Name: Modelos de feridas de camundongos e preparação de suspensões de células únicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 3 s
Description: Aprenda a construir modelos de feridas em camundongos e preparar suspensões de células únicas da pele murina. Este método permite estudar a cicatrização em nível celular com alta viabilidade.

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Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (#82373494)).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do sétimo Centro Médico do Hospital Geral do PLA Chinês, China. Foram utilizados camundongos C57/BL6 machos com 6 semanas de idade. 
1. Modelo de cicatrização de feridas de camundongo
<ol>
	<li>Agrupamento animal
	<ol>
		<li>Atribua aleatoriamente camundongos aos grupos experimental e controle (6 cada). Camundongos domésticos em uma instalação específica para animais livres de patógenos (SPF), com temperatura mantida em 23-25 °C, umidade em 50%-60% e um ciclo claro-escuro de 12 horas.</li>
		<li>Forneça aos ratos acesso irrestrito a alimentos padrão e água da torneira autoclavada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparo pré-operatório
	<ol>
		<li>Segure suavemente o mouse usando um limitador ou segurando-o firmemente em uma posição de bruços. Carregue a seringa com pentobarbital sódico a 1% restaurado à temperatura ambiente, administrado na dose de 0,1 mL / 20 g de peso corporal. 
		NOTA: A solução de pentobarbital sódico a 1% deve ser armazenada em ambiente escuro a 4 °C.</li>
		<li>Limpe o abdômen do rato com cotonetes com álcool. Insira a seringa ligeiramente inclinada no abdómen. Aspire antes da injeção para evitar a administração inadvertida na bexiga ou nos intestinos. Aguarde 10 min.</li>
		<li>Depois que o mouse parar de se contorcer e não responder mais aos estímulos, aplique vaselina branca em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Use um barbeador para aparar o pelo dorsal mais longo.</li>
		<li>Aplique o creme depilatório nas costas, aguarde 2 minutos e limpe suavemente com gaze úmida para evitar danificar a pele do camundongo. Certifique-se de que o creme depilatório não seja deixado por um longo período.</li>
		<li>Desinfete suavemente a pele ao redor com três cotonetes alternados de betadine e álcool 70%.</li>
		<li>Punção de biópsia de pele em autoclave, tesouras, pinças e outros instrumentos para esterilização. Mantenha um espaço de trabalho estéril. Realize a cirurgia subsequente em um pano cirúrgico novo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Excisão de pele de espessura total 
	NOTA: O modelo de tala de ferida foi usado para avaliar a eficácia do tratamento para a cicatrização de feridas.
	<ol>
		<li>Usando um marcador permanente, marque a área central superior da região dorsal do camundongo com um círculo de 8 mm de diâmetro.</li>
		<li>Levante a pele dorsal com uma pinça limpa e faça o primeiro corte com uma tesoura cirúrgica fina. Após o primeiro corte, segure a área da pele parcialmente removida usando uma pinça e corte cuidadosamente os círculos marcados.</li>
		<li>Use um anel de aço inoxidável projetado sob medida (diâmetro interno de 15 mm, diâmetro externo de 18 mm). Suturar o anel metálico na periferia do local da incisão com pontos inabsorvíveis 5-0, evitando a contração da pele do local da incisão (Figura 1A). Use aço inoxidável como material do anel para evitar ferrugem e deformação.</li>
		<li>Administre uma única injeção subcutânea de 0,1 mL de diluição de cloridrato de buprenorfina a 10% perto da ferida para tratar a dor pós-cirúrgica.</li>
		<li>Reintroduza o mouse para limpar gaiolas individuais. Coloque o mouse em uma posição de bruços. Não deixe o mouse sem vigilância antes que ele recupere a consciência.</li>
		<li>Observe e fotografe a ferida do camundongo a cada 2 dias para medir o tamanho da ferida após a anestesia, conforme descrito na etapa 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marcação de carimbo de ferida para obtenção de tecido de biópsia
	<ol>
		<li>Prepare-se para o experimento conforme descrito nas etapas 1.1 e 1.2.</li>
		<li>Crie carimbos personalizados de marcação de ferida de mouse com um diâmetro de círculo de 8 mm e um comprimento de lado quadrado de 10 mm (Figura 1B).</li>
		<li>Posicione o mouse em uma postura de bruços e desinfete a pele dorsal com cotonetes com álcool. Mergulhe o carimbo em tinta. Faça uma marca na parte superior central das costas do mouse com o carimbo.</li>
		<li>Extirpar cuidadosamente toda a camada de pele das costas ao longo da marca circular usando uma tesoura cirúrgica, expondo completamente a camada muscular. Deixe a ferida aberta sem curativo para evitar interferir no estado da ferida. Mantenha a esterilidade da ferida colocando o camundongo em um ambiente limpo e desinfetado e permitindo que a ferida forme naturalmente uma crosta.</li>
		<li>Administre uma única injeção subcutânea de 0,1 mL de diluição de cloridrato de buprenorfina a 10% perto da ferida para tratar a dor pós-cirúrgica.</li>
		<li>Reintroduza o mouse para limpar gaiolas individuais. Coloque o mouse em uma posição de bruços. Não deixe o mouse sem vigilância antes que ele recupere a consciência.</li>
		<li>Observe e fotografe a ferida do camundongo a cada 2 dias para medir o tamanho da ferida após a anestesia, conforme descrito na etapa 1.2.</li>
		<li>Realize a administração do tratamento conforme descrito em 1.4</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Administração de tratamento
	<ol>
		<li>Às 4 h após o rato recuperar a consciência, execute a anestesia conforme descrito nos passos 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Injete subcutaneamente o tratamento desejado, aqui 100 μg de exossomo derivado de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (hucMSC-Exo) dissolvido em 200 μL de PBS ao redor do local da incisão para o grupo de tratamento.</li>
		<li>Injete subcutaneamente 200 μL de PBS ao redor do local da incisão para o grupo controle.</li>
		<li>Repita as etapas 1.5.2 e 1.5.3 a cada dois dias por até 14 dias. Inspecione o local da injeção quanto a inchaço, vermelhidão ou sinais de infecção.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparação para sequenciamento de RNA de célula única
<ol>
	<li>Coleta e preparação de tecidos
	<ol>
		<li>Execute a anestesia conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Levante a pele dorsal usando uma pinça limpa e remova as crostas. Corte cerca de 2 cm2 de pele perto da ferida, aparando o tecido adiposo e os grandes vasos sanguíneos.</li>
		<li>Transfira a biópsia de pele com pinça estéril para um poço de uma placa de 6 poços preenchida com 4 mL de PBS pré-resfriados.</li>
		<li>Lave com PBS transferindo sequencialmente a biópsia para novos poços (placa de 6 poços) preenchidos com 4 mL de PBS até que nenhum sangue visível esteja presente.</li>
		<li>Corte a pele com um bisturi em pedaços de aproximadamente 2 mm, lavando posteriormente em DPBS contendo 0,04% de BSA e removendo quaisquer detritos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociação enzimática (<classe forte = "xfig" >Figura 2)
	<ol>
		<li>Combine 1 mL de colagenase I (10 mg / mL), 1 mL de colagenase IV (5 mg / mL), 1 mL de colagenase D + Dispase II (15 mg / mL), 1 mL de DNase I (5 mg / mL) e 6 mL de DPBS em um tubo cônico estéril para preparar a solução de digestão. Misture bem os componentes para garantir a homogeneidade.</li>
		<li>Colocar o tubo cónico num banho-maria regulado para 37 °C durante 10 min para pré-aquecer a solução de digestão.</li>
		<li>Adicione 2,5 mL de solução de digestão ao tecido e digerir a 37 ° C por 70 min, virando o tubo de ensaio a cada 10 min para uma mistura completa.</li>
		<li>Pré-umedeça um filtro de 70 μm com tampão de lavagem (0,2% BSA em PBS). Transfira a mistura de reação, incluindo células dissociadas e fragmentos de tecido residual, usando uma ponta de pipeta de 1 mL de diâmetro largo no filtro.</li>
		<li>Filtrar esta mistura através do filtro de células pré-humedecido de 70 μm para um tubo de centrifugação de 15 ml.</li>
		<li>Centrifugar a mistura de reacção com o tecido digerido a 300 x g, à temperatura ambiente, durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e guardar o sedimento (células) para a fase de dissociação seguinte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lise de glóbulos vermelhos
	<ol>
		<li>Diluir a solução de lise dos glóbulos vermelhos (10x) na proporção de 1:10 com água bidestilada Dilua as células com 1x solução de lise de glóbulos vermelhos na proporção de 1:10 em um tubo cônico.</li>
		<li>Vortex a mistura por 5 s, incubar em temperatura ambiente por 2 min e depois centrifugar a 300 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células em igual volume DPBS e armazená-las no gelo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>filtração
	<ol>
		<li>Recupere a suspensão celular e filtre-a através de um filtro de 40 μm para um novo tubo cônico.</li>
		<li>Enxágue o tubo 2x com 4.5 mL de RPMI (10% FCS) para garantir a coleta de quaisquer células restantes.</li>
		<li>Prossiga para centrifugar a suspensão da célula a 300 x g à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante, sacuda suavemente o pellet e ressuspenda as células com pontas de diâmetro largo em 50 μL de 0,04% BSA PBS. Mantenha as células no gelo durante todo esse processo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remoção de células mortas
	<ol>
		<li>Misture o tampão de estoque 20x do kit de remoção de células mortas com água livre de nuclease na proporção de 1:20 para obter um tampão de ligação de 1x.</li>
		<li>Centrifugue a amostra a 300 x g, remova o sobrenadante e adicione 10 μL de microesferas de remoção de células mortas para 60 mg de amostra de pele.</li>
		<li>Incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicione o tampão de estoque até atingir 500 μL. Carregue a amostra na coluna preparada no kit e conecte-a ao dissociador.</li>
		<li>Execute o programa dissociador para separar células vivas. Após o término do programa, filtrar a suspensão através de um filtro de 30 μm e diluí-la com igual volume D-PBS. 
		NOTA: Se a velocidade de gotejamento diminuir visivelmente, substitua imediatamente a coluna para evitar que as impurezas bloqueiem os poros e afetem a recuperação celular.</li>
		<li>Realize a coloração de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) e a contagem de células usando um contador de células automatizado. Use os seguintes critérios de aceitação: viabilidade celular ≥ 85%, taxa de agregação celular < 20% e ausência de glóbulos vermelhos ou fragmentos de células visíveis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedimento de dissociação para o kit de dissociação multitecido (alternativa)
	<ol>
		<li>Misture 2,5 mL de RPMI 1640, 100 μL de Enzima D, 50 μL de Enzima R e 12,5 μL de Enzima A1 em um tubo MACS C suave (componentes do Kit de Dissociação de Múltiplos Tecidos).</li>
		<li>Transfira o tecido para o tubo MACS C suave que contém a mistura enzimática e feche-o firmemente.</li>
		<li>Coloque o tubo a 37 °C em banho-maria por 90 min com inversão suave a cada 10 min para garantir a exposição adequada do tecido à solução de dissociação.</li>
		<li>Descarte a solução de dissociação e lave os tecidos com DPBS.</li>
		<li>Passar as suspensões unicelulares por filtros de células de 70 μm e 40 μm sequencialmente e centrifugar a 4 °C durante 10 min a 300 x g.</li>
		<li>Lise os glóbulos vermelhos usando o reagente de lise dos glóbulos vermelhos seguindo o mesmo procedimento da etapa 2.3.</li>
		<li>Remova as células mortas usando o kit de remoção de células mortas seguindo o mesmo procedimento da etapa 2.58.</li>
		<li>Realize a coloração AO/PI e a contagem de células usando um contador de células automatizado. Use os seguintes critérios de aceitação: viabilidade celular ≥ 85%, taxa de agregação celular < 20% e ausência de glóbulos vermelhos ou fragmentos de células visíveis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Protocol for Mouse Wound Healing Model with Stem Cell-Derived Exosomes

<ol><li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Wu, J., Landén, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+skin+wound+healing+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigation of skin wound healing using a mouse model.</a> Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265(2013).</li>
<li>Ganguli-Indra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cutaneous+wound+healing+assay+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model.</a> Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+differentiation+and+characterization+of+vascular+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).</li>
<li>Dead cell removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline">https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline</a> (2015).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+wound+closure+in+mice+using+skin-punch+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).</li>
<li>Gao, C., Zhang, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+two+single-cell+sequencing+platforms%3A+Bd+rhapsody+and+10x+genomics+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium.</a> Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Várias etapas cruciais foram essenciais para o sucesso do protocolo. Essas etapas incluíram a preparação precisa da área da ferida por meio de barbear e limpeza completos, criar feridas padronizadas de tamanho e profundidade específicos e cuidados diligentes pós-ferida para monitorar infecções e administrar tratamentos apropriados. A padronização desses procedimentos garantiu consistência entre as condições experimentais, aumentando assim a confiabilidade e a reprodutibilidade dos resultados10.
Empregamos marcação de carimbo de ferida para sequenciamento, pois outros métodos introduzem variáveis adicionais, como arranhão de ferida de camundongo e ruptura de sutura 2,5. O modelo de carimbo melhora a consistência inicial das feridas em camundongos e fornece uma referência padronizada para avaliar a cicatrização de feridas, reduzindo possíveis imprecisões na estimativa da taxa de cicatrização de feridas em modelos murinos. Além disso, a marca do selo facilita o uso de softwares como o ImageJ. No entanto, como um curativo não é usado para cobrir a ferida, o método de estampagem tem requisitos de desinfecção muito maiores para o ambiente. O experimento precisará ser repetido se ocorrer uma infecção.
A variabilidade biológica entre camundongos individuais pode introduzir variabilidade nos resultados experimentais, necessitando de tamanhos de amostra maiores para análises estatísticas robustas. Este modelo pode ser estendido a outras técnicas de sequenciamento, como sequenciamento espacial, para aumentar ainda mais sua utilidade.
A otimização das condições para a dissociação do scRNA-Seq e a seleção de métodos de dissociação apropriados são etapas críticas no fluxo de trabalho experimental. Atualmente, as metodologias comumente usadas incluem a digestão enzimática em conjunto com a abordagem recomendada baseada em reagentes genômicos10x 11. Notavelmente, a digestão enzimática é significativamente mais econômica do que o método baseado em reagente; no entanto, requer várias iterações pré-experimentais para otimizar a seleção enzimática e a duração da digestão.
Neste estudo, experimentos preliminares foram conduzidos usando várias combinações de enzimas. O método selecionado atendeu aos requisitos básicos para controle de qualidade downstream, apesar de não ter um kit de reagentes genômicos 10x projetado especificamente para dissociação de pele de espessura total de camundongos. Em vez disso, o kit de dissociação multi-tecido 1 foi usado para obter suspensões unicelulares de alta qualidade. No entanto, é importante observar o custo relativamente alto associado a este método, embora ofereça estabilidade superior em comparação com as técnicas internas de digestão enzimática. Para amostras valiosas, recomenda-se o uso do método de dissociação baseado em reagente genômico 10x.
É crucial considerar o impacto potencial da variabilidade interindividual na viabilidade celular, pois isso pode resultar em algumas amostras que não atendem aos critérios exigidos e, portanto, afetam a qualidade dos dados a jusante12.
Do lado positivo, esse método oferece oportunidades de integração com transcriptômica espacial ou outras abordagens multiômicas, oferecendo assim uma estrutura analítica mais abrangente13. Além disso, suas potenciais aplicações clínicas destacam sua versatilidade e relevância além dos contextos de pesquisa básica.

O camundongo é um modelo animal amplamente reconhecido em pesquisas por sua sequência genética altamente homóloga aos humanos, reprodução rápida, custo-benefício e tamanho gerenciável1. No entanto, existem diferenças na estrutura da pele entre camundongos e humanos. Os camundongos têm uma camada de membrana cutânea distinta que contribui para a contração da pele, desempenhando um papel crucial na cicatrização de feridas nesta espécie. Em contraste, a cicatrização de feridas humanas envolve principalmente a reepitelização e a formação de tecido de granulação1.
Apesar dessas diferenças interespécies na estrutura da pele, o modelo de camundongo continua sendo a escolha preferida na pesquisa de reparo de feridas e mantém importância significativa em comparação com outros modelos animais2,3. Ao usar a pele de camundongo para imitar os processos de cicatrização de feridas humanas, é essencial considerar cuidadosamente vários fatores de influência. Esses fatores incluem a seleção de locais apropriados para procedimentos cirúrgicos, a contabilização do ciclo do folículo piloso do camundongo e a compreensão dos efeitos da contração da membrana cutânea4,5. A implementação de medidas correspondentes é vital para otimizar as condições experimentais e melhorar a precisão dos resultados observacionais.
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) sequencia células em um nível muito mais refinado do que o sequenciamento de RNA convencional e tem um requisito muito maior de qualidade de amostra com diferenças intragrupo mínimas. Vários experimentos foram conduzidos para refinar um modelo estável de defeito cutâneo de espessura total aguda de camundongo. Esses experimentos utilizaram uma combinação de métodos estabelecidos da literatura e abordagens inovadoras para avaliar a cicatrização de feridas de forma abrangente2,5. Para desenvolver o modelo de cicatrização de feridas, a excisão de pele de espessura total de camundongos foi usada para replicar o processo fisiológico de reparo e regeneração de feridas. Seu objetivo foi avaliar as potenciais alterações induzidas por vários tratamentos usando scRNA-seq. A dissociação do tecido cutâneo de camundongos apresenta desafios, incluindo baixa viabilidade celular e altas taxas de agregação, durante a preparação de suspensões unicelulares6. Essas dificuldades podem resultar em problemas como entupimento de instrumentos e captura de células anômalas, o que pode comprometer a qualidade dos dados. Dado o custo considerável do sequenciamento de célula única, a realização de vários experimentos preliminares é crucial para garantir a estabilidade e a confiabilidade da suspensão de célula única. Este estudo avaliou a eficácia da dissociação enzimática mista e do método de dissociação do kit de tecidos para identificar a abordagem ideal para a dissociação tecidual6,7. Este estudo estabelece uma base sólida para investigações mais aprofundadas.

<table><tbody><tr><td>75% Alcolchol</td><td>Liuhe</td><td>JIUJING500ML</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57/BL6J</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D + Dispase II</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>5349907103</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Roche</td><td>5267439001</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Haishi</td><td>MIANQIAN</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>gentleMAC Dissociador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Fio de nylon médico</td><td>Jinlong</td><td>HM507</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociação de múltiplos tecidos 1</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-201</td><td></td></tr><tr><td>punch agulha de biópsia</td><td>Integra Miltex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Jinglu</td><td>JIANDAO</td><td></td></tr><tr><td>Petrolato branco</td><td>Shangyuan</td><td>BAIFANSHILIN</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de ferida em camundongos e preparação de suspensões de células Únicas

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

O manejo de lesões cutâneas agudas de espessura total apresenta um desafio considerável na prática clínica. A complexidade da cicatrização de feridas, envolvendo diversas populações de células e o intrincado microambiente da ferida, complica a avaliação dos efeitos do tratamento e suas interações usando abordagens experimentais tradicionais. A tecnologia de sequenciamento de transcriptoma de célula única revolucionou a compreensão das funções e mecanismos celulares durante a cicatrização de feridas. No entanto, a variabilidade nas metodologias para a criação de modelos de feridas em camundongos introduz fatores de confusão que podem impactar os resultados experimentais. Além disso, o processo de dissociação de tecidos da pele de camundongos apresenta obstáculos técnicos significativos, destacando a necessidade crítica de suspensões unicelulares de alta qualidade para sequenciamento preciso do transcriptoma. Portanto, este estudo visa otimizar a construção de modelos de feridas em camundongos para avaliar com precisão as mudanças no fechamento da ferida, eliminando variáveis que possam influenciar o resultado do sequenciamento subsequente. Além disso, a preparação de suspensões unicelulares foi realizada usando protocolos de preparação enzimática e protocolos de kit de teste para otimizar o custo e a eficácia.

Foram exploradas múltiplas variações do procedimento. Os protocolos de carimbo foram preferidos, pois apresentam interferência mínima no processo de cicatrização e mantêm a integridade da ferida frente a influências como arranhões e suturas. Isso evita introduzir ruído em nível de célula única para o sequenciamento subsequente. A colocação de feridas em ambos os lados de um camundongo resultou em diferenças notáveis na área da ferida devido à elasticidade inerente da pele do camundongo (Figura 3A,B). Perfurações bilaterais posicionaram as feridas mais próximas às bordas, uma região suscetível ao comportamento de autoarranhamento do camundongo. Camundongos com idade igual ou superior a 7 semanas foram considerados inadequados para o estudo, pois um subconjunto deles exibiu escurecimento irregular da pele dorsal por volta do 10º dia pós-cirurgia, indicando o início da regeneração capilar (Figura 4A). Isso introduziu uma variável adicional indesejada.
Quando anéis de borracha foram utilizados, independentemente de serem feitos de borracha macia ou dura, esses anéis tendiam a se soltar e frequentemente se deslocavam do local da ferida em aproximadamente 12 h devido aos movimentos frequentes dos camundongos e às propriedades adesivas limitadas dos anéis. Os anéis de borracha fixados com suturas tinham tendência a rasgar, exigindo suturas repetidas para estabilização. Esse procedimento iterativo de sutura, por sua vez, causava trauma adicional aos camundongos (Figura 4B,C). Em contraste, os anéis metálicos demonstraram estabilidade superior e melhores propriedades de retenção, permitindo a avaliação dos efeitos de reepitelização sem interferência da contração da ferida.
Considerando o potencial do suporte com anel metálico e sutura de causar danos cutâneos adicionais além da área da ferida e de aplicar tensões mecânicas não uniformes sobre a ferida, um carimbo padronizado de dimensões fixas foi empregado para facilitar as análises subsequentes.
A investigação revelou que o grupo tratado com o exemplo (hucMSC-Exo) apresentou um ritmo de cicatrização mais rápido em comparação com o grupo controle (Figura 5A). Embora a cicatrização completa tenha ocorrido mais rapidamente no modelo de carimbo do que no grupo com anel metálico suturado, que limita a contração da ferida, nenhuma diferença estatisticamente significativa nas taxas de cicatrização foi observada durante o período inicial de 7 dias (Figura 5B). Esses achados estão de acordo com pesquisas anteriores de Lin et al., sugerindo que os primeiros 10 dias da cicatrização cutânea em camundongos envolvem principalmente reepitelização, e não contração9.
Comparação da dissociação 
Após extensa otimização da composição enzimática, a combinação de Dispase II e colagenase demonstrou desempenho superior em comparação com o uso de uma única enzima (Tabela 1). Importante ressaltar que a presença de hemácias ou detritos celulares foi mínima, atendendo aos critérios essenciais para uso em máquina, que incluem viabilidade celular superior a 85% e taxa de agregação abaixo de 20%.
Em contraste, a abordagem com o kit de teste apresentou resultados promissores, com viabilidade celular relativamente maior e taxa mais baixa de agregação celular (Tabela 1). Além disso, não foram observados glóbulos vermelhos nem fragmentos celulares, indicando uma qualidade celular geral superior em comparação com outros métodos.
<img alt="Dispositivo cirúrgico na pele de animal; diagrama de incisão circular; ferida com medição em régua." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Modelo finalizado de ferida em camundongo. (A) Imagem representativa do anel metálico personalizado suturado. (B) Imagem representativa do carimbo dérmico e da ferida excisada. Diâmetro: 8 mm. Margem: 1 cm. (C) Taxa de fechamento da ferida. Barra de erro: erro padrão. Teste T bicaudal (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Processo de preparação celular: preparação da amostra, dissociação, lise de hemácias, remoção de células mortas, suspensões de células individuais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Esquema para a preparação de suspensões de células individuais. Os passos incluem coleta da amostra, dissociação, lise de glóbulos vermelhos, remoção de células mortas e obtenção de suspensão de células únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Experimento de cicatrização de feridas em ratos; imagens da linha do tempo, dia 1 e 6 após a operação; régua de medição." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Modelo de ferida em camundongo com feridas em cada lado. (A) É mostrada uma imagem representativa do modelo de ferida em camundongo com feridas em cada lado. Diâmetro de referência branco redondo: 8 mm. (B) Imagem representativa da cicatrização da ferida em diferentes momentos para feridas em cada lado. A pele nas costas do camundongo próxima à cauda cicatrizou mais rapidamente do que a região próxima ao pescoço. Borda do objeto de referência quadrado branco: 1 cm. Diâmetro do objeto de referência branco redondo: 8 mm. Abreviações: POD = Dias pós-operatórios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama do experimento de cicatrização de feridas com medição, do pós-operatório (POD) 1 ao POD 10, estudo de incisão na pele de rato." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4: Modelo de ferida em camundongo com feridas únicas. (A) Imagem representativa da cicatrização de feridas em diferentes estágios de crescimento do pelo em camundongos de 7 semanas de idade. Os camundongos apresentam diferentes estágios de crescimento do pelo no dia pós-operatório (POD) 10. A pele mais escura cicatrizou mais rapidamente. (B) Imagem representativa de anéis adesivos de borracha. Borda do objeto de referência quadrado branco: 1 cm. (C) Imagem representativa de linhas de sutura. Diâmetro do objeto de referência redondo branco: 8 mm. Abreviações: POD = Dias pós-operatórios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Taxa de fechamento da ferida ao longo do tempo; gráficos de barras experimentais comparando a eficácia do tratamento; análise estatística." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Taxa de fechamento da ferida. (A) Comparação entre os grupos controle e hucMSC-Exo. As barras de erro representam os erros padrão. Teste T bicaudal (n=6). (B) Comparação entre os grupos com carimbo e anel metálico. As barras de erro representam os erros padrão. A significância foi calculada utilizando o teste t bicaudal (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Taxa de Viabilidade Celular</td>
			<td>Taxa de Agregação Celular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abordagem interna</td>
			<td>86.90%</td>
			<td>18.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abordagem com kit de teste</td>
			<td>90.65%</td>
			<td>13.73%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Viabilidade e taxa de agregação das duas abordagens de preparação celular.

Este estudo apresenta duas técnicas experimentais cruciais: a construção de um modelo de ferida murina para avaliar o fechamento da ferida e a preparação de suspensões unicelulares de pele murina para preservar a viabilidade celular.

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