Name: Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a caracterizar moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio em células endoteliais usando um leitor de placas padrão. Este método reduz o tempo de ensaio e melhora a reprodutibilidade.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estudo de ligantes de receptores ativados por protease em células endoteliais

<table><tbody><tr><td>Reagentes de cultura celular</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Células EA.hy926 ATCC</td><td></td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular CellStripper</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>A tripsina pode ser usada opcionalmente, mas definitivamente deve ser evitada com ensaios PAR2.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com vermelho de fenol</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>Use para fazer uma solução aquosa a 0,4% (p/v) com água deionizada. Autoclave antes de usar para esterilizar.</td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4% p/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagentes de mobilização de cálcio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)</td><td>Thermo</td><td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Thermo</td><td></td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (livre de Ca/Mg/fenol-vermelho)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (Poloxamer 407)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>TCI America</td><td>P1975</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>VWR International</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH2 (sal TFA)</td><td></td><td></td><td>Preparado por Trudy Holyst no Versiti Blood Instituto de Pesquisa</td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços tratados com cultura, parede preta, placa de ensaio de fundo transparente</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>com tampas transparentes</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 15 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 50 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura, T-75</td><td>Corning</td><td>353136</td> Reservatório de reagente descartável <td>tratado para cultura de</td></tr><tr><td>tecidos, 50 mL</td><td>Corning</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas Enspire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Tubo</td></tr><tr><td>de microcentrífuga descontinuado, 1,5 mL</td><td>Avantor</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, 9"Fisher</td><td></td> <td>13-678-6B</td><td>deve ser esterilizada</td></tr><tr><td>tira de tubo de PCR com plano separado tiras de tampa</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta, 20 &micro; L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>pontas estéreis e filtradas</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta, 200 &micro; L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>pontas estéreis e filtradas</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta, 1250 &micro; L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>pontas estéreis e filtradas</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>volume 6 pipeta sorológica usada</td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 10 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 25 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

O objetivo deste ensaio é geralmente produzir curvas de concentração-resposta (CRCs) para três a quatro novas parmodulinas. Em cada placa de ensaio, é frequentemente gerado um CRC adicional para um composto conhecido, como NRD-21, que atua como uma verificação de qualidade para o experimento devido ao seu IC50 conhecido. Para gerar CRCs, um mapa de placas como o representado na Tabela 1 deve ser planejado. Se, em vez disso, forem desejadas respostas de concentração de ponto único, compostos em concentrações finais de 10 μM (ou outras concentrações preferidas) devem ser adicionados a pelo menos três poços.
Ao realizar o ensaio, deve haver um rápido aumento na fluorescência (o aumento deve começar nas primeiras 3-4 varreduras) exibido pelo leitor de placas (consulte a Figura 2A para obter um exemplo de saída em comparação com a saída com falha na Figura 2B). É importante observar que o agonista precisa ser adicionado rapidamente (dentro de 15 s) para que o leitor de placas seja capaz de capturar com precisão o aumento da fluorescência. Em um experimento de trabalho, o sinal de fluorescência para o poço do veículo deve permanecer plano, enquanto o sinal de fluorescência nos poços de controle positivo (veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) deve começar a aumentar após três ou quatro varreduras. Assim que o valor máximo for atingido (após ~ 10 varreduras), o sinal de fluorescência deve começar a diminuir lentamente. Em experimentos com antagonistas altamente eficazes, os poços com as maiores concentrações de antagonistas devem ter um sinal que permaneça relativamente plano, semelhante ao controle negativo. Também deve haver pouca diferença entre o sinal dos poços de controle positivo e aqueles com baixas concentrações do antagonista (Figura 2C). Se as concentrações mais baixas do antagonista ainda estiverem inibindo a mobilização de cálcio, as concentrações rastreadas devem ser ajustadas para incluir concentrações mais baixas. Os CRCs gerados devem ter pelo menos um ponto de dados ~ 100% para mostrar totalmente a natureza sigmoidal da curva.
O sinal mais comum de que um experimento não funcionou é se o poço de controle positivo (veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) não mostrar um grande aumento na fluorescência (Figura 2B). Isso pode acontecer por vários motivos: a contagem de células pode ser baixa (se a confluência não for confirmada), a solução agonista pode ser comprometida ou quantidades inadequadas de corante podem ter sido absorvidas pelas células. Também é possível erroneamente não adicionar agonista a certos poços.
Com um método programado, os dados são gerados como seis planilhas separadas, cada uma contendo dados para duas colunas. As cinco varreduras da fluorescência basal estão em sua própria linha, com as 20 varreduras feitas após a adição de agonista na linha imediatamente abaixo (consulte a Figura 3 para obter uma saída representativa). Para um exemplo de cálculo, será usada uma coluna de um experimento usando NRD-21. No arquivo exportado (Figura 3), a fluorescência basal de cada poço é enviada para as colunas C a G, e os dados após a adição do agonista (as 20 varreduras seguintes) são enviados para as colunas C a V na linha subsequente. As linhas 14 a 17 do arquivo contêm o controle positivo de duas colunas separadas. A média da linha basal para um dos poços de controle positivo foi calculada usando o comando "=MÉDIA(C16:G16)", que deu um valor de 1.039,8. Este comando foi repetido para as medições basais adicionais em cada poço. O máximo de varreduras experimentais foi calculado usando o comando "=MAX(C16:V16)", que deu um valor de 2,629. Novamente, o comando foi repetido para todos os poços. A fluorescência basal para cada poço foi então subtraída do valor máximo. Neste experimento, os dados foram normalizados subtraindo a mudança na fluorescência no controle negativo de cada poço (que foi de 142,6 na coluna de exemplo). Esses valores foram então divididos pelo valor calculado de forma semelhante do controle positivo. Nesta coluna, o valor máximo foi 2.629, a medida basal média foi 1.039,8 e o valor subtraído para o branco foi 142,6. O valor de controle positivo ajustado é, portanto, 1.446,6 (calculado a partir da equação). Essa equação é repetida para cada poço na coluna, e os valores calculados são divididos por 1.446,6 para fornecer sua mudança relativa na fluorescência. As razões foram então convertidas em porcentagens e copiadas para o software analítico. Esse processo foi repetido para as outras 11 colunas.
Para processar os dados usando o software referenciado, uma tabela XY deve ser selecionada com a opção de ter três medições repetidas em colunas lado a lado. Os valores -log de cada concentração devem ser inseridos nos valores de x e as porcentagens calculadas adicionadas aos valores de y. Uma análise de regressão não linear deve ser realizada nos dados, o que faz com que quatro curvas de concentração-resposta sejam produzidas. O programa também produz valores IC50 , estatísticas de erro quantificadas e estatísticas de qualidade de ajuste.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig01.jpg"> Figura 1: Fluo-4/AM carregado em células EA.hy926. Fluo-4 carregado seletivamente em células EA.hy926, após as etapas de incubação e lavagem do corante. Toda a fluorescência está dentro das células, sem vazamento de corante. Imagem obtida usando a configuração GTP em um gerador de imagens de célula EVOS e ampliação de 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig02.jpg"> Figura 2: Saída potencial do ensaio. (A) Saída representativa do leitor de placas de um ensaio de trabalho. A linha A é o controle negativo e não tem alteração na fluorescência. A linha B é o controle positivo e mostra um rápido aumento da fluorescência. As linhas CH são os poços experimentais, com as concentrações mais altas de parmodulina mais baixas na placa. (B) Exemplo de saída de um experimento fracassado. Não se observa aumento da fluorescência na linha B, que é o controlo positivo. (C) Mudança na fluorescência ao longo do tempo induzida pelo agonista PAR1 TFLLRN-NH2. A varredura de duas colunas de uma placa de 96 poços usando as configurações fornecidas leva ~5 min. no leitor de placas PerkinElmer EnSpire (ou seja, ~15 s entre as varreduras de cada poço). Diferentes soluções NRD-21 são indicadas, "Agonista" é 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig03.jpg"> Figura 3: Exemplo de saída do Excel para um ensaio de trabalho. A fluorescência basal é emitida em linhas pares a partir da linha 10, e o resultado das primeiras 10 varreduras após a adição do agonista é mostrado nas linhas ímpares subsequentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig04.jpg"> Figura 4: Manuseio robótico de líquidos vs "flicking". O pré-revestimento das placas de ensaio com gelatina e a realização manual de trocas de meios, sacudindo a placa e secando-a, produz curvas de concentração-resposta com menor variabilidade. (A) Curvas de concentração-resposta das parmodulinas ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manuseio automatizado de líquidos). (B) Curvas de concentração-resposta de parmodulinas ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (placas revestidas com gelatina). Os dados são meios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig05.jpg"> Figura 5: Estudos de temperatura. A realização do ensaio a 37 °C gera dados mais reprodutíveis do que à temperatura ambiente. A) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura ambiente). B) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Os dados são meios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig06.jpg"> Figura 6: Estudos de densidade celular. A densidade celular ideal é de 60.000 células/poço ao semear 16-24 h antes do início de um ensaio. (A) Curvas de concentração-resposta de TFLLRN-NH2 em diferentes densidades celulares, n = 3. (B) Curva de concentração-resposta de TFLLRN-NH2 na densidade celular ideal de 60.000 células/poço. Os dados são meios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig07.jpg"> Figura 7: Volume do ensaio. A utilização de um volume de ensaio de 100 μL gera curvas de concentração-resposta mais reprodutíveis do que os ensaios com um volume final de 200 μL. (A) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 200 μL). (B) Curvas de concentração-resposta de ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 100 μL). Os dados são meios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig08.jpg"> Figura 8: Geração de fatores Z' para determinar a capacidade do ensaio de detectar um composto hit. Respostas de mobilização de cálcio com 6,5 μM TFLLRN-NH2 (coluna B) mais antagonistas PAR1 opcionais 10 μM NRD-21 (coluna C) ou 0,316 μM vorapaxar (coluna D). (A) Ensaio concluído 16 h após a semeadura celular. (B) Ensaio concluído 24 h após a semeadura celular. (C) Tabela de fatores Z' calculados usando a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66507/66507eq01v5.jpg" style="margin: auto;">, onde σp é o desvio-padrão do controle positivo, σn é o desvio-padrão para o controle ou amostra negativo, μp é a média do controle positivo e μn é a média do controle negativo ou amostra. Cada valor é calculado designando veículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2 como controle positivo e comparando com a condição indicada como controle negativo (veículo) ou amostra (NRD-21 e vorapaxar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig09.jpg"> Figura 9: Mobilização de cálcio de um agonista PAR2. Mudança na fluorescência ao longo do tempo induzida por 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Os dados são meios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Exemplo de mapa de placas de 96 poços para triagem de compostos. Cada concentração é medida em triplicata. A linha A contém controles negativos (sem antagonista; sem agonista) e a linha B contém controles positivos (sem antagonista; agonista). As colunas 1 a 3 contêm seis concentrações de meio log da parmodulina NRD-21 que podem ser usadas opcionalmente para controle de qualidade. PM-A, PM-B, PM-C são parmodulinas sem nome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Comparação do protocolo publicado anteriormente e do novo protocolo otimizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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