Name: Modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a modelar microambientes vaginais saudáveis e disbióticos usando um chip microfluídico com epitélio vaginal diferenciado e co-cultura com microbioma. Este método avança a pesquisa em saúde reprodutiva feminina.

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Esta pesquisa foi patrocinada com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates (INV-035977) e do Instituto Wyss de Engenharia Biologicamente Inspirada da Universidade de Harvard. Também agradecemos a Gwenn E. Merry, do Wyss Institute, por editar este manuscrito. O diagrama na Figura 1 foi criado com o BioRender.

Chip microfluídico da vagina para estudar o microbioma vaginal

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<li>Van De Wijgert, J., Jespers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+impact+of+vaginal+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global health impact of vaginal dysbiosis.</a> Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).</li>
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<li>Torcia, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+among+vaginal+microbiome%2C+immune+response+and+sexually+transmitted+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections.</a> Int J Mol Sci. 20 (2), 266(2019).</li>
<li>Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+bacterial+vaginosis+in+infertility+patients%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis.</a> Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).</li>
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<li>Peelen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+vaginal+microbiota+on+preterm+birth%3A+A+systematic+review+and+recommendations+for+a+minimum+dataset+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research.</a> Placenta. 79, 30-39 (2019).</li>
<li>Smith, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+in+prevention+and+management+of+miscarriage+trials%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review.</a> BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).</li>
<li>Harp, D. F., Chowdhury, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichomoniasis%3A+Evaluation+to+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Trichomoniasis: Evaluation to execution.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).</li>
<li>Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+microbiological+correlates+of+vaginal+trichomoniasis+during+pregnancy.+The+vaginal+infections+and+prematurity+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group.</a> Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).</li>
<li>Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+microbiological+aspects+of+trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).</li>
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<li>Eade, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+bacterial+vaginosis-associated+pathogens+using+a+comprehensive+cervical-vaginal+epithelial+coculture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay.</a> PLoS One. 7 (11), e50106(2012).</li>
<li>Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+vaginal+microflora+colonization+model+providing+new+insight+into+microbicide+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action.</a> mBio. 2 (6), e00168(2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+systems+for+studying+intercellular+interactions+in+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis.</a> J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).</li>
<li>Johnson, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+susceptibility+of+three+species+of+primate+to+vaginal+colonization+with+gardnerella+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).</li>
<li>Yildirim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+vaginal+microbiomes+exhibit+species+specificity+without+universal+lactobacillus+dominance%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance.</a> ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).</li>
<li>Edwards, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+the+cervicovaginal+epithelia+to+study+host-microbiome+interactions+and+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections.</a> Pathog Dis. 80 (1), 026(2022).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+2D+and+3D+HSV-2+infection+model+using+human+normal+vaginal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells.</a> Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).</li>
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<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
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<li>Mahajan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+microbiome-host+interactions+modeled+in+a+human+vagina-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip.</a> Microbiome. 10 (1), 201(2022).</li>
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</ol>

Donald Ingber é fundador, membro do conselho, presidente do conselho consultivo científico e acionista da Emulate. Os outros autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Modelos in vitro anteriores da vagina humana não replicam fielmente as estruturas do tecido vaginal, o fluxo de fluido e as interações hospedeiro-patógeno19,22. Os modelos animais também são limitados pela variação interespécies no microbioma e diferenças no ciclo estral ou menstrual19,22. Este manuscrito descreve um protocolo para criar um modelo de Chip de Órgão da vagina humana que pode efetivamente imitar as respostas humanas a comunidades microbianas saudáveis e disbióticas.
Este protocolo envolve a semeadura de células epiteliais vaginais e de fibroblastos em lados opostos de uma membrana porosa compartilhada que separa microcanais paralelos em um dispositivo Organ Chip de dois canais que está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). A membrana porosa permite a migração de fatores de crescimento e outras formas de comunicação intercelular. No entanto, o revestimento de colágeno e a presença das monocamadas celulares impedem a mistura de meios entre os canais. Após a formação de uma monocamada de células epiteliais vaginais no canal apical, fatores de diferenciação são introduzidos no meio que flui no canal basal, que passa pelo espaço intersticial e, assim, promove a diferenciação das células epiteliais vaginais para formar um epitélio estratificado. A densidade das células epiteliais vaginais no momento da semeadura é um determinante crucial da saúde do chip da vagina no final da fase de diferenciação. Assim, a densidade das células epiteliais vaginais deve ser avaliada antes de iniciar a diferenciação, que não deve ser iniciada até que uma monocamada seja estabelecida. A exposição aos fatores de diferenciação pode ser continuada até que a densidade desejada das células epiteliais vaginais seja obtida e antes da inoculação bacteriana. Além disso, deve-se notar que a taxa de crescimento pode variar para células epiteliais vaginais primárias de diferentes doadores (ou fontes comerciais), o que pode afetar a qualidade do chip da vagina gerado. Em todos os estudos microfluídicos de chips de órgãos, é de extrema importância remover quaisquer bolhas que possam se formar nos canais ao longo da cultura de chips, pois elas interferem no fluxo do meio e acabarão resultando em redução da disponibilidade de nutrientes e perda de viabilidade celular. 
Este protocolo também descreve como usar o chip da vagina para estabelecer comunidades bacterianas no chip que imitam o estado vaginal saudável ou a vaginose bacteriana. O Chip da Vagina também pode ser usado para estudar outras doenças ou distúrbios vaginais; No entanto, deve-se ter cuidado para entender as características de cada doença e os melhores meios para correlacionar os resultados com os achados clínicos ao realizar esses estudos. Em resumo, o chip da vagina humana abre novos caminhos para estudar uma infinidade de doenças e condições relacionadas à TRF e pode ser uma ferramenta valiosa para investigar possíveis terapêuticas.

Um microbioma vaginal dominado por Lactobacillus spp. que ajuda a manter um microambiente ácido desempenha um papel importante na manutenção da saúde reprodutiva feminina1. No entanto, às vezes pode haver uma mudança na composição das comunidades microbianas que compõem o microbioma, o que resulta em um aumento na diversidade de bactérias vaginais. Essas alterações disbióticas, que muitas vezes resultam em uma mudança de um estado dominado por Lactobacillus para um dominado por espécies bacterianas anaeróbias mais diversas (por exemplo, Gardnerella vaginalis), estão associadas a várias doenças do sistema reprodutivo, como vaginose bacteriana, vaginite atrófica, infecção do trato urinário, candidíase vulvovaginal, uretrite e corioamnionite 2,3,4,5 . Essas doenças, por sua vez, aumentam as chances de a mulher adquirir doenças sexualmente transmissíveis e doenças inflamatórias pélvicas 6,7,8,9. Eles também representam um risco maior de parto prematuro e abortos espontâneos em mulheres grávidas 10,11,12 e também têm sido implicados na infertilidade 13,14,15,16.
Embora esforços tenham sido feitos para modelar a disbiose vaginal usando células epiteliais vaginais cultivadas em sistemas de cultura estáticos bidimensionais (2D)17,18, eles não imitam efetivamente a fisiologia e a complexidade do microambiente vaginal19. Modelos animais também têm sido usados para estudar a disbiose vaginal; no entanto, suas fases menstruais e interações hospedeiro-microbioma diferem muito das dos humanos e, portanto, a relevância fisiológica dos resultados desses estudos permanece obscura 19,20,21. Para neutralizar esses problemas, organoides e modelos de inserção Transwell de tecido vaginal humano também têm sido usados para estudar as interações patógeno-hospedeiro no FRT 19,22,23,24. Mas, como são culturas estáticas, elas só podem suportar a co-cultura de células humanas com micróbios vivos por um curto período de tempo (<16-24 h) e carecem de muitas outras características físicas potencialmente importantes do microambiente vaginal humano, como produção de muco e fluxo de fluido22.
Os chips de órgãos são sistemas de cultura microfluídica tridimensional (3D) que contêm um ou mais microcanais ocos paralelos revestidos por células vivas cultivadas sob fluxo dinâmico de fluido. Os chips de dois canais permitem a recriação de interfaces tecido-tecido em nível de órgão, cultivando diferentes tipos de células (por exemplo, epitélio e fibroblastos estromais ou epitélio e endotélio vascular) em lados opostos de uma membrana porosa que separa os dois canais paralelos (Figura 1). Ambos os tecidos podem ser expostos independentemente ao fluxo de fluido e também podem experimentar condições microaeróbicas para permitir a co-cultura com um microbioma complexo 25,26,27,28. Essa abordagem foi recentemente aproveitada para desenvolver um chip de vagina humano revestido por epitélio vaginal primário sensível a hormônios, interligado com fibroblastos estromais subjacentes, que sustenta uma baixa concentração fisiológica de oxigênio no lúmen epitelial e permite a co-cultura com microbiomas saudáveis e disbióticos por pelo menos 3 dias in vitro29. Foi demonstrado que o Vagina Chip pode ser usado para estudar a colonização por consórcios ideais (saudáveis) de L. crispatus e detectar inflamação e lesão causada por consórcios contendo G. vaginalis não ideais (não saudáveis). Aqui, descrevemos em detalhes os métodos usados para criar o chip da vagina humana, bem como para estabelecer comunidades bacterianas saudáveis e disbióticas no chip.

<table><tbody><tr><td>0,22 & micro; m Steriflip</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>SCGP00525</td><td>Para desgasificar meios</td></tr><tr><td>Chip de 2 canais</td><td>Emular</td><td>BRK-S1-WER-24</td><td>Parte do kit Chip de dois canais</td></tr><tr><td>200 & mu; Ponteiras de barreira em L (ou pontas de filtro)</td><td>Thomas Scientific, SHARP</td><td>1159M40</td><td>Dicas usadas para semeadura de cavacos</td></tr><tr><td>Reagente de Ativação 1 (ou pó ER-1)&nbsp;</td><td>Emular</td><td>Kit de Pesquisa Básica do Chip S1-24PK</td><td>Parte do kit Chip de dois canais; Temperatura de armazenamento -20 & deg; C&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente de Ativação 2 (ou solução ER-2) & nbsp;</td><td>Emular</td><td>Kit de Pesquisa Básica do Chip S1-24PK</td><td>Parte do kit Chip de dois canais; Temperatura de armazenamento 4 e graus; C</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>A2786</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Placas de ágar de sangue de Brucella</td><td>VWR International Inc.&nbsp;</td><td>89405-032</td><td>com hemin e vitamina K; Para a enumeração de Gardnerella vaginalis</td></tr><tr><td>DPBS livre Ca2+ e Mg2+ (DPBS (-/-)</td><td>ScienCell</td><td>303</td><td>Para lavagem de células</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>C5670</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (anído).&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>499609</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Colágeno I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Para a solução de revestimento para HVEC</td></tr><tr><td>Colágeno IV & nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>C7521</td><td>Para a solução de revestimento para HVEC</td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Para a dissociação das células dos Vagina Chips</td></tr><tr><td>Meio completo de fibroblastos &nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>2301</td><td>Mídia para a cultura da HUF</td></tr><tr><td>Meio epitélio vaginal completo</td><td>Linha de Vida</td><td>LL-0068</td><td>Mídia para a cultura do HVEC</td></tr><tr><td>D-glicose (dextrose)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>158968</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>DMEM (Glicose Baixa) & nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12320-032</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Módulo de Fluxo Dinâmico (ou Zo&euml;)</td><td>Emular</td><td>Zo&euml;-CM1</td><td>Regula a vazão dos caixos</td></tr><tr><td>Ham F12</td><td>Thermofisher</td><td>11765-054</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>FBS e FBS inativados pelo calor;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>10438018</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Fibroblastos uterinos humanos</td><td>ScienCell</td><td>7040</td><td>HUF</td></tr><tr><td>Células epiteliais vaginais humanas</td><td>Linha de Vida</td><td>FC-0083</td><td>HVEC</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>H0396</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>ITES</td><td>Lonza</td><td>17-839Z</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>M2393</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>M1880</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Placas de ágar MRS</td><td>VWR International Inc.&nbsp;</td><td>89407-214</td><td>Para enumeração de Lactobacillus</td></tr><tr><td>O-fosforiletanolamina</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>P0503</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Caneta/Estreptococo</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>15070063</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Tiras de pH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Para medição de pH&nbsp;</td></tr><tr><td>Pods (1/chip) e nbsp;</td><td>Emular</td><td>BRK-S1-WER-24</td><td>Parte do kit Chip de dois canais</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>ScienCell</td><td>403</td><td>Para a solução de revestimento para HUFs</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>P3911</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>P0662</td><td>Componente da HBSS (LB/+G)</td></tr><tr><td>Estéril 80% glicerol &nbsp;</td><td>MP Biomédicas & nbsp;</td><td>113055034</td><td>Para congelar amostras bacterianas</td></tr><tr><td>Triiodotironina</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>&nbsp; T6397</td><td>Componente do meio de diferenciação</td></tr><tr><td>Solução Trippan Blue (0,4%)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>T8154</td><td>Para contar células vivas/mortas</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>12605010</td><td>Para a dissociação das células dos Vagina Chips</td></tr><tr><td>Solução Neutralizante de Tripsina (TNS) & nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>113</td><td>Para neutralização da tripsina</td></tr><tr><td>Solutiom de Tripsina/EDTA (0,25%)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td>Para dissociação celular &nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-estradiol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich & nbsp;</td><td>E2257</td><td>Hormônio para meios de diferenciação</td></tr></tbody></table>

modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip

Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip

A saúde das mulheres, e particularmente as doenças do trato reprodutivo feminino (TRF), não receberam a atenção que merecem, embora um sistema reprodutivo insalubre possa levar a doenças com risco de vida, infertilidade ou resultados adversos durante a gravidez. Uma barreira no campo é que tem havido uma escassez de modelos experimentais pré-clínicos que imitam fielmente a fisiologia e a fisiopatologia do FRT. Os modelos in vitro e animais atuais não recapitulam totalmente as alterações hormonais, as condições microaeróbicas e as interações com o microbioma vaginal. O advento da tecnologia de cultura microfluídica Organ-on-a-Chip (Organ Chip) que pode imitar interfaces tecido-tecido, perfusão vascular, fluxos de fluido intersticial e o microambiente físico de uma subunidade importante de órgãos humanos pode potencialmente servir como uma solução para esse problema. Recentemente, foi desenvolvido um chip de vagina humana que suporta a co-cultura de consórcios microbianos vaginais humanos com epitélio vaginal humano primário que também tem interface com o estroma vaginal e experimenta fluxo dinâmico de fluido. Este chip replica as respostas fisiológicas da vagina humana a microbiomas saudáveis e disbióticos. Um protocolo detalhado para a criação de chips de vagina humana foi descrito neste artigo.

A vagina humana é revestida por um epitélio estratificado que se sobrepõe a um estroma colágeno rico em fibroblastos. Para modelar isso, uma interface de tecido foi criada pela cultura de epitélio vaginal humano primário e fibroblastos em lados opostos de uma membrana porosa comum dentro de um dispositivo Organ Chip microfluídico de dois canais. A formação do epitélio vaginal é monitorada por meio de imagens microscópicas de campo claro, que revelam a formação de uma folha contínua de células que forma progressivamente múltiplas camadas de células (Figura 2A). Relatórios anteriores confirmaram que essa morfologia se correlaciona com o desenvolvimento de um epitélio totalmente estratificado quando visto em seção transversal29. No entanto, se a camada epitelial parecer irregular e descontínua (Figura 2B), o Chip da Vagina pode não ser adequado para uso em experimentos.
A Figura 3 mostra uma representação esquemática da geração do Chip da Vagina. Para validar a funcionalidade do Chip da Vagina, os chips foram inoculados com L. crispatus e G. vaginalis para modelar ambientes vaginais saudáveis e disbióticos, respectivamente. G. vaginalis é a bactéria envolvida principalmente na vaginose bacteriana. Para verificar se bactérias saudáveis e disbióticas são enxertadas nos chips da vagina, a carga bacteriana foi quantificada nos chips da vagina inoculados com as diferentes populações bacterianas por efluentes do canal de plaqueamento e camadas de células digeridas em meios de crescimento bacteriano seletivos (ágar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) para L. crispatus e ágar sangue Brucella (BBA) para G. vaginalis) (ver Tabela de Materiais) e comparando-os com culturas semelhantes usando o inóculo original. Colônias de L. crispatus e G. vaginalis foram detectadas dentro de 48 h após o plaqueamento (Figura 2C), confirmando que bactérias saudáveis e disbióticas foram enxertadas nos chips da vagina. No entanto, se forem observadas colônias bacterianas nas placas que contêm os inóculos, mas não observadas nas placas que contêm o efluente ou digerem após a incubação necessária, pode-se concluir que a bactéria não enxertou.
Um ambiente vaginal saudável é ácido e a disbiose resulta em um aumento do pH vaginal31. Portanto, o pH do efluente do canal epitelial apical do Chip da Vagina também foi analisado. O pH dos chips vaginais inoculados com L. crispatus foi semelhante ao dos chips de controle não inoculados e, quando co-cultivados com G. vaginalis , eles experimentaram um aumento significativo do pH (Figura 2D). Se o pH de um chip de vagina não infectado for observado alto, isso indica que há um problema e esses chips não devem ser usados para experimentos.
O estado inflamatório do tecido vaginal também é sensível à composição do microbioma vaginal, com um microbioma disbiótico estimulando a inflamação. Após a análise das citocinas pró-inflamatórias no canal apical do chip da vagina 3 dias após a inoculação com L. crispatus ou G. vaginalis, a resposta pró-inflamatória foi igualmente maior com G. vaginalis em comparação com chips não infectados e chips inoculados com L. crispatus ( Figura 2E). Em conjunto, esses resultados mostram que o Chip da Vagina imita de perto o microambiente vaginal humano em estados saudáveis e disbióticos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig01.jpg"> Figura 1: Um chip de dois canais e seu pod. (A) Imagem de um chip PDMS de dois canais representando seus canais e portas. (B) Imagem de uma cápsula representando os reservatórios e portas para canais apicais e basais. (C) Diagrama esquemático mostrando a vista transversal de um chip de vagina infectado com micróbios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig02.jpg"> Figura 2: O chip da vagina imita microambientes vaginais humanos saudáveis e disbióticos. (A) Células epiteliais vaginais no canal apical de um chip de vagina robusto. A barra de escala representa 1 mm do chip na imagem superior e 500 μm na imagem inferior. (B) Células epiteliais vaginais no canal apical de um chip vaginal inadequado. A barra de escala representa 1 mm do chip na imagem superior e 500 μm na imagem inferior. (C) Enxerto de L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) no chip da vagina. (D) pH dos chips vaginais após 72 h de incubação com L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) em comparação com os chips vaginais não infectados (controle). (E) Resposta pró-inflamatória de chips de vagina a L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) após 72 h de incubação, em comparação com chips de vagina não infectados (controle). (CE) Os gráficos mostram ± SD médio para 4-6 chips; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 em comparação com os chips vaginais de controle; Cada (●) representa dados de 1 chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66486/66486fig03.jpg"> Figura 3: Representação esquemática do protocolo para a geração do Chip da Vagina. Representação esquemática das etapas envolvidas na semeadura de células e geração do Chip da Vagina. HVECs - Células epiteliais vaginais humanas; HUFs - Fibroblastos uterinos humanos; VEM - Meio epitelial vaginal; FM - Meios de fibroblastos; DM - Meio de diferenciação; PS - Penicilina estreptomicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66486/66486fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve um protocolo para a criação de um dispositivo de cultura microfluídica vagina-on-a-chip (Vagina Chip) que permite o estudo das interações do hospedeiro humano com um microbioma vaginal vivo sob condições microaerofílicas. Este chip pode ser usado como uma ferramenta para investigar doenças vaginais, bem como para desenvolver e testar possíveis contramedidas terapêuticas.

Modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy ...

Desenvolvemos com sucesso um chip de vagina humana que suporta a diferenciação espontânea do epitélio vaginal estratificado escamoso, forma uma forte barreira, responde a hormônios e gera um microbioma que suporta gradientes de oxigênio. As culturas 2D e organoides são atualmente usadas para estudar a disbiose vaginal, mas não são capazes de imitar as complexidades fisiológicas do microambiente vaginal devido à sua natureza estática. Os modelos animais também não podem modelar as mesmas alterações hormonais presentes no ciclo menstrual humano, e o microbioma vaginal entre espécies animais e humanos difere.Decidimos explorar se a tecnologia de chips de órgãos pode ser usada para desenvolver um modelo pré-clínico de interações do microbioma da vagina humana, que poderia ser usado para descoberta e avaliação de possíveis terapias baseadas em microbioma. O chip da vagina permite o fluxo dinâmico de fluido através do epitélio vaginal e do estroma, o que prolonga sua co-cultura com consórcios microbianos vaginais e mantém um microambiente fisiologicamente relevante. A vagina humana em um chip é uma ferramenta empolgante que pode ser usada para estudar várias doenças do trato reprodutivo feminino e validar novos bioterapêuticos.

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