 4 °C durante a noite para deixar a cera enrijecer e encolher antes de remover o molde metálico.</li>
	<li>Seccionar o scBAT com um micrótomo a uma espessura de 5-6 μm18, três a quatro cortes por lâmina de microscópio, e colocar em um banho de flutuação de seção de parafina quente a ~42 °C para permitir que as seções de tecido lisem.</li>
	<li>Transfira as seções para as corrediças e coloque-as na vertical contra o banho de flutuação para permitir que a água escorra das lâminas.</li>
	<li>Transfira as corrediças para um rack de coloração inoxidável e coloque o rack em uma bancada de secagem de corrediças para secar durante a noite. NOTA: As lâminas de parafina podem ser armazenadas a longo prazo à temperatura ambiente antes de um processamento adicional ser alcançado.</li>
	<li>Realizar a coloração H&E19. Para começar, coloque as lâminas em um rack de coloração e, em seguida, coloque o rack em um frasco de coloração com xileno por 40 s. Repita esta etapa uma vez. NOTA: Se a parafina ainda estiver visível após os dois estágios, aguarde até que ela tenha se dissolvido completamente antes de continuar.</li>
	<li>Para reidratar o tecido, coloque a cremalheira deslizante em um frasco de coloração preenchido com Álcool Desidratante 100% por duas etapas de 20 s, seguidas por uma etapa de 15 s em Álcool Desidratante 95% e uma lavagem final de 15 s em ddH2O.</li>
	<li>Coloque as lâminas em uma placa de coloração preenchida com solução de hematoxilina por 75 s para obter a coloração nuclear e, em seguida, enxágue as lâminas em uma placa de coloração com ddH2O por 45 s. NOTA: O tempo pode ser ajustado dependendo da cor da mancha desejada.</li>
	<li>Diferenciar a coloração mergulhando as lâminas em uma placa de coloração preenchida com solução de etanol de HCl por 15 s e, em seguida, transferir as lâminas para outro enxágue ddH2O por 15 s. NOTA: A solução de HCl-etanol é preparada de acordo com um método publicado19.</li>
	<li>Para coloração citoplasmática, colocar a lâmina em uma solução de contracoloração Eosina Y por 15 s.</li>
	<li>Desidratar o tecido mergulhando as lâminas por 15 s cada em três estágios sequenciais de solução de álcool desidratante a 95%, depois dois banhos sequenciais de álcool desidratante 100% - o primeiro por 15 s e o segundo por 45 s - para terminar a desidratação.</li>
	<li>Finalmente, transferir as lâminas para um banho de xileno por 45 s para reaclimatar o tecido a solventes orgânicos. Após essa etapa, a coloração é concluída; Remova o tecido da solução.</li>
	<li>Aplique o meio de montagem em cada lâmina e cubra-o dentro de um exaustor de fumaça química. Seque durante a noite antes de fazer a imagem. Os resultados das imagens são mostrados na Figura 2B.</li>
</ol>3. Análise da expressão gênica de scBAT
<ol><li>Coleta de Tissue (moagem)<ol><li>Depois de dissecar scBAT, coloque imediatamente o tecido em um tubo de microcentrífuga, faça um furo na parte superior do tubo com uma agulha estéril e congele rapidamente em nitrogênio líquido. NOTA: As principais etapas do protocolo descritas aqui são ilustradas na Figura 3A. Fazer um furo na parte superior do tubo antes de deixá-lo cair em nitrogênio líquido impede que o tubo estoure devido à mudança repentina de pressão.</li>
		<li>Encha um copo plástico com nitrogênio líquido e deixe um pilão e espátula fina de molho. NOTA: É importante manter a temperatura de todas as ferramentas e amostras de tecido o mais fria possível, próxima à temperatura do nitrogênio líquido, durante todo o procedimento para evitar que o tecido descongele. O tecido adiposo descongelado é muito aderente e torna o pó mais desafiador. Remova apenas ferramentas e amostras de banhos de nitrogênio líquido imediatamente antes do uso.</li>
		<li>Pegue uma amostra de tecido congelado de cada vez e despeje-a de seu tubo de microcentrífuga na argamassa.</li>
		<li>Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido à argamassa e, em seguida, use o pilão para triturar o tecido congelado até que ele esteja completamente pulverizado. OBS: Se o tecido começar a ficar macio ou pegajoso em algum momento, ele está descongelando; despeje mais nitrogênio líquido na argamassa.</li>
		<li>Use a espátula fina para raspar cuidadosamente e transferir o tecido pulverizado de volta para o tubo de microcentrífuga. Despeje nitrogênio líquido na argamassa enquanto raspa para coletar restos de tecido antes de transferir com uma espátula. Repita as etapas de transferência até que todo o tecido seja retirado da argamassa.</li>
		<li>Limpe a argamassa com um limpador de papel leve e etanol 70% antes de despejar a próxima amostra para moer. Conservar o tecido em pó num congelador a -80 °C a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de RNA total<ol><li>Preparação<ol><li>Limpe a bancada, pipetas, suportes de ponta e suportes de tubo com etanol 70% e descontaminante de superfície para remover a RNase.</li>
			<li>Acione a máquina centrífuga para atingir 4 °C.</li>
			<li>Aquecer a solução de eluição a 70 °C.</li>
			<li>Diluir a DNase I misturando 5 μL de DNase I reconstituída com 75 μL de solução de diluição de DNase por amostra. Colocar a solução de DNase I no gelo até à sua utilização.</li>
		</ol></li>
		<li>Procedimento<ol><li>Para cada amostra, rotule dois tubos de microcentrífuga, dois tubos de retenção de coluna (dois tubos de microcentrífuga graduada sem tampa) e uma mini coluna de ligação.</li>
			<li>Adicionar 500 μL de solução de isolamento de RNA a cada amostra e sonicar usando um motor de pilão pellet por 30 s.</li>
			<li>Obtenha uma seringa para cada amostra e pipete para cima e para baixo 10x para lisar ainda mais o tecido. Certifique-se de que nenhum sólido seja visível após a seringa.</li>
			<li>Adicionar 250 μL de clorofórmio e vórtice ocasionalmente enquanto aguarda 5 minutos para que as amostras incubem à temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugar a 21.000 × g por 20 min a 4 °C.</li>
			<li>Transfira a porção aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga e adicione uma quantidade equivalente de etanol 70% (~500 μL). NOTA: A porção aquosa superior deve ser clara, a inferior deve ser a solução de isolamento de RNA vermelho, e entre as duas camadas devem estar alguns sólidos indesejados.</li>
			<li>Transferir 500 μL do novo lisado para a coluna de ligação. Centrifugar a 18.000 × g por 60 s e, em seguida, descartar o filtrado.</li>
			<li>Repita a etapa anterior com o lisado restante para obter todo o RNA na coluna de ligação.</li>
			<li>Adicionar 700 μL de lavagem de baixa estringência à coluna de ligação, centrifugar por 30 s e descartar o filtrado.</li>
			<li>Adicionar 80 μL de DNase I diluída a cada coluna de ligação. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
			<li>Adicionar 700 μL de lavagem de alta rigor, centrifugar por 30 s e descartar o filtrado.</li>
			<li>Adicione 700 μL de lavagem de baixo rigor, centrifugar por 60 s e descartar o filtrado.</li>
			<li>Mova as colunas de ligação para a2ª nova coluna sem tampa que prende o tubo e centrífuga por 2 minutos para garantir que todos os líquidos sejam removidos da coluna de ligação.</li>
			<li>Mover as colunas de ligação para um novo tubo de microcentrífuga e adicionar 30 μL de solução de eluição aquecida. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min.</li>
			<li>Centrifugar por 2 min para coletar o RNA eluído no fundo do tubo de microcentrífuga.</li>
			<li>Medir a concentração total de RNA usando um espectrofotômetro. NOTA: Se a pureza total do ARN for baixa, indicada por um valor de 260/280 inferior a 2,0 ou 260/230 inferior a 1,8, após o passo 3.2.2.12., as amostras podem ser novamente lavadas com lavagem de baixo rigor, seguidas de serem lavadas com etanol a 80% antes de continuarem com o passo 3.2.2.13.</li>
			<li>Conservar o ARN num congelador a -80 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Transcrição reversa (RT)<ol><li>Em uma tira de tubo de PCR, adicionar 0,5-1 μg de RNA total diluído em água tratada com DEPC a um total de 8 μL para cada amostra de RNA em um poço diferente. NOTA: A quantidade de RNA usada para transcrição reversa pode ser aumentada ou reduzida de acordo com as instruções do fabricante.</li>
			<li>Adicionar 1 μL de Oligo dT e 1 μL de dNTPs a cada amostra no tubo de PCR. Certifique-se de que o volume total é de 10 μL por amostra.</li>
			<li>Coloque a tira do tubo de PCR em um termociclador e coloque-a em 65 °C por 5 min seguido de 4 °C indefinidamente.</li>
			<li>Após 5 min a 65 °C, retire a tira do tubo de PCR e coloque o tubo no gelo por pelo menos 2 min. Após incubação no gelo, adicionar cinco reagentes: 4 μL de tampão de primeira fita 5x, 2 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de TDT 0,1 M, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa para cada amostra. Certifique-se de que o volume total seja agora de 20 μL por amostra.</li>
			<li>Coloque a tira do tubo de PCR de volta no termociclador e ajuste o programa para 50 °C por 50 min, depois 85 °C por 5 min, depois 4 °C indefinidamente.</li>
			<li>Quando o programa atingir 4 °C, retire a tira e adicione 1 μL de Ribonuclease H (RNase H). NOTA: RNase H é usado para remover qualquer molde de RNA restante na reação RT; nesta etapa, o RNA desejado já deve ser convertido em cDNA.</li>
			<li>Coloque a tira de volta no termociclador e funcione 37 °C por 20 min e, em seguida, 4 °C indefinidamente.</li>
			<li>A transcrição reversa está completa; medir a concentração de cDNA usando um espectrofotômetro.</li>
			<li>Diluir o cDNA para 250 ng/μL; armazenar o cDNA em um freezer de -80 °C ou -20 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>PCR quantitativo (qPCR)<ol><li>Faça uma planilha para organizar a posição de cada primer e amostra na placa qPCR de 96 poços. NOTA: Um dos primers precisa ser um gene de referência para normalizar a expressão de todos os outros genes de interesse, como o 36B4.</li>
			<li>Faça uma mistura mestre de primer para cada combinação "primer + amostra". Para cada reação de qPCR, adicione 3 μL de Água de Grau de Biologia Molecular, 5 μL de mistura mestre de enzima qPCR, 0,5 μL de primer para frente e 0,5 μL de primer reverso, o que soma 9 μL por reação. Adicione 1 μL de cDNA por reação para fazer um total de 10 μL por reação. NOTA: O padrão é ter três réplicas técnicas para cada combinação "primer + amostra", então cada mistura mestre deve ser 4x das quantidades acima.</li>
			<li>Adicionar 1 μL de cDNA para cada réplica a cada mistura mestra de primers. Se cada mistura mestre for 4x, pipete 4 μL de cada amostra de cDNA em seu próprio tubo marcado.</li>
			<li>Finalmente, pipetar 10 μL de cada mistura de reação na placa qPCR de 96 poços nas posições determinadas pela planilha.</li>
			<li>Sele a placa com um selo adesivo espesso e, em seguida, centrifugar a placa de 96 poços a 450 × g a 20 °C por 2 minutos. NOTA: É fundamental que a placa esteja totalmente selada para evitar que as amostras evaporem durante a termociclagem. Use limpadores de papel leves para pressionar a vedação na placa, especialmente nas bordas.</li>
			<li>Execute a placa em um instrumento de PCR em tempo real. Programe a reação de PCR de acordo com as instruções do fabricante: 2 min a 50 °C, seguido por mais 2 min a 95 °C e, finalmente, 40 ciclos de 15 s a 95 °C e 30 s a 60 °C. Os resultados da análise da expressão gênica da qPCR são mostrados na Figura 3B.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Caracterização morfológica e molecular do scBAT em camundongos

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<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
<li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Neste protocolo, apresentamos em detalhes os procedimentos de dissecação e processamento de scBAT para análises de H&E e expressão gênica. Como o scBAT reside na camada intermediária do pescoço e fica ao longo das grandes veias, o isolamento desse depósito requer técnica precisa. Especificamente, para obter uma visão clara do depósito, recomendamos colocar o camundongo sob um microscópio dissecante após a abertura do pescoço. Usando um par de pinças de ponto superfino para descascar a glândula salivar e as veias circundantes, deve-se tomar cuidado para evitar perfurar as veias. O sangramento excessivo pode dificultar a localização do scBAT. Para processar scBAT para coloração de H&E, adaptamos o uso de um protocolo publicado19 com pequenas modificações para incluir o uso de PFA 4%, álcoois desidratantes e um solvente orgânico, tolueno, para processamento de tecidos, como mostrado na seção protocolo. Todo o procedimento leva ~6 dias para ser concluído, e as lâminas coradas com H&E podem ser fotografadas no dia seguinte após a conclusão da coloração.
A RT-QPCR utilizando RNA como material de partida é o método mais utilizado para análise da expressão gênica no campo da biologia do tecido adiposo. Como o scBAT é um depósito de MTD relativamente pequeno em comparação com o iBAT, a obtenção de RNA suficiente para a expressão gênica pode ser difícil. Para aumentar o rendimento de RNA, recomendamos a aplicação de etapas sequenciais de preparação de lisado conforme descrito na seção de protocolo, começando por pulverizar o tecido usando um pilão e argamassa enquanto congelado. Usando este método de preparação de lisado, obtivemos com sucesso uma amostra de RNA de alto rendimento e alta qualidade para análise da expressão gênica de scBAT de um camundongo adulto. Este método de preparação de lisado também pode ser aplicado para obter lisados proteicos de alta qualidade a partir de scBAT para western blotting com o uso de tampão de lise proteica.
Usando o iBAT de camundongos, os pesquisadores adquiriram conhecimento substancial sobre a função BAT na termogênese e metabolismo. A recente identificação de alguns depósitos de BAT não reconhecidos anteriormente em camundongos e humanos, incluindo scBAT, revelou a necessidade de mais estudos antes que possamos entender completamente a contribuição fisiológica da BAT em camundongos e humanos adultos. Particularmente, estudos que iluminem as origens, funções e envolvimento desses depósitos de MTD recém-encontrados na termogênese e no metabolismo regional ou de corpo inteiro são necessários.

O aumento da prevalência da obesidade nos EUA e no mundo tem despertado grande interesse na compreensão de sua etiologia e na identificação de potenciais tratamentos 1,2. O tecido adiposo desempenha um papel vital no metabolismo, e a desregulação do tecido adiposo pode levar ao desenvolvimento da obesidade. Geralmente, existem dois tipos de tecido adiposo, tecido adiposo branco e marrom. Enquanto o tecido adiposo branco (TAB) pode armazenar energia química e secretar fatores endócrinos, o tecido adiposo marrom (BAT) pode utilizar energia química para gerar calor e manter a temperatura corporal no frio 3,4. Devido a essa habilidade única, a ativação da MTD também pode aumentar o gasto energético e melhorar a sensibilidade à insulina5.
A MTD exerce sua função através da termogênese sem tremores, um processo mediado pela proteína desacopladora 1 (UCP1)6. Mamíferos, incluindo camundongos e humanos, possuem quantidades variáveis de BAT. A visão clássica da MTD é que esses tecidos adiposos são mais abundantes em camundongos e lactentes do que em humanos adultos. O iBAT, localizado no flanco dorsal superior entre as escápulas, é o depósito de MTD mais estudado em camundongos. Através da aplicação de exames de imagem com radioisótopos e biópsias, estudos recentes identificaram vários depósitos de MTD em humanos adultos. Alguns deles, incluindo os depósitos encontrados no pescoço profundo e região supraclavicular, não haviam sido previamente identificados em camundongos ou outros animais modelo7,8,9,10,11. Entre esses depósitos BAT, o scBAT é o depósito mais frequentemente visto em humanos adultos. Para entender melhor a origem e a contribuição molecular desses depósitos BAT recém-encontrados em humanos, é essencial identificar depósitos equivalentes em camundongos que permitam manipulações genéticas e moleculares para rastrear e testar o papel funcional desses depósitos. Assim, nós e outros identificamos alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos em diferentes localizações anatômicas em camundongos, incluindo MTD scBAT12,13, BAT perivascular torácica 14,15, BAT perirrenal16 e BAT periaórtica17. O scBAT de camundongo se assemelha anatomicamente ao scBAT humano e morfologicamente se assemelha ao iBAT clássico, expressando altos níveis de UCP112.
Ao contrário do iBAT de camundongo, que pode ser facilmente dissecado, o scBAT está situado na camada intermediária do pescoço de camundongos, abaixo das glândulas salivares e ao longo da veia jugular externa. O isolamento deste depósito para análises histológicas e moleculares pode ser um desafio. Aqui, descrevemos em detalhes o procedimento para dissecar scBAT de camundongos pós-natais e adultos e processar este depósito para histologia e análise de expressão gênica.

<table><tbody><tr><td>Álcool desidratante 95% (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Álcool desidratante 100% (Flex 100)</td><td>Placa PCR de</td> 96 poços Epredia <td>8101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Binding Mini Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum High Stringency Wash</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Low Stringency Wash</td><td>Moldes de Base 7326804</td><td></td><td></td>Bio-Rad</tr><tr><td>(para incorporação)</td> Agulha PrecisionGlide <td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD 21g x 1 1/2"</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclador Tubos</td> de <td></td> Microcentrífuga Sem Tampa 1840148 <td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>2 mL Centrífuga</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 Instrumento de PCR em Tempo Real</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Meio de montagem de baixa viscosidade</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecação</td><td>Nikon</td><td></td><td></td>Solução</tr><tr><td>de diluição SMZ1500 DNase</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Solução de eluição</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 em meio de incorporação de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y (0,5% p/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Fórmula R Meio de infiltração parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill # 3 Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (para HCL-Etanol)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI de Incorporação</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Puro da Koptec - 200 Provas (para 70% de Etanol)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 mM)</td>Tubos de Microcentrífuga <td>Thermo Fisher</td><td>Scientific R0971</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL</td> Selos 'B' Microseal <td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>(selos adhseive)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Biologia Molecular Água</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Argamassa Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (para 0,85% de solução salina)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>Technologies</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td>Banho de Flutuação de Seção de Parafina <td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr> PCR <tr><td>Tube Strip</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Pilão por Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Motor de Pellets de Pilão</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salina (PBS)</td>Forno a vácuo <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Precision Model 19&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>Primer: 36B4&nbsp; (para a frente) 10 &mu; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo banco de dados</td></tr><tr><td>Primer: 36B4 (reverso) 10 &mu; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Fabp4 (forward) 10 &mu; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Fabp4 (reverso) 10 &mu; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo banco de dados</td></tr><tr><td>Primer: Glut 4 (primer direto) 10 &mu; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo banco de dados</td></tr><tr><td>Primer: Glut 4 (reverso) 10 &mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo banco de dados</td></tr><tr><td>Primer: PPARg (encaminhar) 10 &mu; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: PPARg (reserva) 10 &mu; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ppargc1a (reverso) 10 &mu; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ppargc1a(forward) 10 &mu; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo banco de dados</td></tr><tr><td>Primer: Ucp1 (encaminhamento) 10 &mu; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ucp1 (reverso) 10 &mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td> Solução de isolamento de RNA <td>de banco de dados Oligo do laboratório</td></tr><tr><td>Chen (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (descontaminante de superfície)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase (RNase Out)</td>Frasco de cintilação <td>de 10777019</td><td></td> <td>Invitrogen</td></tr><tr><td>(vidro)</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>Bancada de secagem de slides&nbsp;</td><td>Eletrotérmica (Cole-Parmer)</td> <td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Rack de coloração inoxidável</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo (para incorporação)</td> <td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de medição</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação reta de ponta superfina</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase Reversa (Inclui 5x Tampão de Primeira Fita e 0.1M DTT)&nbsp;</td><td>Seringa Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET com agulha 25 G x 5/8", 1 mL</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (mistura mestre de enzimas qPCR)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coloração manual de lâminas Tissue-Tek (frascos)</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>SKU: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

A termogênese mediada pelo tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel importante na regulação do metabolismo, e sua morfologia e função podem ser grandemente impactadas por estímulos ambientais em camundongos e humanos. Atualmente, a MTD interescapular murina (BATi), localizada entre duas escápulas no flanco dorsal superior de camundongos, é o principal depósito de MTD utilizado pelos laboratórios de pesquisa para estudar a função das MTD. Recentemente, alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos foram identificados em camundongos, incluindo um análogo ao tecido adiposo marrom supraclavicular humano. Ao contrário do iBAT, o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) está situado na camada intermediária do pescoço e, portanto, não pode ser acessado tão facilmente.
Para facilitar o estudo de scBAT de camundongos recém-identificados, é apresentado aqui um protocolo detalhando os passos para dissecar scBAT intacta de camundongos pós-natais e adultos. Devido ao pequeno tamanho do scBAT em relação a outros depósitos adiposos, os procedimentos foram modificados e otimizados especificamente para o processamento do scBAT. Entre essas modificações está o uso de um microscópio dissecante durante a coleta de tecidos para aumentar a precisão e homogeneização de amostras de scBAT congeladas para aumentar a eficiência da análise subsequente de qPCR. Com essas otimizações, a identificação, a aparência morfológica e a caracterização molecular da scBAT podem ser determinadas em camundongos.

Ao contrário do iBAT, que se situa na camada subcutânea do dorso entre duas escápulas, o scBAT situa-se na camada intermediária do pescoço, estendendo-se profundamente entre as camadas do músculo esquelético e a glândula salivar à medida que cresce ao longo da veia jugular externa (Figura 1A). Dissecar scBAT não é tão simples quanto o iBAT. Aqui, fornecemos um procedimento detalhado que inclui etapas cruciais para a dissecação da scBAT intacta de camundongos adultos e pós-natais (Figura 1B,C). Após a abertura do pescoço com o protocolo fornecido, uma fina camada de scBAT pode ser identificada sob um microscópio dissecante e descascada da glândula salivar conectada e da veia jugular externa com um par de pinças (Figura 1D,E). Para avaliar a morfologia do depósito, scBAT recém-isolado foi processado usando o procedimento de processamento fornecido combinado com um procedimento de coloração de H&amp;E previamente publicado19 (Figura 2A). Como mostrado na Figura 2B, a scBAT possui estruturas teciduais típicas de depósitos de MTD e é composta por muitos adipócitos pequenos e multiloculares em camundongos saudáveis pós-natais e adultos. Para avaliar os níveis de expressão gênica no scBAT, o RNA foi extraído de depósitos isolados de scBAT usando os procedimentos fornecidos (Figura 3A). Os níveis de expressão dos genes de interesse podem então ser avaliados por métodos padrão de RT-qPCR (Figura 3A). Como mostrado na Figura 3B, os níveis de expressão diferencial de genes envolvidos na mediação da função scBAT, incluindo Pparg, o regulador mestre do desenvolvimento de BAT; Fabp4 e Glut4, dois transportadores de nutrientes; e Ucp1 e Ppargc1a, dois genes envolvidos na termogênese, podem ser prontamente determinados. Para comparação, o RNA foi extraído de iBAT isolado, e a expressão dos genes listados acima também foi avaliada usando os procedimentos fornecidos (Figura 3A). Os níveis de expressão desses genes são relativamente semelhantes entre esses dois depósitos. (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg"> Figura 1: Localização anatômica da scBAT e processo de sua dissecção. (A) localização da scBAT na camada intermediária do pescoço. (B) A camada superficial do pescoço antes e depois da remoção da pele. Barra de escala = 250 μm. Linhas amarelas pontilhadas delineiam a área que deve ser exposta após a incisão em U. (C) Imagem de uma carcaça de camundongo colocada sob um microscópio dissecante para aumentar a clareza visual durante a dissecção. (D,E) Imagens representativas da camada intermediária do pescoço antes e depois da remoção do scBAT de camundongos com 3 semanas e 3 meses. Barra de escala = 250 μm. Linhas amarelas pontilhadas delineiam depósitos bilaterais expostos a scBAT; n = 2. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; SFI = camada superficial; SG = glândula salivar; tr = traqueia; JV = veia jugular externa; sm = músculo esquelético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg"> Figura 2: Processamento scBAT para coloração H&amp;E. (A) Fluxograma ilustrando as principais etapas do processamento scBAT para coloração H&amp;E. Após a dissecção do tecido, este é fixado sequencialmente, desidratado, incorporado, seccionado e corado. (B) Imagens representativas de scBAT corado por H&amp;E de camundongos com idade de 3 semanas e 3 meses; n = 3 para cada estágio de desenvolvimento; barra de escala = 250 μm para imagens com aumento menor; barra de escala = 50 μm para imagens de maior aumento. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; PFA = paraformaldeído; H&amp;E = hematoxilina e eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg"> Figura 3: Preparação do RNA do scBAT para análise da expressão gênica. (A) Fluxograma ilustrando as etapas de isolamento de RNA e análise RT-qPCR da expressão gênica scBAT. Devido ao seu pequeno tamanho e textura macia, congelar o depósito de scBAT e moê-lo em nitrogênio líquido é crucial para o isolamento bem-sucedido do RNA. (B) Expressão relativa de genes marcadores, incluindo Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 e Ppargc1a, em scBAT e iBAT isolados de camundongos machos com 3 meses de idade, n = 5. Os dados são apresentados como média ± MEV.36B4 foi usado como um gene housekeeping para normalização. Abreviações: scBAT = tecido adiposo marrom supraclavicular; RT-qPCR = transcrição reversa-PCR quantitativo; LN2 = nitrogênio líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

dissection-histological-processing-gene-expression-analysis-murine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos o procedimento cirúrgico para isolar o tecido adiposo branco subcutâneo e o tecido adiposo marrom interescapular de um camundongo recém-nascido.

Coleção de depósito adiposo branco e marrom do filhote de rato: um procedimento cirúrgico para colher o tecido adiposo branco e o tecido adiposo marrom do filhote de camundongo

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Os adipocytes existem em depósitos discretos e têm papéis diversos dentro de seus microambientes originais. Como as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos são descobertas, a identificação estandardizada e a isolação dos depósitos são cruciais para o avanço do campo. Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a excisão de vários depósitos adiposos do rato.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Aprenda a dissecar o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) com microscópio para análise histológica e de expressão gênica. Este protocolo melhora a eficiência da extração e a qualidade dos dados de RNA em estudos metabólicos.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

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