Name: Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Aprenda a preparar feridas por punção e amostras para microscopia eletrônica de área larga montada em modelos murinos. Este método permite analisar a formação estrutural de trombos e a função plaquetária em hemostasia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hemostasia de Ferida por Punção e Microscopia Eletrônica Montada

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,9% Solução salina normal</td><td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint conjunto de veias do couro cabeludo</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint agulhas hipodérmicas</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint agulhas hipodérmicas especiais</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool (70% Álcool Isopropílico)</td> Folha <td>de Alumínio MDS090670Z</td><td></td> <td>Medline</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Aquecimento Animal</td><td>Physitemp Instruments</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 Câmera de Microscopia Colorida R2</td><td>Carl Zeiss</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>Seringas BD Luer-Lok, 20 mL</td> Cloreto de Cálcio <td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células 35mm x 10mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td>Aplicadores com</td></tr><tr><td>ponta de algodão</td><td>430165 Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 Ativador</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenil Anidrido Succínico / DDSA</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Curativo, 5", curva, serrilhada, ponta estreita</td><td>Pinça de Curativo Integra Miltex</td><td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>, 5", padrão, serrilhado</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 Resina</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico, anidro 200 prova</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Rack de Tubo de 4 Vias Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador Digital Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Infusão de Seringa Única Fisherbrand</td> Esponjas <td>de Gaze 7801001</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>2" x 2"- 4 Ply</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído (Solução a 10%)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Anestesia Inalante Líquida, 100 mL</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Estilo Joalheiro Micro-Fino Fórceps, Estilo 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td><td>Precisa de 2 pares.</td></tr><tr><td>Tubo de Bomba L/S, Silicone, L/S 15; 25 Ft</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido Aspártico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Chumbo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita Verde 4</td><td>Cabeça</td><td></td> de Bomba <td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de Fio Masterflex L/S Variable Speed</td><td>Digital Drive VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio 4% Solução Aquosa</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica 19150</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (Solução de 16%)</td> <td>Controlador</td><td></td> de Temperatura Physitemp da Sciences 15710 <td></td></tr><tr><td></td><td>Physitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianeto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno, Ciências de</td><td>Microscopia Eletrônica</td> de Reagente ACS <td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Copos de Vidro Pyrex</td><td>Sonda de</td> Temperatura Retal <td>Fisher Scientific 02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>para Ratos</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Fita Invisível Scotch Magic, 3/4" x 1000"</td><td>3M Company</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Cacodilato de Sódio 0.2M, pH 7.4</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Vaporizador Eletrônico de Baixo Fluxo</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Kit Inicial para Ratos</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Pinos Minutien de Aço</td><td>Inoxidável Fine Science Ferramentas</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio steREO Discovery.V12</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastômero</td><td>de Silicone World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>tapete de silicone</td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Ácido Tânico</td> Ciências <td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida (TCH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopia Eletrônica</td> de Acetato de Uranila <td>Sciences 22400</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Micro Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Curativo para Olhos Von Graefe, 2.75", Curvada, Serrilhada</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818 Precisa de</td><td>2 pares.</td></tr><tr><td>Wagner Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura Aparador de Animais</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite Software</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

hemostasia de ferida por punção e preparação de amostras para análise de microscopia eletrônica de Área larga montada

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Quantificação dos efeitos da droga no tempo de sangramento da ferida perfurocortante Os tempos de sangramento da ferida por punção fornecem um modelo fisiológico de risco de droga que pode ser prontamente realizado em camundongos. Os resultados que vêm de um experimento de ferida de punção são preditivos. Aqui, mostramos uma curva de sangramento dose-resposta do dabigatrano. A dabigatrana, um inibidor da trombina, é usada como anticoagulante oral de ação direta, o chamado DOAC12. O modelo de ferida de punção da veia jugular foi usado para avaliar o risco inerente a diferentes doses de dabigatrana por meio de sangramento prolongado potencial por meio da formação tardia de trombos em camundongos. Uma dose variável de 15, 50 ou 150 μg/kg de dabigatrana foi administrada por via intravenosa (i.v.) 20 minutos antes da punção da veia jugular. Mostramos as médias do tempo de sangramento em várias concentrações de dabigatrana (Figura 4). Ao nível da dose, observa-se um prolongamento significativo do tempo de sangramento, p &lt;0,051. Isso indica um fator de risco significativo no uso da droga em humanos. Experimentalmente, a droga nessas doses tem um efeito significativo na ultraestrutura do trombo em formação.
Avaliação do estado de ativação plaquetária em um trombo de ferida por punção A abordagem WA-TEM fornece uma visão geral de uma área da ferida em um único plano quando vista em menor ampliação e muitos detalhes em maior ampliação (Figura 5). Os detalhes obtidos podem ser colocados diretamente no contexto da visão geral. Usamos essa abordagem para avaliar o recrutamento de plaquetas em forma de discoide para um trombo de ferida de punção. As plaquetas circulantes são discóides, daí o nome, e contêm um conjunto completo de grânulos secretores. Uma questão-chave tem sido como as plaquetas circulantes podem ser recrutadas para o trombo em crescimento sem perturbar as propriedades de fluxo livre das plaquetas restantes. Nosso trabalho aponta para uma hipótese Tether e Activate na qual as plaquetas circulantes são recrutadas para o trombo, uma a uma, por meio de um processo de amarração como plaquetas discóides contendo um conjunto completo de organelas2. A evidência para isso vem do WA-TEM de trombos da veia jugular 1 min após a punção. Após a secção para produzir fatias completas de trombo do meio da ferida ainda sangrando, fotografamos 500-800 quadros, 4.000 por 4.000 pixels, tamanho de pixel de 3,185 nm em uma grade raster XY retangular em toda a dimensão do trombo em seção transversal usando um estágio automatizado e um microscópio eletrônico de transmissão usando o software SerialEM10. Os quadros foram então costurados usando o software eTomo, parte do conjunto de programas IMOD11. Isso resulta em uma única imagem de tamanho variável, por exemplo, 120.000 pixels por 90.000 pixels que são tela cheia com zoom baixo, 0,02, ou em detalhes com zoom mais alto, 0,25 a 1,0 usando o software 3DMOD, novamente uma parte do conjunto de programas IMOD (Figura 5). Na rede, a análise orientada por software descobriu que as plaquetas discóides associadas ao trombo e ligadas perifericamente dentro do orifício de punção foram espaçadas como contas em uma corda. A uma curta distância dentro do trombo, a forma discóide era menos distinta e as plaquetas estavam mais fortemente associadas umas às outras. Mais profundamente dentro do trombo, as plaquetas eram arredondadas, bem compactadas e parcialmente degranuladas. Uma sequência de morfologia sugeriu a ligação inicial das plaquetas ao trombo por meio de uma molécula de longa ligação, provavelmente fator de von Willebrand, e que quaisquer outras etapas de ativação plaquetária estavam restritas ao interior do trombo em formação. Assim, o recrutamento de plaquetas para o trombo pode ocorrer sem perturbar a circulação do sangue dentro da veia jugular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> Figura 1: Configuração cirúrgica para realizar um experimento de trombo de ferida por punção da veia jugular/artéria femoral. O equipamento cirúrgico (A) e os instrumentos (B) são cuidadosamente organizados para eficiência do movimento, uma vez que o tempo é crítico durante o experimento. (C) Após a fixação da perfusão, a porção do vaso que contém o trombo da ferida puncionada é fixada a um tapete de silicone em uma placa de cultura de 35 mm durante a visualização ao microscópio óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> Figura 2: Indo de um vaso sanguíneo para amostras de plástico incorporadas que serão seccionadas para WA-TEM ou SBF-SEM. (A) Uma artéria femoral com uma ferida de punção e formação de trombo extravascular acumulada (círculo e seta) é mostrada. (B) Um trombo (círculo e seta) é embutido em plástico para seccionamento para WA-TEM com um micrótomo para imagens 2D subsequentes. (C) Um trombo (círculo e seta) é embutido em plástico, aparado para dar uma vara curta, menor que 1 mm, para fixação a um pino dentro de uma câmara de imagem SBF-SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> Figura 3: Ferida de punção para formação de trombo: Um esquema do fluxo preparativo de uma ferida de punção (A) para uma fatia de imagem de um trombo de veia jugular pós-punção de 1 minuto (B). A parede do vaso é rotulada em azul na fatia da imagem, os pequenos pontos pretos próximos à parede do vaso são glóbulos vermelhos e os agregados plaquetários do trombo aparecem como áreas cinza-escuras. Esta figura foi modificada de1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> Figura 4: Um exemplo de dados, em forma de gráfico, gerados em um experimento de ferida de punção da veia jugular. Uma curva de sangramento dose-resposta do dabigatrano é mostrada. Esta figura foi modificada de1. As médias de tempo de sangramento em várias concentrações de dabigatrana são mostradas junto com barras de erro indicando mais ou menos desvio padrão. A análise estatística usando o teste t de Student indicou um valor de p de &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> Figura 5: Imagens WA-TEM de uma fatia costurada para formar uma montagem. (A) Quadros individuais de alta resolução são coletados e depois costurados com o objetivo de colocar recursos em um contexto maior. (B) Ao aumentar o zoom, detalhes importantes podem ser destacados no contexto (poli: leucócitos polimorfonucleares, endo: endotélio e col: fibras de colágeno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Medicine

Medicina

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

Mostrado aqui é um método para visualizar a ultraestrutura da matriz extracelular em tecidos cardíacos descelularizados.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.

Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.

In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Aprenda a preparar feridas por punção e amostras para microscopia eletrônica de área larga montada em modelos murinos. Este método permite analisar a formação estrutural de trombos e a função plaquetária em hemostasia.

Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

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