Name: Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Aprenda a gerar organoides derivados de pacientes com melanoma para estudar interações imunológicas e respostas terapêuticas. Este método replica o microambiente tumoral e apoia o desenvolvimento de tratamentos personalizados em oncologia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Organoides de melanoma derivados de pacientes: uma fronteira na imunoterapia contra o câncer

<ol><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Lines+Are+Useful+Model+Systems+for+Medical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).</li>
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<li>Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q., Zheng, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+is+a+promising+molecular+target+in+the+diagnosis+of+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review).</a> Mol Med Rep. 11 (3), 1566-1572 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Li, H. Y., Ren, K., Wang, C., Bu, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+organoid+research+progress+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Dermatology+and+Venereology%22%5BJournal%5D)">Skin organoid research progress and potential applications.</a> International Journal of Dermatology and Venereology. 5 (2), 101-106 (2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Frasco Cênico de Polipropileno com Rosca Interna de 2 mL com Tampa Vermelha</td><td>Corning</td><td>431420</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Cônico de Polipropileno</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-tratado com Placa de Cultura de Células</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>105 mm Poliestireno Fórceps Estéril</td><td>Caplugs Evergreen&nbsp;</td><td>222-1121-B1I</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Frasco de Cultura de Células</td><td>Corning</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (1x) Meio de Soro Reduzido (1:1)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Perforina Anti-humana</td> <td>Violeta Brilhante 510BioLegend</td><td>308120</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-humano Ki-67 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>350522</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-humano CD366 (Tim-3) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>345028</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 anti-humano CD45</td><td>BioLegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de Cultura de Células 0.4 &micro; m, 30 mm de diâmetro</td><td>Millipore Sigma</td><td>PIHP03050</td><td></td></tr><tr><td>Cell Staining Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m Nylon</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo IV, pó</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Rat Collagen I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura, PS, 48 poços, TC tratado com tampa, estéril</td><td>Max Scientific&nbsp;</td><td>07-6048</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - glicose alta 4,5 mg/mL</td><td>Corning</td><td>MT10-0130CV</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I - Grau II</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, FBS</td><td>Corning</td><td>MT35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anexina V Kit de Detecção de Apoptose I</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>556547</tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico Seletivo Geneticina (Sulfato G418) (50 mg/mL)</td><td>Suplemento ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Nutrientes F12 do Presunto</td><td>ThermoFisher</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN célula</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fenol Livre & Fato de crescimento. Filtro</td> de seringa <td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Millex PVDF reduzido, 0,22 &mu; M</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nunc TripleFlask Frasco de Cultura de Células Tratadas</td><td>ThermoFisher</td><td>132867</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cyanine5 anticorpo CD8a anti-humano</td><td>BioLegend</td><td>301010</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Mouse anti-humano CD279 (PD-1)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>561272</tr><tr><td>Caneta Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-ácido</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) (7.5%)</td><td>Quality Biological&nbsp;</td><td>118-085-721</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Cirúrgicas de Aço Inoxidável nº 22</td><td>Integra</td><td>4-322</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr></tbody></table>

revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

A forma e o tamanho dos MPDOs foram monitorados ao longo do tempo para estudar sua dinâmica de crescimento. Como visto na Figura 2, durante o período inicial de crescimento, o tamanho do organoide aumentou substancialmente ao longo dos 7 dias representados. Após a observação da dinâmica de crescimento do MPDO, a atenção voltou-se para a avaliação da composição das células imunes para verificar a recapitulação fiel dos organoides aos tumores originais. Essa avaliação, com foco principalmente na abundância de células T αβ, forneceu informações sobre a semelhança entre os organoides e o tumor parental. Como visto, a Figura 3 ilustra que não houve distinção estatisticamente significativa na proporção de células T αβ entre os tumores parentais e os respectivos organoides cultivados em Matrigel ou colágeno. Tendo mostrado semelhanças entre tumores parentais e organoides, em seguida, avaliamos a atividade das células T usando citometria de fluxo. A estratégia de gating pode ser encontrada na Figura 4, que foi obtida definindo leucócitos vivos únicos seguidos de gating nas populações de células T CD3+ e CD8+ para examinar marcadores comuns de ativação de células T.
Dado o papel das células T citotóxicas na geração de citocinas e na liberação de moléculas citotóxicas, como granzima B e perforina, sua expressão foi medida. A expressão de granzima B e perforina foi detectada em 35,1% e 2,17%, respectivamente17. A expressão da imunoglobina de células T e do domínio 3 da mucina (Tim3) em 1,83% das células T CD8+ alinha-se com a característica do TME imunossupressor18. A expressão do receptor de morte programada (PD-1) em 49,5% da população CD8+ dentro dos MPDOs enfatiza ainda mais a natureza imunossupressora do microambiente do organoide. Por fim, a expressão de Kiel 67 (Ki67), um marcador de proliferação, também foi avaliada em células T CD8+ em 26,8%19
Os MPDOs também podem ser usados para avaliar a capacidade de matar as células T γδ. Vários MPDOs de 10 dias de idade foram tratados com células T γδ. Após 24 h de incubação, os MPDOs foram coletados e desassociados em uma suspensão unicelular e ressuspensos em 100 μL de tampão de ligação contendo 5 μL de AV-FITC e 5 μL de PI. Após incubação por 15 min no escuro à temperatura ambiente, a citometria de fluxo foi realizada para determinar a citotoxicidade induzida por células T γδ nas células dos MPDOs. Como visto na Figura 5 A,B, após o tratamento com células T γδ, mais células nos MPDOs apresentaram características de apoptose (80,5%). Isso é em comparação com o experimento de controle, onde apenas uma minoria de células mostrou características de apoptose (19,2%).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig01.jpg"> Figura 1: Esquema ilustrando a cultura dos MPDOs. O tecido de melanoma fresco excisado é decomposto mecanicamente e enzimaticamente para produzir uma suspensão unicelular. Esta suspensão é então cultivada em poços revestidos com Matrigel ou gel de colágeno para formar organoides. Abreviatura: MPDO = organoide derivado de paciente melanoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig02.jpg"> Figura 2: Imagens de microscopia confocal de MPDOs incrustadas em Matrigel nos dias 2 e 7. A suspensão unicelular de tecido fresco de melanoma é cultivada no Matrigel. As imagens foram tiradas usando um microscópio confocal no dia 2 e no dia 7. O tamanho dos organoides está aumentando gradualmente. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: MPDO = organoide derivado de paciente melanoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig03.jpg"> Figura 3: Análise de citometria de fluxo comparando a composição de células T αβ em tumor parental versus organoides cultivados em gel de colágeno ou Matrigel. A quantificação de células imunes em MPDOs foi realizada usando FACS. Comparação de células T αβ em tumores parentais, MPDOs cultivados em gel de colágeno ou Matrigel após 7 dias. n = 8; ns = sem significância (teste múltiplo não paramétrico). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig04.jpg"> Figura 4: Estratégia e análise de citometria de fluxo usada para caracterizar células imunes no dia 10 MPDOs cultivados em Matrigel. Estratégia de bloqueio para discernir subconjuntos de células imunes, seguida de quantificação e perfil dos vários marcadores expressos nos organoides. Abreviaturas: MPDO = organoide derivado de paciente melanoma; FSC-A = altura do pico de dispersão frontal; FSC-H = altura do pico de dispersão para frente; SSC-A = área do pico de dispersão lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig05.jpg"> Figura 5: O tratamento com células T γδ induz a morte celular em MPDOs. Os MPDOs foram incubados com células T γδ por 24 h, depois os MPDOs foram coletados e dissociados em uma suspensão unicelular. (A) Coloração com anexina V e PI de organoides cultivados em Matrigel após tratamento com células T γδ. A mudança para necrose após o tratamento com células T γδ é evidente. (B) Quantificação de células apoptóticas em MPDOs após tratamento com células T γδ. n = 5 *p &lt; 0,05; **p &lt; 0,01 (teste múltiplo não paramétrico). Abreviaturas: MPDO = organoide derivado de paciente melanoma; PI = iodeto de propídio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Composição de todos os meios e reagentes utilizados neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509_Table%201%20(2).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste vídeo, células de melanoma derivadas de humanos são implantadas por via subcutânea na região do flanco de um camundongo imunocomprometido. O modelo PDX permite a investigação pré-clínica de células de melanoma que melhor recapitulam a heterogeneidade tumoral e a agressividade do melanoma observadas em condições in vivo.

Modelagem de Xenoenxerto Derivado de Paciente: Uma Técnica para Gerar Modelos de Camundongos de Melanoma

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.

Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.

Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma

Apresentamos um protocolo que pode ser usado para realizar testes terapêuticos com organoides de câncer de ovário derivados de pacientes.

Modelos organoides derivados de pacientes com câncer de ovário para testes pré-clínicos de drogas

Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.

Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.

Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas

Organoides gerados a partir de tumores de pacientes são injetados ortotopicamente no fígado de camundongos. A ressecção do tecido hepático não tumoral leva a um ambiente regenerativo no tecido hepático onde o tumor está localizado.

Um modelo de xenoenxerto organoide derivado de paciente com câncer hepatocelular para investigar o impacto da regeneração hepática no crescimento do tumor

Aprenda a gerar organoides derivados de pacientes com melanoma para estudar interações imunológicas e respostas terapêuticas. Este método replica o microambiente tumoral e apoia o desenvolvimento de tratamentos personalizados em oncologia.

Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

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